Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

Biomarkører i en dyremodel for at afsløre Neurale, hæmatologisk, og adfærdsmæssige korrelater til PTSD

Published: October 10, 2012 doi: 10.3791/3361
Automatic Translation
1, 2, 1, 1, 1, 2, 1, 1, 2, 1
1Department of Psychiatry, Center for the Study of Traumatic Stress, Uniformed Services University of the Health Sciences, Bethesda, Maryland, 2Department of Gene and Protein Biomarkers, GenProMarkers, Inc.

Summary

Vi beskriver en rotte model af post traumatisk stress disorder (PTSD), som afslører de vedvarende ændringer i neuroendokrine funktion og den forsinkede lang sigt, overdreven frygt respons, der er karakteristiske for PTSD patienter. Dyremodellen og fremgangsmåder beskrevet her kan anvendes til korrelering af biomarkører i hjernekerner, som er mekanistisk, men ikke kan måles i patienter med biomarkører i perifere hvide blodlegemer, som kan.

Abstract

Identifikation af biomarkører, der repræsenterer udviklingen i patofysiologien af ​​Post Traumatisk Stress Disorder (PTSD) er af afgørende betydning, ikke kun for objektiv diagnose, men også til evaluering af terapeutisk effekt og modstandskraft over for traumer. Igangværende forskning rettet mod at identificere molekylære biomarkører for PTSD, herunder traumatisk stress inducerede proteiner, transcriptomes, genomiske afvigelser og genetiske modulatorer, ved hjælp af biologiske prøver fra forsøgspersonernes blod, spyt, urin og postmortem hjernevæv. Men sammenhængen af ​​disse biomarkør molekyler i perifere eller obduktion prøver til ændrede hjernefunktioner, der er forbundet med psykiatriske symptomer hos PTSD er fortsat uløst. Her præsenteres en dyremodel for PTSD, hvor både perifert blod og centrale hjerne biomarkører, såvel som adfærdsmæssige fænotype, kan opsamles og måles, hvorved der tilvejebringes den nødvendige korrelation af de centrale biomarkører for PTSD, som er mekanistisk og pathognomoniske, men kan ikke indsamles fra folk, med de perifere biomarkører og adfærdsmæssige fænotyper, der kan.

Vores dyremodel af PTSD beskæftiger tilbageholdenhed og hale chok gentages i tre sammenhængende dage - den uundgåelige hale-shock model (ITS) i rotter. Dette ITS model efterligner patofysiologien af PTSD 17, 7, 4, 10. Vi og andre har bekræftet, at ITS model inducerer adfærdsmæssige og neurobiologiske forandringer svarende til dem, der findes i PTSD fag 17, 7, 10, 9. Specifikt er disse stressede rotter udviser (1) en forsinket og overdrevne startle response vises flere dage efter stressor ophør, hvilket grund af den komprimerede tidsskala af rottens levetid i forhold til et mennesker, svarer til 1-3 måneders forsinkelse af symptomer på PTSD patienter (DSM-IV-TR PTSD kriterium for D / E 13), (2) forøget plasma corticosteron (CORT) i flere dage, hvilket indikerer kompromittering af de hypothalamopituitary aksen (HPA), og (3) retarderet body vægtstigning efter stressor ophør, hvilket indikerer dysfunktion af metabolisk regulering.

De eksperimentelle paradigmer anvendes til denne model, er: (1) en indlært hjælpeløshed paradigme i rotten analyseret ved måling af akustisk respons på lyd (ASR) og en kortlægning af kropsmasse, (2) mikrodissektion af rottehjerne i regioner og kerner; ( 3) enzymbundet immunsorbentassay (ELISA) for blodniveauer af CORT, (4) en genekspression microarray plus tilhørende bioinformatik værktøjer 18. Denne microarray, døbt rMNChip, fokuserer på mitokondrie og mitokondrier-relateret nukleare gener i rotten, så de direkte fat på de neuronale bioenergetik hypotese at være involveret i PTSD.

Protocol

1. Animal Behavioral Model af PTSD

  1. Fag: Male albino Sprague Dawley-rotter (Taconic Farms, Derwood, MD) anvendes, vægt 150-200 g på tidspunktet for indgivelse af stress-protokol.
  2. Måling af mad, vand indtag og tilvækst: Ved ankomsten i laboratorierotter vejer 100 ± 25 g er opstaldet to til et bur (bur størrelse: 45x24x20 cm). Bur polstring substrat (træflis) er ændret to gange ugentligt. Dyrene holdes på en revers 12-timers lys-cyklus (lys tændt: 1800/0600 og off: 0600-1800) i en temperatur (22 ± 4 ° C) - og relativ fugtighed (30-70%)-kontrolleret miljø en uge før forsøg. Vand og standard pelleteret foder (Harlan (2018) 18% protein gnaverkost, Global kost, Harlan Teklad) er frit tilgængelige i hjemmet bure, og kropsvægt registreres dagligt 3 dage før, 3 dage under og 3 dage efter ophør af stress .
  3. Akklimatisering: Rotter akklimatiseret i tre dage til Both dyret anlæg og en akustisk forskrækkelse kammer. At akklimatisere dem til den akustiske startle kammeret, er der håndteres i den i 5 min hver dag i tre på hinanden følgende dage forud for den første måling.
  4. Understregede protokol: Dyrene ligeligt tildelt til hver gruppe på grundlag af deres kropsvægt og baseline startle response. Test udføres på to grupper af dyr, hver gruppe bestod af 16 dyr. Gruppe 1 modtager stress-protokol, og gruppe 2 er kontrol.
    Stress eksponering protokol er en kontinuerlig 2-hr procedure, hvor hver session består af tilbageholdenhed ("uundgåelig") og hale-stød, gentages en gang om dagen i løbet af 3 dage i træk. Understreger sker om morgenen (inden for vinduet i 0800 og 1200). Dyrene fastholdes ved at blive immobiliseret i en ventileret plexiglas rør. Fyrre elektriske stød (2 mA, 3 sek varighed; Animal Test Cage Grid Floor Shocker, Coulbourn Instruments, USA) leveres til deres haler på semi-tilfældige intervaller på 150 to 210 sek (Graphic State Notation software, Habitest Universal Link, Coulbourn Instruments, USA). Stimulering ved 2 mA blev valgt, fordi det er aversive, men ikke smertefuld, når den stimulerende effekt er placeret på tværs af eksperimentatoren finger. Elektrodegel påføres ved anvendelse af Q-tip til dannelse af et tyndt lag af ledende gel mellem elektroden og huden på rottens hale. Elektrodeoverfladerne clips er tilpasset og forbundet til halen for at sikre en god forbindelse uden at påvirke blodcirkulationen af ​​halen.
  5. Acoustic Startle Response (ASR): Akustisk startle reaktion måling blev gennemført med en forskrækkelsesrespons Acoustic Test System (Coulbourn Instruments, Columbus, Ohio, USA) 3. Dette system består af vægtfølsomme platforme i en lyd-dæmpet kammer. Transduceren, som er en strain gauge, i hver af de startle platforme kræver kalibrering før brug. Første skal kobleren være i DC koblede tilstand til kalibrering. I denne tilstand, kobleren output direkte følger input fra platformen, den tilstand kræves for kalibrering med statiske vægte. Transduceren skifter til AC-koblet tilstand ved forsøg, således at kun hurtige ændringer i kraft, hvilket indikerer startle response, udsendes. Dyrenes bevægelser i respons på lydstimuli måles således som en spændingsændring ved en strain gauge i hver platform og registreres som den maksimale reaktion forekommer inden for 200 ms for indtræden af ​​den startle-fremkalder stimulus.
    Der er seks typer af stimuli forsøg: 100 dB alene 100 dB med præ-puls, 110 dB alene 110 dB med præ-puls, præ-puls alene og ingen stimulus kontrol. Hver prøve type blev præsenteret otte gange. Prøve typer er præsenteret i tilfældig rækkefølge at undgå ordens virkninger og tilvænning. Inter-trial intervaller spænder tilfældigt fra 15 til 25 sek. Blandt de otte forsøg kun de maksimale værdier samles i resultaterne og til slut justeret med dyrets legemsvægt af samme dag. Dyrene testes en dag bør stress eller anden behandling som baseline læsning og 1, 7, 14 og 21 dage efter den sidste dag i de efterfølgende 3 dage af stress procedure eller anden behandling.
  6. Dataanalyse:
    1. ASR: Amplituden af ​​akustiske startle response testet hver gang er repræsenteret som "% af baseline", som beregnes ved hjælp af ligningen:% af baseline = (absolut amplitude / baseline absolut amplitude) × 100%. For hver test dag, ANOVA'er for gentagne målinger udført på startle amplituder med faktorer af stress status og lægemiddeldosering hjælp SPSS (Version 16) software. Tukey, Bonferroni, eller Dunnett test bruges til at vurdere betydelige post-hoc forskelle mellem de enkelte grupper. Dataene er vist som gennemsnit ± SEM
    2. Vækst: Kropsvægt og føde-og vandforbrug måles på dag -1 foregående stress og på dag 14, 21 og 30 efter afslutning af det stress-protokollen. Statistisk analyse: Mad og vand indtaget data underkastes en-måde gentagne-foranstaltninger variansanalyse (ANOVA). At analysere ændringer i fødevareindtag hastighed over tiden, er mængden af ​​fødeindtagelse yderligere divideret med legemsvægten af ​​det individ, der minimerer variansen i kropsvægt induceret af stress-protokol og oprindelige forskel i kropsvægt mellem grupperne. Alle procedurer udføres i henhold til godkendelse i overensstemmelse med den institutionelle Animal Care og Use Committee (IACUC).

2. Brain Dissection

  1. Instrumenter & Materials:
    1. Anæstesi jar ". Condiment jar" Dette er en glaskrukke med låg, der måler omkring 6 inches høje og 5 inches i diameter, såsom et "Apothecary jar", "vat krukke", eller
    2. Guillotine for rotter, såsom leveret af Kent Scientific.
    3. Vibratome 1000:
      1. Skær barberblad i halve på langs, vaske olie af med alkohol, skal du indsætte i klemme.
      2. Fyld bad med almindelig knust is.
      3. Placebakken længderetningen.
      4. Tør bakken af ​​fugt, før du placerer en dråbe cyanoacrylat.
    4. Rongeurs (eksempler herpå er en Micro Friedman rongeur fra Miltex, kat. No. 17-4801 eller en Pearson rongeur fra Fine Science Tools kat. Nr. 16015-17).
    5. # 3 eller # 5 juvelerer pincet (skarp til at trække ud dura).
    6. Små saks med skarpe punkter (Vantage V95-304 er et eksempel).
    7. (2) Flade rustfrit stål mini spatler, såsom anvendt til at overføre pulverformige kemikalier til en balance skala. Den brede ende er bøjet fremad for at passe mellem telencephalon og calvarium.
    8. Ske til at overføre hjernen blok. (En plastik suppe skeen fra cafeteriaet virker fint.)
    9. Skalpel # 10.
    10. Dobbelt kant barberblad (kulstofstål):
      1. Den ene halvdel af Vibratome.
      2. Halvdelen for dissektion.
    11. To glaspetriskåle, ~ 3,5 inches og 4 inches i diameter, således at en passer indeni den anden. Knust is i bottom fad. To Filtrerpapirerne i den øverste skål. Flyt skive til ønskede positioner ved at bevæge filtrerpapir.
    12. 100 ml bægerglas.
    13. Eye dropper at overrisle hjerne med is kølet en CSF. (Glass Pasteur-pipette med smal ende indsat i 1/2 inch brede latexgummi pære fungerer godt.)
    14. Knust is bakke: Ca. 5 inches høj, 20 inches lang, 10 inches lang. Indeholder:
      1. Stick alle instrumenter i knust is.
      2. Lav calcium / højt magnesium aCSF i plastflaske, der kan slået at knuse isen.
      3. Cyanoacrylat.
    15. Lavt calcium / højt magnesium kunstig cerebrospinalvæske (aCSF):
      1. I mM: 125 NaCl, 2,5 KCI, 0,5 CaCl2 * 2H 2 O, 2,0 MgCl2 * 6H 2 0, 1,2 NaH 2 PO4 * H2O, 25 NaHCO, 11 glucose.
      2. I plastflaske, der kan slået at knuse isen.
      3. Chill i 20 minutter i -80 ° C fryseren for at gøre det til en slush.
    16. Vatpinde.
    17. Filtrerpapir: Whatman 42,5 mm (Cat nr. 1001 042.).
    18. Mini centrifugerør at indsamle mindre sektioner af væv.
    19. Wells plade til at indsamle større strukturer og profiler af væv.
    20. Køkkenrulle.
    21. Rød biologisk pose.
  2. Anæstesi:
    1. Anesthesia jar, gazetamponer, isofluran, metal pincet, er placeret i et stinkskab.
    2. Rotte anbringes i anæstesi krukke.
    3. Fugt gaze med isofluran og plads i anæstesi krukke.
    4. Vent pedal refleks - tilbagetrækning af poten, når banen er klemt med pincet - eller hornhinde refleks forsvinder.
    5. Halshugge: Grasping rotte med den ene hånd omkring brystkassen bagfra, halshugge rotte med guillotine så tæt til nakkeknude som muligt. Atlasset vil stadig normalt forbliver fastgjort til kraniet.
    6. Blood Collection: Squeeze rotte på brystkasse for at forhindre blodet i at sprøjter fra carotidarterier.Gradvist slappe greb for at styre strømmen af ​​blod ind i samlebeholderen.
  3. Fjernelse af Brain:
    1. Hurtigt skæres muskel og eventuelt resterende hvirvlerne væk fra basiocciput med den lille saks.
    2. Brug rongeur og begynder ved foramen magnum, skrælle occipital kondyler og basiocciput.
    3. Midterlinjen hovedbund incision med skalpel.
    4. Ved hjælp af saks, klippe en mid sagittal indsnit i occipital og parietale knogler. Fatte snittet margen af ​​kraniet med rongeurs, bryde det tilbage ligesom en æggeskal væk fra midterlinjen være omhyggelig med at minimere enhver kontakt med hjernen. Midterlinjen snit og pause tilbage kan gøres i etaper.
    5. Da hjernen yderligere er udsat for, er det vigtigt at slukke det med is afkølet aCSF at bevare integriteten og vitalitet af vævet.
    6. Tilsvarende bryde væk tidsmæssige og frontale knogler.
    7. Med fine pincet, rive dura, og sørg for at få dententorum cerebelli.
    8. Med mini spatel indsættes under frontallappen hæve hjernen fra calvarium lige nok til at sætte spænding på kranienerver.
    9. Transekt de hjernenerver med saksen.
    10. Løft hjernen helt fra kraniet, og lad falde i bægerglasset af iced lavt calcium / højt magnesium aCSF. Efterlad et minut eller mere at køle, så væv vil være fast, vil de strukturer tydeligt synlige, og sundhedstilstanden hos det væv bevares.
    11. Med plastikske, overfører hjernen på filtrerpapiret i isen kølet petriskålen ventrale side op.
  4. Dissektion af hjernen:
    1. Foretage en koronal transektion med barberblad med den midterste cerebrale arterie (figur 2A).
    2. Gem pandelap midlertidigt i is kølet lavt calcium / højt magnesium aCSF i 100 ml bægerglas.
    3. Flip hjernen, så den dorsale overflade er op. Transektere hjernestammen ved forbindelsen af ​​midbrain ennd diencaphalon. Den resulterende hjerne blok ses i figur 2B.
    4. Drop den blokerede cerebrum tilbage i isafkølet lavt calcium / højt magnesium aCSF.
    5. Ved hjælp af mini spatler, cerebellum dissekere fra medulla / pons. Gem i medier egnede til den tilsigtede analyse.
    6. Returnér den blokerede cerebrum til petriskålen. Ved hjælp af to filter papirer, hjernen løfte ved at placere en filtrerpapir på ventrum. Med det, placere den posteriore koronale plan blokerede cerebrum på kanten af ​​den anden filtrerpapir. Med denne filtrerpapir sted den forreste snit plan blokerede cerebrum på en dråbe cyanoacrylat på Vibratome skæreplade, cortex vender bladet.
    7. Med Vibratome, off skåret lige nok af den caudale hjernen, således at hippcampus viser (figur 2C).
    8. Tag en sektion, 2.400 μ tyk i en 125 g rotte på 2.700 μ tyk i 200 g rotte. Overfør sektion med en vatpind på filteret papirer om petriskålen(Fig. 2D).
    9. Klip og gem cingulate cortex med barberblad.
    10. Med en dental spatel, skub i den distale kant af hjernebjælken at skære det, så skrælle isocortex.
    11. Fra sin ventolateral margen. Skrælle hippocampus (Figur 2E)
    12. Gem midthjernen.
    13. Tag en anden sektion, 2.400 um tyk i 120 g rotte, 2.500 um tyk i 200 g rotte. Placér afsnittet om filter-papirer om petriskålen (figur 2F). Alternativt kunne fem 500 um snit tages på dette tidspunkt for elektrofysiologi.
    14. Klip og gem cingulate cortex med barberblad.
    15. Gøre laterale udskæringer med barberblad på den indre kapsel for at fjerne isocortex (figur 2F).
    16. Foretage skrå snit med barberblad at fjerne amygdali (fig. 2F, G).
    17. Foretage en kasse skåret med barberblad for at fjerne hypothalamus. Den lateralenedskæringer er lateralt i forhold til ventromedial kerne i hypothalamus, som er synlig. Vi gør den dorsale skåret lige over den tredje ventrikel eller ventrale tegmentale område (figur 2H).
    18. Skubbe spatel ind i corpus callosum og trække sig væk den lille stykke isocortex fastgjort til hippocampus. Placer den smalle ende af spatlen ventrale til den hippocampale commissure og hæve dorsalt til at trække ud hippocampus.
  5. Konservering af RNA og protein i Prøver af hjernevæv og Blood:
    1. Medier til RNA assay:
      1. Brain: RNAlater RNA stabilisering reagens, # 76106 i Eppendorf-rør.
      2. Blood: PAXgene Blood RNA Tube (PreAnalytix, Quagen).
    2. Medier til protein (CORT) assay fra blod: Opløsning D-HBSS, w / o Ca2 + og Mg2 +, (Quality Biological, Inc.).
    3. Opbevaring:
      1. Opsamlet hjernevæv først lagres i en kurv af tøris til ikke mere end 12 timer og derefter i en -70 ° C frysertil anvendelse inden for 6 måneder, varigheden af ​​undersøgelsen.
      2. Opsamlede blod holdes ved stuetemperatur natten over for at tillade reagenser til at trænge ind, hvorefter den lagres i en -70 ° C fryser til anvendelse inden for 6 måneder, så længe undersøgelsen.

3. Gene Microarray af mitokondriel & Mitokondrier-relateret kernegener

At studere rotte mitokondrie funktioner i hjernevæv, har vi for nylig udviklet rotte mitochondriet-neuron fokuseret microarray (rMNChip) og bioinformatik værktøjer til hurtig identifikation af differentierede veje i hjernevæv 18. rMNChip indeholder 1500 gener involveret i mitochondriske funktioner, stress response, døgnrytmer og signaltransduktion. Den bioinformatik Værktøjet indeholder en algoritme til beregning af differentielt udtrykte gener, og en database for nem og intuitiv fortolkning af microarray resultater.

  1. Purification af totalt RNA fra væv (Cat # GPM-Kit 2011-1, GenProMarkers):
    1. Rottehjernevæv af specifik kerner i RNA senere RNA stabilisering reagens (Qiagen).
    2. Væv (30 mg i 600 pi GPM-L / B buffer) homogenisering ved hjælp af Ultra-Turrax T8 om Dispergierstation (IKA Labortechnik).
    3. Centrifuger i 1,5-ml rør ved Sorvall 21.000 rpm i 15 minutter.
    4. Supernatanten dekanteres fra, i spin-søjle med en 2-ml opsamlingsrør.
    5. Centrifuger kolonne-rør ved 15.000 opm i 3 minutter, kasseres gennemløbet.
    6. Tilsættes 700 pi GPM-B / W buffer til hver af spin-søjler, centrifuger kolonne-rør ved 16.000 rpm i 15 sekunder, kasseres gennemløbet.
    7. Der tilsættes 500 pi GPM-W puffer til hver af spin-søjler, centrifuger kolonne-rør ved 16.000 rpm i 15 sekunder, gentages en gang.
    8. Placer centrifugesøjle i en ny 1,5 ml opsamlingsrør.
    9. Tilsæt 30 gl DEPC-behandlet vand til hver af spin-søjler, centrifugeres ved 16.000 rpm i1 min, gentag én gang.
    10. Måling af RNA-koncentrationen, justeres koncentrationen til 1 pg / pl med DNase-og RNase-frit vand, at prøverne er klar til microarray mærkning.
  2. Microarray mærkning og hybridisering (Cat # Array 900, Genisphere):
    1. 1,0 ug rotte total RNA anvendes til cDNA-syntese og microarray mærkning efter fabrikantens anvisninger.
    2. Microarray hybridisering udføres på en rMNChip ved 65 ° C i 12 til 16 timer som tidligere beskrevet. 18
  3. Vask Hybridiserede Microarray Slides (Cat # GPM0101-6, GenProMarkers):
    Vaskeopløsning Volumen 20 X SSC 10% SDS ddH 2 O
    0,5 X SSC/0.01 SDS 500 ml 12,5 ml 0,5 ml op til 500 ml
    0,5 X SSC 500 ml 12,5 ml op til 500 ml
    0,1 X SSC 500 ml 2,5 ml op til 500 ml
    0,01 X SSC 500 ml 0,25 ml op til 500 ml

    Under vaske objektglassene bør beskyttes mod lys. Lad ikke slides tørre ud på noget tidspunkt.
    1. Vask objektglassene i 250 ml Opløsning 1 i et glas Coplin jar (Cat #: 70312-20, Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA) ved stuetemperatur ved omrøring glasset på en BioShaker (Molecular Technologies Inc., St. Louis, MO ) indtil alle dækglas falder af glasplader (Det tager <3 minutter).
    2. Vask objektglassene med 250 ml Opløsning 2 i en anden beholder ved at omrøre beholderen i 3 minutter.
    3. Vask slides med 250-ml Løsning 3i en anden beholder ved at rotere beholderen i 3 minutter, gentage dette trin to gange.
    4. Skylning af objektglas med 250 ml 4 i en anden beholder i 10 sek. Umiddelbart tørre objektglassene ved centrifugering glassene placeret på PN11779 plader og ST-H750 rotor i en Sorvall Super T21 centrifuge ved 1.000 rpm i 5 min.
    5. Placer de vaskede dias i en kasse til scanning så hurtigt som muligt.
  4. Microarray billede scanning og analyse ved hjælp ScanArray Express Microarray Scanner (PerkinElmer) efter brugsanvisningen og fokus på:
    1. Microarray billedscanning: let scanning vs scanning protokol.
    2. Effekter af lasereffekt, PMT og normalisering metoder på data resultater.
    3. Tilpasning af GAL-fil over på billedet.
    4. Tilpasning af spots til gitre præcist.
  5. Dataanalyse: De tilpassede beregningsmæssige procedurer for microarray data analyse omfatter microarray billede evaluering, data filtrering, pletstørrelse korrektion, integration, normalization og sammenligning som tidligere beskrevet 18. Endvidere er fremgangsmåderne til ontologi, pathway og netværk analyserer de samme som tidligere beskrevet for at sikre frembringelsen af reproducerbare og kontrollerbare microarray resultater 2, 22, 25, 19, 20, 8, 23, 18.

4. Blod Prøveindsamling og Plasma CORT koncentration

  1. Pre-eller post-stress hale blodprøver fra bedøvede dyr indsamles på dag-1, 14, 21 og 30 i hepariniserede rør til bestemmelse af cirkulerende cort niveauer.
  2. Trunk blodprøver også opsamles i hepariniserede rør efter at dyrene er aflivet. Plasma udvindes og opbevares ved -70 ° C indtil analyse.
  3. Medier til plasma udvinding:
    1. Blodprøver til RNA-ekstraktion er indsamlet ved hjælp af PAXgene Blood RNA-rør (PreAnalytix, Quagen)
    2. Blodprøver til DNA-ekstraktion er indsamlet ved hjælp af PAXgene Blood DNA rør (PreAnalytix, Quagen). Blodprøver til proteinanalyse opsamles ved hjælp Lithiumheparin Capillary opsamlingsrør (200 ul) fra MaketLab # ML5601.
  4. Plasma CORT koncentration er testet og analyseret med Active Rat Cort VVM (Diagnostic Systems Labs Inc. http://www.beckmancoulter.com/ ) som følger:
    1. Markér de mikrotiterplader strips, der skal anvendes.
    2. Forbered Rat CORT enzymkonjugatopløsning ved at fortynde Rat CORT enzymkonjugat Concentrate i konjugat diluent.
    3. Afpipetteres 25 gl standarder, kontroller og ubekendte i boringer.
    4. Tilsæt 100 gl enzymkonjugat til hver brønd under anvendelse af en halvautomatisk dispenser. Bank forsigtigt på godt holder 5-10 sek.
    5. Tilsæt 100 pi Rat CORT Antiserum til hver brønd under anvendelse af en halvautomatisk dispenser.
    6. Inkubér brøndene ved stuetemperatur, 25 ° C, på et rysteapparat indstillet til 500 til 700 rpm i 60 minutter.
    7. Aspirér og vask hver well 5 gange med vaskeopløsning ved hjælp af en automatisk mikroplade vaskemaskine. Tørres ved at vende pladen på absorberende materiale.
    8. Der tilsættes 100 pi TMB kromogen i hver brønd under anvendelse af en halvautomatisk dispenser.
    9. Inkuber ved stuetemperatur 15-20 min på en orbital mikropladeryster sat til 500-700 rpm. Se farveændringen.
    10. Tilsæt 100 pi stopopløsning i hver brønd under anvendelse af en halvautomatisk dispenser.
    11. Ryste pladen i hånden 5-10 sek.
    12. Aflæs absorbansen af ​​opløsningen i brønden inden for 30 min.
    13. Filteret er fastsat til 450 nm. * VVM kits kan også købes på Immunobiological Laboratories ( www.ibl-america.com ).

5. Repræsentative resultater

Figur 1
Fig. 1. Rotter fastholdes og udsat for hale stød. Efterfølgende kropsvægt, Er plasma corticosteron koncentration og akustisk forskrækkelse respons målt A:. Stress Eksponering: Dyr fastholdes ved at blive immobiliseret i et ventileret plexiglas rør. Fyrre elektriske stød (2 mA, 3 sek varighed ;) leveres til deres haler på semi-tilfældige intervaller på 150 til 210 sek B og C:. Stress hæmmer gevinst i kropsvægt i løbet af vækst: Kropsvægt og føde-og vandforbrug måles umiddelbart før stress (dag -3), på dagen for de tre dage med stress og derefter hver anden dag der efter op til Dag 14. Den manglende forstærkning af kropsvægt i løbet af stress er aldrig kompenseres D:.. Stress øger plasma corticosteron koncentration E: Akustisk Startle: Dyr testes én dag før stress (dag-1) som en baseline læsning og 12 dage efter den sidste dag i De på hinanden følgende 3 dage af stress. Data for hver gruppe - Stress og Kontrol - er udtrykt som procent af akustiskeoverraske på dag 12 i forhold til dag -1. Stress markant øger den akustiske startle refleks. Klik her for at se større figur .

Figur 2
Figur 2 Dissektion af amygdala, hippocampus og hypothalamus fra hjernen udsnit A:.. Rottehjerne, ventral visning: Pile peger på de midterste cerebrale arterier B:. Hjernen blok, ventral view, klar til at blive transporteret til Vibratome. C: Hjernen blokken limet til vibratome bakke, caudal side op, cortex vender bladet. Den caudale hjerne er allerede blevet skåret væk udsætte den caudale hippocampus. Blokken er nu klar til 2500 um skive indeholdende størstedelen af hippocampus, der skal tages D:. Den 2500 um tyk skive indeholdende den kaudale hippocampus E:. THan isocortex (ISO) trækkes fra hippocampus (HC) og hippocampus skrællet fra midthjernen F:.. Den 2500 um tyk skive indeholdende amygdala og den rostrale hippocampus G: The isocortex er blevet udskåret og amygdala (Amyg) resekterede . H:. Hypothalamus (HT) udskæres og fordrevet Klik her for at se større figur .

Figur 3
Fig. 3. Ekspressionsniveauer for mRNA af glucocorticoid-receptoren (GR) og minerocorticoid receptor (MR) i amygdala, hippocampus, hypothalamus, og frontale cortex før (C, kontrol) og efter (Str)-hale-shock stress. Enheder er andelen af kontrol barer er SEM A: Amygdala: Stress mindsker minerocorticoid receptor mRNA-ekspression B: Hippocampus: Stress increa.ses minerocorticoid receptor mRNA-ekspression C:. Hypothalamus:. Stress øger minerocorticoid receptor mRNA-ekspression D: Frontal Cortex: Stress mindsker glucocorticoidreceptor mRNA-ekspression samt minerocorticoid receptor mRNA ekspression.

De (121bp) PCR-primere til rotte GR er: 1f.CCACTGCAGGAGTCTCACAA
1rAACACCTCGGGTTCAATCAC
The (99 bp) PCR-primere for rotte MR er: 1f.GCCTTCAGCTATGCCACTTC
1rAACGTCGTGAGCACCTTTCT

Figur 4
Figur 4. Cluster og heatmap af RNA udtrykkes forskelligt fra 64 gener afledt fra 5 rottehjernevæv, herunder cerebellum (CL), cerebrum (CR), frontal cortex (FC), hypothalamus (HT) og hippocampus (HC). Color kort indikerer fold ændringer i degen-(grøn) og op-(rød) udtrykte gener. (A) Cluster og heatmap af de normaliserede signalintensiteter på 9 målinger for hver af 64 gener afledt fra 15 microarray eksperimenter for disse fem hjernevæv. Ekspressionen af ​​hvert gen blev målt ved tekniske triplikater og eksperimentelle triplikater. (B) Cluster og heatmap af de gennemsnitlige RNA niveauer af disse ni målinger af hver af de 64 gener. Disse resultater viser en klar forskel i mitokondrie genekspression og derfor relaterede funktioner, som støtter vores hypotese, at forskellige områder i hjernen har forskellige energikrav. Klik her for at se større figur .

Vores anvendelse af rMNChip og bioinformatikredskaber førte til identifikation af en klynge og heatmap af 64 gener med differentielt udtrykte RNA afledt fra 5 rottehjernevæv, herunder cerebellum (CL), cerebrum (CR), frontal cortex (FC), hypothalamus (HT) og hippocampus (HC) (figur 4). Disse data viser de markante forskelle mitokondrie-genekspression og dermed relaterede funktioner. Resultaterne viser, at de forskellige hjerneregioner kræver forskellige mængder af energi for at udføre tilsvarende hjernefunktioner.

Discussion

Diagnosen PTSD er baseret på selvrapporteret psykiatriske symptomer (DSM IV) af potentielle emner. Ingen veldefineret biomarkør er i øjeblikket tilgængelig adgang til patofysiologiske status af potentielle PTSD patienter. PTSD er en lidelse provokeret af livstruende traumatiske begivenheder og de vigtigste psykiatriske symptomer være til stede i den efterladtes liv i flere måneder og endda år efter de indledende begivenheder. De mest fremtrædende og vedvarende symptomer afsløret hos patienter med PTSD er overvagtsomhed, forsinket overdrevet forskrækkelsesrespons 14, 15, 16 og en tilsyneladende kompromis af HPA-aksen. Hos mennesker disse symptomer tilbage, eller vises med en forsinkelse på tre måneder efter ophør af den traumatiske stressfaktor 24. Vores nuværende model for biomarkør undersøgelser af PTSD beskæftiger tilbageholdenhed og hale chok gentages i tre sammenhængende dage (2-hr sessioner af 40, 2 mA tailshocks) - den uundgåelige hale-shock model (ITS) i rotter en vægt på 150 gram. Dette ITS model harblevet vist at efterligne i væsentlig grad patofysiologien af PTSD 17, 7, 4, 10. Vores laboratorium og andre laboratorier har påvist, at ITS model af stress i rotter inducerer adfærdsmæssige og neurobiologiske forandringer, der ligner dem, der findes i PTSD fag 17, 7, 10, 9. Specifikt er disse stressede rotter udviser (1) en forsinket og overdrevne startle response vises flere dage efter stressor ophør, hvilket grund af den komprimerede tidsskala af rottens levetid i forhold til et mennesker, svarer til 1-3 måneders forsinkelse af symptomer på PTSD patienter (DSM-IV-TR PTSD kriterium for D / E 13), (2) forøget plasma corticosteron (CORT) i flere (10) dage, hvilket indikerer kompromittering af de hypothalamopituitary aksen (HPA), og (3) retarderet vægtforøgelse efter stressor ophør, svarende til dysfunktion af metaboliske regulering af PTSD. Der er ingen tegn i litteraturen, at ræven lugt, rovdyr eksponering, eller frygter forstærket startle response, udstilbit disse vedvarende adfærdsmæssige og neuroendocrinologic fænotyper associeret med PTSD.

Rotter udsat for en enkelt stress session (1DS) har udvist transient, men ikke de vedvarende abnormaliteter vises af 3DS rotter 17 foreliggende forsøg sammenlignet forskrækkelsesrespons af 3DS og 1DS rotter 4, 7 og 10 dage efter stressor ophør. I overensstemmelse med tidligere arbejde, understregede rotter udviste forhøjede basale plasma cort niveauer den første dag efter stress 17. Disse Cort niveauer var følsomme over for antallet af stressor eksponeringer med højere Cort niveauer i 3DS rotter end i 1Ds rotter. Som for startle reaktion, udviser de 1Ds rotterne en overdreven respons på lyd 7 dage efter stressor, hvorimod startle sensibilisering kun viser sig 10 dage efter stressor i 3DS rotter. Således er forekomsten af ​​en overdreven startle response efter stressor ophør synes at være relateret til antallet af stress session engagementer. Den 3DS stressede model ser ud til atvære nyttigt at få indsigt i ændret ekspression af biomarkører forbundet med symptomer på PTSD og de vigtigste målbare adfærdsmæssige fænotyper, der er forbundet med timingen efter ophør af stress. Genomiske resultater præsenteret give proof of principle for anvendelse rMNChip og bioinformatik værktøjer til at identificere differentiale veje, og gen-og protein biomarkører, som i høj grad vil lette systemer-biologisk undersøgelse og forståelse af molekylære mekanismer bag komplekse og multifaktorielle neurologiske lidelser, herunder PTSD.

Mens vores paradigme ikke dykke ned i den kognitive og mere komplekse adfærdsmæssige aspekter af PTSD, vi opmærksom på, at ændrede søvnmønstre i ITS model 1 svarer til besvær med at falde og opholder sig i søvn og mareridt af PTSD patienter 11 (DSM-IV-TR PTSD Kriterier D 13), og de ​​mangler i flugt / undgåelse og læring af en appetitive opgave i sin model 5 (DSM-IV-TR PTSD Criteria C 13). Den nuværende model stemmer godt overens med de vigtigste symptomer er karakteristiske for PTSD og giver en god model til at korrelere perifere biomarkører for PTSD, som kan opsamles fra patienter, med centrale, mekanistiske biomarkører, som ikke kan 6.

Disclosures

Ingen interessekonflikter erklæret.

Acknowledgments

Dette arbejde blev støttet af CDMRP, USUHS Grants G188LE, G188MG, og G188QC (til HL), og den USUHS Center for Studiet af Traumatisk Stress.

References

  1. Adrien, J., Dugovic, C., Martin, P. Sleep-wakefulness patterns in the helpless rat. Physiol. Behav. 49, 257-262 (1991).
  2. Bai, X., Wu, J., Zhang, Q., Alesci, S., Manoli, I., Blackman, M. R., Chrousos, G. P., Goldstein, A. L., Rennert, O. M., Su, Y. A. Third-generation human mitochondria-focused cDNA microarray and its bioinformatic tools for analysis of gene expression. Biotechniques. 42, 365-375 (2007).
  3. Blaszczyk, J. W. Startle response to short acoustic stimuli in rats. Acta Neurobiol. Exp. (Wars.). 63, 25-30 (2003).
  4. Braga, M. F., roniadou-Anderjaska, V., Manion, S. T., Hough, C. J., Li, H. Stress impairs alpha(1A) adrenoceptor-mediated noradrenergic facilitation of GABAergic transmission in the basolateral amygdala. Neuropsychopharmacology. 29, 45-58 (2004).
  5. Bremner, J. D., Vythilingam, M., Vermetten, E., Anderson, G., Newcomer, J. W., Charney, D. S. Effects of glucocorticoids on declarative memory function in major depression. Biol. Psychiatry. 55, 811-815 (2004).
  6. Garrick, T., Morrow, N., Eth, S., Marciano, D., Shalev, A. Psychophysiologic parameters of traumatic stress disorder in rats. Ann. N.Y. Acad. Sci. 821, 533-537 (1997).
  7. Garrick, T., Morrow, N., Shalev, A. Y., Eth, S. Stress-induced enhancement of auditory startle: an animal model of posttraumatic stress disorder. Psychiatry. 64, 346-354 (2001).
  8. Hsiao, Y. H., Su, Y. A., Tsai, H. D., Mason, J. T., Chou, M. C., Man, Y. G. Increased invasiveness and aggressiveness in breast epithelia with cytoplasmic p63 expression. Int. J. Biol. Sci. 6, 428-442 (2010).
  9. Jiang, X., Xing, G., Yang, C., Verma, A., Zhang, L., Li, H. Stress Impairs 5-HT(2A) Receptor-Mediated Serotonergic Facilitation of GABA Release in Juvenile Rat Basolateral Amygdala. Neuropsychopharmacology. , (2008).
  10. Jiang, X., Zhang, Z. J., Zhang, S., Gamble, E. H., Jia, M., Ursano, R. J., Li, H. 5-HT2A receptor antagonism by MDL 11,939 during inescapable stress prevents subsequent exaggeration of acoustic startle response and reduced body weight in rats. J. Psychopharmacol. , (2009).
  11. Maher, H. K. Sleep deprivation: are you a victim. AAOHN. J. 54, 548 (2006).
  12. Maier, S. F. Exposure to the stressor environment prevents the temporal dissipation of behavioral depression/learned helplessness. Biol. Psychiatry. 49, 763-773 (2001).
  13. North, C. S., Suris, A. M., Davis, M., Smith, R. P. Toward validation of the diagnosis of posttraumatic stress disorder. Am. J. Psychiatry. 166, 34-41 (2009).
  14. Orr, S. P., Metzger, L. J., Pitman, R. K. Psychophysiology of post-traumatic stress disorder. Psychiatr. Clin. North Am. 25, 271-293 (2002).
  15. Orr, S. P., Roth, W. T. Psychophysiological assessment: clinical applications for PTSD. J. Affect. Disord. 61, 225-240 (2000).
  16. Pitman, R. K., Orr, S. P., Shalev, A. Y., Metzger, L. J., Mellman, T. A. Psychophysiological alterations in post-traumatic stress disorder. Semin. Clin. Neuropsychiatry. 4, 234-241 (1999).
  17. Servatius, R. J., Ottenweller, J. E., Natelson, B. H. Delayed startle sensitization distinguishes rats exposed to one or three stress sessions: Further evidence toward an animal model of PTSD. Biological Psychiatry. 38, 539-546 (1995).
  18. Su, Y. A., Zhang, Q., Su, D. M., Tang, M. X. Rat Mitochondrion-Neuron Focused Microarray (rMNChip) and Bioinformatics Tools for Rapid Identification of Differential Pathways in Brain Tissues. Int. J. Biol. Sci. 7, 308-322 (2011).
  19. Su, D. M., Zhang, Q., Wang, X., He, P., Zhu, Y. J., Zhao, J., Rennert, O. M., Su, Y. A. Two types of human malignant melanoma cell lines revealed by expression patterns of mitochondrial and survival-apoptosis genes: implications for malignant melanoma therapy. Mol. Cancer Ther. , (2009).
  20. Identification of stress-responsive genes, canonical pathways, molecular networks and drug targets in brain tissues of human and animals for systems-biology study of post-traumatic stress disorder. Su, Y. A., Li, H., He, P., Webster, M. J., Zhang, Q., Zhang, L., Wang, X., Su, D. M., Ursano, R. J., Rennert, O. M. The DOD Congressionally Directed Medical Research Programs, the third Military Health Research Forum (MHRF), August 31 - September 3, 2009, Hallmark Crown Center, Kansas City, Missouri, , (2009).
  21. Su, Y. A., Wu, J., Zhang, L., Zhang, Q., Su, D. M., He, P., Wang, B. D., Li, H., Webster, M. J., Rennert, O. M., Ursano, R. J. Dysregulated mitochondrial genes and networks with drug targets in postmortem brain of patients with posttraumatic stress disorder (PTSD) revealed by human mitochondria-focused cDNA microarrays. Int. J Biol. Sci. 4, 223-235 (2008).
  22. Su, Y. A., Yang, J., Tao, L., Nguyen, H., He, P. Undetectable and Decreased Expression of KIAA1949 (Phostensin) Encoded on Chromosome 6p21.33 in Human Breast Cancers Revealed by Transcriptome Analysis. J. Cancer. 1, 38-50 (2010).
  23. Yehuda, R., Yang, R. K., Buchsbaum, M. S., Golier, J. A. Alterations in cortisol negative feedback inhibition as examined using the ACTH response to cortisol administration in PTSD. Psychoneuroendocrinology. 31, 447-451 (2006).
  24. Zhang, Q., Wu, J., Nguyen, A., Wang, B. D., He, P., Laurent, G. S., Rennert, O. M., Su, A. Molecular mechanism underlying differential apoptosis between human melanoma cell lines UACC903 and UACC903(+6) revealed by mitochondria-focused cDNA microarrays. Apoptosis. 13, 993-1004 (2008).

Tags

Medicin Genetics Physiology Neuroscience Immunology PTSD biomarkør stress angst startle corticosteron dyremodel RNA RT-PCR gen-chip cDNA microarray oligonukleotid microarray amygdala præfrontale cortex hippocampus cingulate cortex hypothalamus hvide blodlegemer
Biomarkører i en dyremodel for at afsløre Neurale, hæmatologisk, og adfærdsmæssige korrelater til PTSD
Play Video
PDF DOI

Cite this Article

Jia, M., Meng, F., Smerin, S. E.,… More

Jia, M., Meng, F., Smerin, S. E., Xing, G., Zhang, L., Su, D. M., Benedek, D., Ursano, R., Su, Y. A., Li, H. Biomarkers in an Animal Model for Revealing Neural, Hematologic, and Behavioral Correlates of PTSD. J. Vis. Exp. (68), e3361, doi:10.3791/3361 (2012).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter