Summary
Nous décrivons un modèle de rat de trouble de stress post-traumatique (SSPT) qui révèle les altérations persistantes dans la fonction neuroendocrine et le retard à long terme, l'intervention crainte exagérée, caractéristiques des patients SSPT. Le modèle animal et les méthodes décrites ici sont utiles pour corréler des biomarqueurs dans les noyaux du cerveau, qui sont mécaniste, mais ne peut pas être mesurée chez les patients avec des biomarqueurs en globules blancs périphériques, ce qui peut.
Abstract
Identification de biomarqueurs représentant l'évolution de la physiopathologie du syndrome de stress post-traumatique (SSPT) est d'une importance vitale, non seulement pour le diagnostic mais aussi pour objectif l'évaluation de l'efficacité thérapeutique et la résistance à un traumatisme. La recherche en cours vise à identifier des biomarqueurs moléculaires pour le SSPT, y compris les protéines de stress traumatiques induits, transcriptomes, les écarts génomiques et génétiques modulateurs, en utilisant des échantillons biologiques dans le sang des sujets, la salive, l'urine et les tissus du cerveau post-mortem. Cependant, la corrélation de ces molécules biomarqueurs dans des échantillons post mortem ou périphériques à fonctions cérébrales altérées associées à des symptômes psychiatriques chez les SSPT n'est toujours pas résolu. Ici, nous présentons un modèle animal de stress post-traumatique dans lequel les deux le sang périphérique et biomarqueurs cérébraux centraux, ainsi que phénotype comportemental, peut être recueillie et mesurée, ce qui permet la corrélation nécessaire des biomarqueurs centrales de stress post-traumatique, qui sont mécaniste et pathognomoniquemonique, mais ne peuvent pas être recueillies auprès des personnes, avec les biomarqueurs périphériques et les phénotypes comportementaux qui peuvent.
Notre modèle animal de stress post-traumatique emploie retenue et chocs répétés queue pendant trois jours consécutifs - l'incontournable choc arrière-modèle (ITS) chez les rats. Ce modèle SON imite la physiopathologie de stress post-traumatique 17, 7, 4, 10. Nous et d'autres avons vérifié que le modèle ITS induit des altérations du comportement et neurobiologiques semblables à ceux trouvés dans le SSPT sujets 17, 7, 10, 9. Plus précisément, ces rats stressés présentent (1) une réaction tardive et exagérées de sursaut apparaissant plusieurs jours après l'arrêt de stress, ce qui compte tenu de l'échelle de temps compressé de la vie du rat par rapport à un homme, correspond au retard de un à trois mois des symptômes chez les patients atteints de SSPT (DSM-IV-TR SSPT Criterian D / E 13), (2) améliorer corticostérone plasmatique (CORT) pendant plusieurs jours, ce qui indique compromis de l'axe hypothalamo-hypophysaire (HPA), et (3) un retard de bole gain de poids après l'arrêt dy facteur de stress, ce qui indique un dysfonctionnement de la régulation métabolique.
Les paradigmes expérimentaux utilisés pour ce modèle sont les suivants: (1) un paradigme impuissance acquise chez le rat dosé par mesure de la réponse de sursaut acoustique (ASR) et une cartographie de la masse corporelle, (2) microdissection du cerveau de rat dans des régions et des noyaux; ( 3) lié à une enzyme (ELISA) pour les niveaux sanguins de CORT, (4) une puce à l'expression des gènes en plus liée à outils bioinformatiques 18. Cette biopuce, surnommé rMNChip, se concentre sur les mitochondries et les mitochondries liée à des gènes nucléaires chez le rat afin de répondre spécifiquement aux bioénergétique neuronales suppose être impliqués dans le SSPT.
Protocol
1. Modèle animal du comportement de stress post-traumatique
- Sujets: Homme albinos Sprague Dawley (Taconic Farms, Derwood, MD) sont utilisés, la pondération 150 à 200 g au moment de l'administration du protocole de stress.
- Mesure de la consommation d'eau alimentaire et le gain de poids corporel: A l'arrivée chez les rats de laboratoire pesant 100 ± 25 g sont logés dans une cage deux (taille de la cage: 45x24x20 cm). Substrat rembourrage cage (copeaux de bois) sont changés deux fois par semaine. Les animaux sont maintenus sur un cycle de lumière de 12 h inversée (lumières allumées: 1800/0600 et au large: de 0600 à 1800) à une température (22 ± 4 ° C) - et l'humidité relative (30-70%)-une semaines environnement contrôlé avant les expériences. L'eau et le niveau granulés chow (Harlan (2018) 18% des rongeurs alimentation en protéines, les régimes alimentaires mondiales, Harlan Teklad) sont disponibles gratuitement dans les cages à domicile, et les poids corporels sont enregistrés quotidiennement 3 jours avant, 3 jours durant et 3 jours après la cessation du stress .
- Acclimatation: Les rats sont acclimatés pendant trois jours à boe l'animalerie et une chambre de sursaut acoustique. Pour les acclimater à la chambre de sursaut acoustique, les animaux sont manipulés en elle pendant 5 minutes chaque jour pendant trois jours consécutifs avant les mesures initiales.
- Souligné protocole: Les animaux sont également attribués à chaque groupe en fonction de leur poids corporel et de la réponse de sursaut de référence. Les analyses sont effectuées sur deux groupes d'animaux; chaque groupe étant constitué de 16 animaux. Groupe 1 reçoit le protocole de stress, et le groupe 2 est le contrôle.
Le protocole de l'exposition au stress est un processus continu de 2 h procédure, où chaque séance se compose de retenue («incontournables») et queue-chocs, répétée une fois par jour pendant 3 jours consécutifs. Soulignant se fait le matin (dans la fenêtre de 0800 et 1200). L'immobilisation des animaux en étant immobilisé dans un tube en plexiglas ventilé. Quarante chocs électriques (2 mA, 3 sec durée; Essai Cage animale étage Shocker Grille, Coulbourn Instruments, USA) sont livrés à leurs queues à semi-aléatoires intervalles de 150 to 210 s (graphique Logiciel de notation État, Habitest Lien universelle, Coulbourn Instruments, USA). La stimulation à 2 mA a été choisie parce qu'elle est agressive, mais pas douloureux, lorsque la sortie de stimulation est placée en travers de doigt de l'expérimentateur. Gel d'électrode est appliqué en utilisant un coton-tige pour former une mince couche de gel conducteur entre l'électrode et la peau de la queue du rat. Les pinces d'électrodes sont ajustées et relié à la queue pour assurer une bonne connexion sans affecter la circulation sanguine de la queue. - Acoustique de sursaut (ASR): Acoustique mesure de la réponse de sursaut a été réalisée avec un système de test de réponse acoustique de sursaut (Coulbourn Instruments, Columbus, Ohio, Etats-Unis) 3. Ce système est constitué de plates-formes sensibles au poids dans une chambre insonorisée. Le transducteur, qui est une jauge de contrainte, dans chacune des plates-formes de sursaut à un étalonnage avant l'utilisation. Tout d'abord, le coupleur doit être dans le mode de couplage à courant continu pour l'étalonnage. Dans ce mode, la sortie du coupleur disuit directement l'entrée de la plate-forme, le mode requis pour l'étalonnage des poids statiques. Le transducteur est commuté sur le mode de couplage CA au cours d'expériences de sorte que seul changement rapide de la force, ce qui signifie que la réponse de sursaut, est sortie. Les mouvements de l'animal en réponse à des stimuli sonores sont ainsi mesurée comme une variation de tension par une jauge de contrainte à l'intérieur de chaque plate-forme et enregistrée en tant que la réponse maximale se produisant à l'intérieur de 200 ms du début du stimulus de sursaut-déclencher.
Il ya six types d'essais de relance: 100 dB seulement, 100 dB avec pré-impulsion, seuls 110 dB, 110 dB avec pré-impulsion, pré-impulsion seul et sans contrôle du stimulus. Chaque type d'essai a été présenté huit fois. Types d'essais sont présentés dans un ordre aléatoire afin d'éviter les effets d'ordre et d'accoutumance. Inter-essai intervalles varient de façon aléatoire 15 à 25 sec. Parmi les huit essais, seules les valeurs maximales sont collectées dans les résultats et finalement ajustée au poids corporel de l'animal du même jour. Les animaux sont testés un par jour bvant le stress ou d'autres traitements comme une lecture de base et 1, 7, 14 et 21 jours après le dernier jour des 3 jours consécutifs de la procédure de stress ou d'autres traitements. - L'analyse des données:
- ASR: L'amplitude de la réponse de sursaut acoustique testée à chaque fois est représenté par "% du niveau de référence», qui est calculée en utilisant l'équation:% du niveau de référence = (valeur absolue d'amplitude / amplitude absolue de référence) x 100%. Pour chaque jour du test, analyse de la variance pour mesures répétées sont effectuées sur des amplitudes de sursaut avec les facteurs de l'état de stress et de dosage du médicament à l'aide du logiciel SPSS (version 16) logiciel. Tests de Tukey, Bonferroni, Dunnett ou sont utilisés pour évaluer significatifs post-hoc différences entre les groupes individuels. Les données sont représentées sous forme de moyenne ± SEM
- Croissance: Le poids corporel et la consommation alimentaire et de l'eau sont mesurées sur le stress Jour -1 précédent et les jours 14, 21 et 30 ci-après achèvement du protocole de stress. Analyse statistique: données sur l'apport alimentaire et l'eau sont soumis à unmanière à mesures répétées analyse de variance (ANOVA). À analyser les variations de taux de consommation alimentaire au cours du temps, la quantité de l'apport alimentaire est en outre divisé par le poids corporel du sujet à minimiser la variance de poids induite par le stress et le protocole initial différence dans le poids du corps entre les groupes. Toutes les procédures sont menées sur l'agrément, conformément à la protection des animaux et du Comité institutionnel d'utilisation (IACUC).
2. La dissection du cerveau
- Instruments & Matériaux:
- Pot de l'anesthésie: ". Pot de conserve" C'est un bocal en verre avec couvercle, mesurant environ 6 cm de haut et 5 cm de diamètre, comme un «pot de pharmacien", "pot boule de coton", ou
- Guillotine pour rats, tels que fournis par Kent scientifique.
- Vibratome 1000:
- Couper lame de rasoir dans la moitié longitudinalement, huile de lavage avec de l'alcool, insérer dans la pince.
- Remplissez salle de bain avec de la glace pilée ordinaire.
- Lieule tiroir longitudinal.
- Essuyer le bac d'humidité avant de placer une goutte de colle cyanoacrylate.
- Rongeurs (des exemples sont un micro Friedman rongeur de Miltex, cat. No. 17-4801 ou un rongeur Pearson de Science Outils chat fine. Pas 16015-17).
- N ° 3 ou n ° 5 bijoutiers forceps (pointu pour retirer mère).
- Petits ciseaux pointus ou tranchants (Vantage V95-304 est un exemple).
- (2) Plat inox mini-spatules en acier, tels que ceux utilisés pour transférer des produits chimiques en poudre à une balance. L'extrémité la plus large est penché vers l'avant de manière à s'adapter entre télencéphale et la calotte crânienne.
- Cuillère à transférer bloc cerveau. (Une cuillère à soupe de plastique de la cafétéria fonctionne très bien.)
- Scalpel N ° 10.
- Double lame de rasoir (acier au carbone):
- La moitié des Vibratome.
- Une moitié pour la dissection.
- Deux boîtes de Pétri en verre, ~ 3,5 pouces et 4 pouces de diamètre, tels que l'on s'adapte à l'intérieur de l'autre. De la glace pilée dans le bOTTO plat. Deux papiers filtres dans le plat supérieur. Déplacer tranche de positions requises par le déplacement du papier filtre.
- Bécher de 100 ml.
- Compte-gouttes pour irriguer le cerveau refroidi avec de la glace d'un CCA. (Pipette Pasteur en verre avec extrémité étroite inséré dans 1/2 ampoule pouces larges en caoutchouc latex fonctionne bien.)
- Écrasé bac à glaçons: Environ 5 cm de haut, 20 cm de long, 10 cm de large. Contient:
- Collez tous les instruments de la glace pilée.
- Faible teneur en calcium / magnésium de haute aCSF en bouteille plastique qui peut être frappé d'écraser la glace.
- Cyanoacrylate.
- Faible teneur en calcium / magnésium de haute liquide céphalo-rachidien artificiel (ACSF):
- En mM: NaCl 125, KCl 2,5, 0,5 CaCl 2 * 2H 2 O, 2,0 MgCl 2 6H 2 0 *, 1,2 NaH 2 PO 4 * H 2 O, NaHCO 25, 11 Glucose.
- En bouteille en plastique qui peut être tapé pour écraser la glace.
- Réfrigérer pendant 20 min à -80 ° C congélateur pour en faire une bouillie.
- Des cotons-tiges.
- Papier filtre: 42,5 mm Whatman (Cat no 1001 042.).
- Mini tubes à centrifuger pour collecter les petits morceaux de tissu.
- Wells plaque de recueillir des grandes structures et des sections de tissus.
- Serviette en papier.
- Sac rouge de biohazard.
- Anesthésie:
- Pot de l'anesthésie, compresses de gaze, isoflurane, pinces métalliques, sont placés dans une hotte.
- Rat est placé dans un bocal anesthésie.
- Humidifiez un tampon de gaze avec de l'isoflurane et le placer dans le pot anesthésie.
- Attendez jusqu'à ce que la pédale de réflexe - le retrait de la patte lorsque la nappe est pincée avec une pince - ou réflexe cornéen disparaît.
- Décapitez: Saisir rat avec une main autour de l'arrière du thorax, décapiter rat avec guillotine au plus près de l'occiput que possible. L'atlas sera encore le plus souvent rester attachée au crâne.
- Prélèvement sanguin: rat Compression à thorax pour empêcher le sang de gicler à partir artères carotides.Détendre progressivement poignée de façon à contrôler le flux de sang dans le récipient de collecte.
- Retrait du cerveau:
- Couper rapidement les muscles et tout vertèbres en restant loin de la basiocciput avec les ciseaux de petite taille.
- Utilisation rongeur et le début du foramen magnum, couper les condyles occipitaux et la basiocciput.
- Incision du cuir chevelu ligne médiane avec un scalpel.
- À l'aide des ciseaux, couper une incision médiane sagittale dans les os occipital et pariétal. Saisir la marge de coupe du crâne avec les rongeurs, il casser les reins comme une coquille d'œuf loin de la ligne médiane, en veillant à minimiser tout contact avec le cerveau. La coupe médiane et arrière pause peut être fait par étapes.
- Comme le cerveau est encore plus exposée, il est essentiel pour l'éteindre avec de la glace aCSF réfrigérés pour préserver l'intégrité et la vitalité du tissu.
- De même rompre les os temporaux et frontaux.
- Avec une pince fine, arracher la durée, en veillant à obtenir l'tentorum du cervelet.
- Avec une spatule mini-inséré sous le lobe frontal du cerveau de soulever la calotte crânienne, juste assez pour mettre de la tension sur les nerfs crâniens.
- Transect des nerfs crâniens avec les ciseaux.
- Soulevez le cerveau entièrement le crâne et laisser tomber dans le bécher de calcium faible glacé / aCSF élevée en magnésium. Laisser une minute ou plus pour refroidir de sorte que le tissu sera solide, les structures clairement visibles, et la santé du tissu sera conservé.
- Avec la cuillère en plastique, transférer le cerveau sur le papier filtre dans la glace réfrigéré boîte de Petri, face ventrale vers le haut.
- Dissection du cerveau:
- Faire un transection coronaire avec une lame de rasoir à l'artère cérébrale moyenne (figure 2A).
- Enregistrer lobe frontal temporairement refroidi dans la glace pauvre en calcium / magnésium aCSF élevé dans un bécher de 100 ml.
- Retournez cerveau de sorte que la surface dorsale est en place. Transect du tronc cérébral à la jonction du mésencéphale une diencaphalon. Le bloc résultant cerveau est vu sur la figure 2B.
- Déposer le dos bloqué dans cerveau glacé faible en calcium / magnésium de haute aCSF.
- L'aide de spatules mini, disséquer cervelet moelle / pont. Enregistrer dans les médias appropriés pour l'analyse prévue.
- Retour le cerveau bloqué à la boîte de Pétri. L'utilisation de deux filtres en papier, soulevez le cerveau en plaçant un papier filtre sur la ventrale. Avec elle, de placer le plan coronal postérieure du cerveau bloquée sur le bord du papier filtre secondes. Avec cet endroit papier filtre le plan de coupe antérieure du cerveau bloqué sur une goutte de cyanoacrylate sur la plaque de coupe Vibratome, le cortex face à la lame.
- Avec le Vibratome, coupé juste assez du cerveau caudale afin que les spectacles hippcampus (figure 2C).
- Prenez une section, 2.400 μ d'épaisseur pour un rat 125 g, 2.700 μ d'épaisseur dans 200 g rat. Transférer la section à l'aide d'un coton-tige sur les papiers filtres sur la boîte de Pétri(Figure 2D).
- Couper et sauvegarder cortex cingulaire avec la lame de rasoir.
- Avec une spatule dentaire, poussez-le dans le bord distal du corps calleux pour le couper, puis retirez l'isocortex.
- De sa marge ventolateral, retirez l'hippocampe (figure 2E).
- Enregistrez le mésencéphale.
- Prendre une seconde section, 2.400 um d'épaisseur à 120 g de rat, 2.500 um d'épaisseur à 200 g de rat. Placez la section sur les papiers filtres sur la boîte de Pétri (figure 2F). Alternativement, cinq 500 articles pm pourrait être prise à ce stade de l'électrophysiologie.
- Couper et sauvegarder cortex cingulaire avec la lame de rasoir.
- Faire des coupes latérales avec la lame de rasoir à la capsule interne pour enlever l'isocortex (figure 2F).
- Faire des coupes obliques avec la lame de rasoir pour enlever la amygdali (figure 2F, G).
- Faire une boîte de couper avec la lame de rasoir pour enlever l'hypothalamus. Le latéralles coupes sont latérale du noyau ventromédian de l'hypothalamus, qui est visible. Nous faisons la coupe dorsale juste au-dessus du troisième ventricule ou l'aire tegmentale ventrale (figure 2H).
- Poussez la spatule dans le corps calleux et le retirer le petit morceau de isocortex attaché à l'hippocampe. Placez l'extrémité étroite de la spatule ventrale à la commissure hippocampique et élever dos pour retirer l'hippocampe.
- Préservation de l'ARN et des protéines dans les échantillons de tissus du cerveau et le sang:
- Médias pour dosage de l'ARN:
- Cerveau: RNAlater RNA stabilisation réactif, # 76106 dans des tubes Eppendorf.
- Sang: PAXgene Blood RNA Tube (PreAnalytix, Quagen).
- Médias pour la protéine (CORT) analyse de sang: Solution d-HBSS, w / o Ca 2 + et Mg 2 +, (qualité biologique, Inc).
- Stockage:
- Tissu cérébral recueillies sont d'abord stockées dans un panier de glace sèche pour pas plus de 12 heures, puis dans un congélateur à -70 ° Cpour une utilisation dans les 6 mois, la durée de l'étude.
- Le sang collecté est conservé à température ambiante pendant une nuit pour permettre aux réactifs de pénétrer, après quoi il est stocké dans un congélateur à -70 ° C pour une utilisation dans les 6 mois, la durée de l'étude.
- Médias pour dosage de l'ARN:
3. Microarray Gene mitochondriales et des mitochondries liée à des gènes nucléaires
Pour étudier les fonctions rat mitochondriales dans les tissus du cerveau, nous avons récemment développé le rat mitochondrie-neurone axée sur puce à ADN (rMNChip) et des outils bio-informatiques pour l'identification rapide des voies différentielles dans 18 tissus cérébraux. rMNChip contient 1500 gènes impliqués dans les fonctions mitochondriales, la réponse au stress, rythmes circadiens et la transduction du signal. L'outil bioinformatique comprend un algorithme pour le calcul de gènes différentiellement exprimés, et une base de données pour interprétation directe et intuitive pour des résultats de biopuces.
- Purification d'ARN total à partir de tissus (Cat # GPM-Kit 2011-1, GenProMarkers):
- Tissus de cerveau de rat de noyaux spécifiques dans l'ARN ARN tard réactif de stabilisation (Qiagen).
- Tissus (30 mg dans 600 ul GPM-L / tampon B) homogénéisation en utilisant Ultra-Turrax T8 sur Dispergierstation (IKA Labortechnik).
- Centrifugeuse de 1,5 ml tubes à Sorvall 21000 rpm pendant 15 min.
- Décanter le surnageant dans une colonne spin avec un tube collecteur de 2 ml.
- Centrifuger les tubes à colonne à 15000 rpm pendant 3 min, jeter le accréditives.
- Ajouter 700 ul GPM-B / W tampon à chacune des colonnes de centrifugation, centrifuger les tubes à colonne à 16.000 tours par minute pendant 15 secondes, jeter le accréditives.
- Ajouter 500 ul GPM-W tampon pour chacune des colonnes de centrifugation, centrifuger les tubes à colonne à 16.000 tours par minute pendant 15 secondes, répéter une fois.
- Placer chaque colonne dans un nouveau tube de 1,5 ml de collecte.
- Ajouter 30 ul d'eau traitée au DEPC à chacune des colonnes de centrifugation, centrifuger à 16000 rpm pendant1 min, répéter une fois.
- Mesurer la concentration en ARN, ajuster la concentration de 1 pg / pl avec de la DNase-et l'eau sans RNase, les échantillons sont prêts pour l'étiquetage puces à ADN.
- L'étiquetage et l'hybridation de puces à ADN (Cat # array 900, Genisphere):
- 1,0 pg d'ARN total rat est utilisé pour la synthèse de l'ADNc et l'étiquetage puces à ADN en suivant les instructions du fabricant.
- Hybridation de puces à ADN est effectuée sur une rMNChip à 65 ° C pendant 12-16 h comme décrit précédemment 18.
- Diapositives à laver biopuces hybridées (Cat # GPM0101-6, GenProMarkers):
Solution de lavage Volume 20 X SSC SDS à 10% ddH 2 O 0,5 X SSC/0.01 SDS 500 ml 12,5 ml 0,5 ml jusqu'à 500 ml 0,5 X SSC 500 ml 12,5 ml jusqu'à 500 ml 0,1 X SSC 500 ml 2,5 ml jusqu'à 500 ml 0,01 X SSC 500 ml 0,25 ml jusqu'à 500 ml
Pendant le lavage, les lames doivent être protégés de la lumière. Ne laissez pas sécher diapositives à n'importe quel stade.- Laver les lames dans 250 ml de solution 1 dans un bocal en verre Coplin (Cat #: 70312-20, Sciences de la microscopie électronique, Hatfield, PA) à température ambiante en agitant le pot sur une BioShaker (Technologies Inc moléculaire, St. Louis, MO ) jusqu'à ce que toutes les lamelles tomber les lames de verre (Il prend <3 minutes).
- Laver les lames avec 250 ml Solution 2 dans un autre bocal en agitant le bocal pendant 3 min.
- Laver les lames avec 250 ml Solution 3dans un autre pot en tournant le pot pendant 3 min, répéter cette étape deux fois.
- Laver les lames avec 250 ml Solution 4 dans un autre bocal pendant 10 sec. Sécher immédiatement les lames par centrifugation des pots placés sur les plaques et PN11779 ST-H750 rotor dans une centrifugeuse Sorvall possible T21 à 1000 rpm pendant 5 min.
- Placer les lames lavées dans une boîte pour la numérisation dès que possible.
- Numérisation d'une image à l'aide de puces à ADN et l'analyse ScanArray express Microarray Scanner (PerkinElmer) suivant le manuel d'instruction et de se concentrer sur:
- Numérisation d'images de puces à ADN: analyse facile vs numérisation protocole.
- Effets des méthodes d'alimentation, PMT et la normalisation des données sur les résultats LASER.
- Alignement du fichier GAL sur l'image.
- Alignement des points de grilles avec précision.
- L'analyse des données: Les procédures personnalisées de calcul pour l'analyse de données microarray comporter une évaluation image de puces à ADN, le filtrage des données, la correction la taille du spot, l'inclusion, normalization et la comparaison comme décrit précédemment 18. En outre, les méthodes d'analyses ontologie, de la voie et du réseau sont les mêmes que celles décrites précédemment pour assurer la production de résultats reproductibles et vérifiables microarray 2, 22, 25, 19, 20, 8, 23, 18.
4. Prélèvement d'échantillons de sang et mesure des concentrations plasmatiques CORT
- Pré-ou post-stress échantillons de sang de la queue des animaux anesthésiés sont recueillis lors de la Journée-1, 14, 21 et 30 dans des tubes héparinisés pour la détermination des niveaux circulants CORT.
- Des échantillons de sang du tronc sont également recueillies dans des tubes héparinisés après que les animaux sont euthanasiés. Le plasma est extrait et stocké à -70 ° C jusqu'à l'analyse.
- Médias pour l'extraction du plasma:
- Des échantillons de sang pour l'extraction d'ARN sont recueillies à l'aide PAXgene Blood RNA tubes (PreAnalytix, Quagen)
- Des échantillons de sang pour l'extraction d'ADN sont recueillies à l'aide des tubes PAXgene ADN du sang (PreAnalytix, Quagen). Des échantillons de sang pour l'analyse des protéines sont recueillies au moyen d'un tube à héparine de lithium Collection capillaire (200 pi) de MaketLab # ML5601.
- Plasma CORT concentration est testée et analysée avec Active Rat Cort EIE (Diagnostic Systems Labs Inc http://www.beckmancoulter.com/ ) comme suit:
- Marquer les barrettes de microtitration à être utilisés.
- Préparer Rat CORT solution de conjugué enzymatique en diluant Rat CORT concentré de conjugué enzymatique dans le diluant du conjugué.
- Pipeter 25 ul normes, contrôles et inconnus dans les puits.
- Ajouter 100 ul de solution de conjugué enzymatique dans chaque puits en utilisant un distributeur semi-automatique. Tapoter doucement la porte et 5-10 sec.
- Ajouter 100 ul Rat CORT antisérum à chaque puits en utilisant un distributeur semi-automatique.
- Incuber les puits à température ambiante, 25 ° C, sur un ensemble agitateur à 500-700 tours par minute pendant 60 min.
- Aspirer et laver chaque well 5 fois avec la solution de lavage en utilisant un laveur automatique de microplaques. Sécher en retournant la plaque sur du papier absorbant.
- Ajouter 100 ul de la solution de chromogène TMB dans chaque puits en utilisant un distributeur semi-automatique.
- Incuber à température ambiante 15-20 min sur un agitateur orbital de microplaques réglé à 500-700 rpm. Regardez le changement de couleur.
- Ajouter 100 ul de solution d'arrêt dans chaque puits en utilisant un distributeur semi-automatique.
- Agiter la plaque à la main 5-10 sec.
- Lire l'absorbance de la solution dans le puits dans les 30 minutes.
- Filtre est fixée à 450 nm. * Trousses EIA peuvent également être achetés dans les laboratoires immunobiologiques ( www.ibl-america.com ).
5. Les résultats représentatifs
Les rats Figure 1. Sont retenus et soumis à des chocs queue. Poids corporel suite, La concentration plasmatique de corticostérone, et la réponse de sursaut acoustique sont mesurés A:. Exposition au stress: Les animaux sont retenus en étant immobilisé dans un tube en plexiglas ventilé. Quarante chocs électriques (2 mA, durée 3 secondes ;) sont livrés à leurs queues à semi-aléatoires intervalles de 150 à 210 s B et C:. Stress retarde le gain de poids pendant la croissance: Le poids corporel et la consommation de nourriture et d'eau sont mesurés immédiatement avant le stress (Jour -3), le jour des trois jours de stress et ensuite tous les deux jours là-bas après la Journée 14. L'absence de gain de poids corporel au cours du stress n'est jamais compensé D:.. Augmente le stress concentration plasmatique de corticostérone E: sursaut acoustique: Les animaux sont testés un jour avant le stress (jour-1) comme une lecture de base et de 12 jours suivant le dernier jour de les 3 jours consécutifs du stress. Les données pour chaque groupe - Stress et contrôle - sont exprimées en pour cent du acoustiquessursauter au jour 12 par rapport au jour -1. Le stress augmente nettement le réflexe de sursaut acoustique. Cliquez ici pour agrandir la figure .
Figure 2 Dissection de l'amygdale, l'hippocampe et l'hypothalamus du cerveau tranche A:.. Cerveau de rat, vue ventrale: Les flèches pointent vers les artères cérébrales moyennes B:. Le bloc cerveau, vue ventrale, prêt à être transporté à l'Vibratome. C: Le bloc du cerveau collé au plateau vibratome, côté caudal en place, le cortex face à la lame. Le cerveau caudale a déjà été coupé exposer l'hippocampe caudale. Le bloc est maintenant prêt pour les um 2500 tranche contenant la majeure partie de l'hippocampe à prendre D:. La tranche um 2500 épaisse contenant l'hippocampe caudale E:. Til isocortex (ISO) est détachée de l'hippocampe (HC) et l'hippocampe décollée de la mésencéphale F:.. La tranche um d'épaisseur contenant 2500 l'amygdale et l'hippocampe rostrale G: Le isocortex a été excisée et l'amygdale (Amyg) réséqué . H:. L'hypothalamus (HT) est excisé et déplacé Cliquez ici pour agrandir la figure .
Figure 3. Les niveaux d'expression de l'ARNm du récepteur des glucocorticoïdes (GR) et le récepteur minerocorticoid (MR) dans l'amygdale, l'hippocampe, l'hypothalamus et le cortex frontal avant (C, témoin) et après (Str) tail-choc stress. Les unités sont proportion de commande; barres sont MEB A: Amygdala: Le stress diminue minerocorticoid expression de l'ARNm du récepteur B: Hippocampus: aug stress.session minerocorticoid expression d'ARNm du récepteur C:. Hypothalamus:. minerocorticoid stress augmente l'expression d'ARNm du récepteur D: Cortex frontal: Le stress diminue l'expression des ARNm des récepteurs des glucocorticoïdes ainsi que minerocorticoid expression de l'ARNm du récepteur.
| Les amorces (121bp) PCR pour GR rat sont: | 1f.CCACTGCAGGAGTCTCACAA 1rAACACCTCGGGTTCAATCAC |
| L'(99 pb) des amorces de PCR pour le rat MR sont les suivants: | 1f.GCCTTCAGCTATGCCACTTC 1rAACGTCGTGAGCACCTTTCT |
Cluster Figure 4. Heatmap et de l'ARN différentiellement exprimés à partir de 64 gènes dérivés de 5 tissus de cerveau de rat, y compris le cervelet (CL), le cerveau (CR), le cortex frontal (FC), l'hypothalamus (HT), et l'hippocampe (HC). Carte de couleurs indique les changements de pliage dans dpropre (vert) et jusqu'à-(rouge) des gènes exprimés. (A) et Cluster heatmap des intensités de signal normalisés de mesure 9 pour chacun des 64 gènes dérivés d'expériences sur biopuces 15 de ces tissus cérébraux cinq. L'expression de chaque gène a été mesurée par trois exemplaires techniques et expérimentales en triple. (B) de cluster et heatmap des niveaux d'ARN moyennes de ces 9 mesures de chacun des 64 gènes. Ces résultats montrent de nettes différences dans l'expression des gènes mitochondriaux et des fonctions connexes, par conséquent, qui soutiennent notre hypothèse selon laquelle les différentes régions du cerveau ont des exigences différentes énergies. Cliquez ici pour agrandir la figure .
Notre application de la rMNChip et outils bioinformatiques a conduit à l'identification d'un cluster et heatmap de 64 gènes différentiellement exprimés avec l'ARN provenant de 5 tissus de cerveau de rat, y compris le cervelet (CL), le cerveau (CR), le cortex frontal (CF), hypothalamusLamus (HT), et l'hippocampe (HC) (figure 4). Ces données montrent des différences claires dans l'expression des gènes mitochondriaux et donc les fonctions connexes. Les résultats démontrent que les différentes régions du cerveau exiger quantité différente de l'énergie afin de réaliser les fonctions cérébrales correspondantes.
Discussion
Le diagnostic de SSPT est basé sur l'auto signalé des symptômes psychiatriques (DSM-IV) par des sujets potentiels. Aucun biomarqueur bien définie est actuellement disponible pour accéder à l'état physiopathologique du potentiel de patients atteints de SSPT. Le SSPT est un trouble provoqué par la vie en danger événements traumatiques et les symptômes psychiatriques principaux restent présents dans la vie de la victime pendant des mois et même des années après les événements initiaux. Les symptômes les plus importants et persistants ont révélé chez les patients atteints du SSPT sont hypervigilance, sursauts exagérés réponse retardée 14, 15, 16 et un compromis apparent de l'axe HPA. Chez l'homme ces symptômes persistent ou apparaissent avec un délai de trois mois, après l'arrêt du stress traumatique 24. Notre modèle actuel pour les études de biomarqueurs de stress post-traumatique emploie retenue et chocs répétés queue pendant trois jours consécutifs (2-hr séances de 40 mA, tailshocks 2) - l'incontournable choc arrière-modèle (ITS) chez les rats pesant 150 grammes. Ce modèle SA aété montré à imiter dans une large mesure la physiopathologie de stress post-traumatique 17, 7, 4, 10. Notre laboratoire et d'autres laboratoires ont vérifié que le modèle SA de stress chez le rat induit des modifications comportementales et neurobiologiques qui sont similaires à ceux trouvés dans le SSPT sujets 17, 7, 10, 9. Plus précisément, ces rats stressés présentent (1) une réaction tardive et exagérées de sursaut apparaissant plusieurs jours après l'arrêt de stress, ce qui compte tenu de l'échelle de temps compressé de la vie du rat par rapport à un homme, correspond au retard de un à trois mois des symptômes chez les patients atteints de SSPT (DSM-IV-TR SSPT Criterian D / E 13), (2) améliorer corticostérone plasmatique (CORT) pour plusieurs (10) jours, en indiquant compromis de l'axe hypothalamo-hypophysaire (HPA), et (3) le gain de poids du corps après un retard de stress l'arrêt, ce qui correspond à un dysfonctionnement de la régulation du métabolisme du SSPT. Il n'existe aucune preuve dans la littérature que l'odeur de renard, l'exposition des prédateurs, ou craignent potentialisée réaction de sursaut, d'exposipeu ces phénotypes comportementaux persistants et neuroendocrinologic associés à l'ESPT.
Des rats exposés à une session de stress unique (1DS) ont montré transitoire, mais pas les anomalies persistantes affichées par les rats 3DS 17 La présente expérience a comparé la réaction de sursaut de la 3DS et les rats 1DS 4, 7 et 10 jours après l'arrêt de stress. Conformément aux travaux antérieurs, a souligné rats exposés élevés les taux plasmatiques basales CORT le stress premier jour après 17 ans. Ces niveaux étaient sensibles à CORT le nombre d'expositions aux facteurs de stress avec des niveaux plus élevés chez le rat CORT 3DS que dans 1DS rats. Quant aux réactions de sursaut, les rats 1DS présentent une réponse exagérée à la surprise de stress après 7 jours, alors que la sensibilisation sursaut ne devient apparente 10 jours après stress chez le rat 3DS. Ainsi, l'apparition d'une réponse exagérée de sursaut après la cessation de stress semble être liée au nombre d'expositions de session stress. Le modèle 3DS stressé sembleêtre utile pour mieux comprendre l'altération de l'expression des biomarqueurs associés à des symptômes de stress post-traumatique et les principaux phénotypes comportementaux mesurables liés à la synchronisation après la cessation du stress. Résultats génomiques a présenté une preuve de principe pour l'application des outils rMNChip et la bioinformatique pour identifier les voies différentielles, et des biomarqueurs génétiques et de protéines, ce qui facilitera grandement les systèmes biologiques, l'étude et la compréhension des mécanismes moléculaires sous-jacents complexes et multifactorielles des troubles neurologiques, y compris le SSPT.
Bien que notre paradigme ne pas plonger dans le plan cognitif et plus complexes aspects comportementaux de stress post-traumatique, nous constatons que les habitudes de sommeil altérés dans le modèle STI 1 correspondent à la difficulté à s'endormir et à rester endormi et les cauchemars de patients atteints de SSPT 11 (DSM-IV-TR SSPT Critères D 13), et les carences en fuite / évitement apprentissage et l'apprentissage d'une tâche appétitive dans le modèle SA
Disclosures
Aucun conflit d'intérêt déclaré.
Acknowledgments
Ce travail a été soutenu par le CDMRP, subventions USUHS G188LE, G188MG et G188QC (HL), et le Centre USUHS pour l'étude du stress post-traumatique.
References
- Adrien, J., Dugovic, C., Martin, P. Sleep-wakefulness patterns in the helpless rat. Physiol. Behav. 49, 257-262 (1991).
- Bai, X., Wu, J., Zhang, Q., Alesci, S., Manoli, I., Blackman, M. R., Chrousos, G. P., Goldstein, A. L., Rennert, O. M., Su, Y. A. Third-generation human mitochondria-focused cDNA microarray and its bioinformatic tools for analysis of gene expression. Biotechniques. 42, 365-375 (2007).
- Blaszczyk, J. W. Startle response to short acoustic stimuli in rats. Acta Neurobiol. Exp. (Wars.). 63, 25-30 (2003).
- Braga, M. F., roniadou-Anderjaska, V., Manion, S. T., Hough, C. J., Li, H. Stress impairs alpha(1A) adrenoceptor-mediated noradrenergic facilitation of GABAergic transmission in the basolateral amygdala. Neuropsychopharmacology. 29, 45-58 (2004).
- Bremner, J. D., Vythilingam, M., Vermetten, E., Anderson, G., Newcomer, J. W., Charney, D. S. Effects of glucocorticoids on declarative memory function in major depression. Biol. Psychiatry. 55, 811-815 (2004).
- Garrick, T., Morrow, N., Eth, S., Marciano, D., Shalev, A. Psychophysiologic parameters of traumatic stress disorder in rats. Ann. N.Y. Acad. Sci. 821, 533-537 (1997).
- Garrick, T., Morrow, N., Shalev, A. Y., Eth, S. Stress-induced enhancement of auditory startle: an animal model of posttraumatic stress disorder. Psychiatry. 64, 346-354 (2001).
- Hsiao, Y. H., Su, Y. A., Tsai, H. D., Mason, J. T., Chou, M. C., Man, Y. G. Increased invasiveness and aggressiveness in breast epithelia with cytoplasmic p63 expression. Int. J. Biol. Sci. 6, 428-442 (2010).
- Jiang, X., Xing, G., Yang, C., Verma, A., Zhang, L., Li, H. Stress Impairs 5-HT(2A) Receptor-Mediated Serotonergic Facilitation of GABA Release in Juvenile Rat Basolateral Amygdala. Neuropsychopharmacology. , (2008).
- Jiang, X., Zhang, Z. J., Zhang, S., Gamble, E. H., Jia, M., Ursano, R. J., Li, H. 5-HT2A receptor antagonism by MDL 11,939 during inescapable stress prevents subsequent exaggeration of acoustic startle response and reduced body weight in rats. J. Psychopharmacol. , (2009).
- Maher, H. K. Sleep deprivation: are you a victim. AAOHN. J. 54, 548 (2006).
- Maier, S. F. Exposure to the stressor environment prevents the temporal dissipation of behavioral depression/learned helplessness. Biol. Psychiatry. 49, 763-773 (2001).
- North, C. S., Suris, A. M., Davis, M., Smith, R. P. Toward validation of the diagnosis of posttraumatic stress disorder. Am. J. Psychiatry. 166, 34-41 (2009).
- Orr, S. P., Metzger, L. J., Pitman, R. K. Psychophysiology of post-traumatic stress disorder. Psychiatr. Clin. North Am. 25, 271-293 (2002).
- Orr, S. P., Roth, W. T. Psychophysiological assessment: clinical applications for PTSD. J. Affect. Disord. 61, 225-240 (2000).
- Pitman, R. K., Orr, S. P., Shalev, A. Y., Metzger, L. J., Mellman, T. A. Psychophysiological alterations in post-traumatic stress disorder. Semin. Clin. Neuropsychiatry. 4, 234-241 (1999).
- Servatius, R. J., Ottenweller, J. E., Natelson, B. H. Delayed startle sensitization distinguishes rats exposed to one or three stress sessions: Further evidence toward an animal model of PTSD. Biological Psychiatry. 38, 539-546 (1995).
- Su, Y. A., Zhang, Q., Su, D. M., Tang, M. X. Rat Mitochondrion-Neuron Focused Microarray (rMNChip) and Bioinformatics Tools for Rapid Identification of Differential Pathways in Brain Tissues. Int. J. Biol. Sci. 7, 308-322 (2011).
- Su, D. M., Zhang, Q., Wang, X., He, P., Zhu, Y. J., Zhao, J., Rennert, O. M., Su, Y. A. Two types of human malignant melanoma cell lines revealed by expression patterns of mitochondrial and survival-apoptosis genes: implications for malignant melanoma therapy. Mol. Cancer Ther. , (2009).
- Identification of stress-responsive genes, canonical pathways, molecular networks and drug targets in brain tissues of human and animals for systems-biology study of post-traumatic stress disorder. Su, Y. A., Li, H., He, P., Webster, M. J., Zhang, Q., Zhang, L., Wang, X., Su, D. M., Ursano, R. J., Rennert, O. M. The DOD Congressionally Directed Medical Research Programs, the third Military Health Research Forum (MHRF), August 31 - September 3, 2009, Hallmark Crown Center, Kansas City, Missouri, , (2009).
- Su, Y. A., Wu, J., Zhang, L., Zhang, Q., Su, D. M., He, P., Wang, B. D., Li, H., Webster, M. J., Rennert, O. M., Ursano, R. J. Dysregulated mitochondrial genes and networks with drug targets in postmortem brain of patients with posttraumatic stress disorder (PTSD) revealed by human mitochondria-focused cDNA microarrays. Int. J Biol. Sci. 4, 223-235 (2008).
- Su, Y. A., Yang, J., Tao, L., Nguyen, H., He, P. Undetectable and Decreased Expression of KIAA1949 (Phostensin) Encoded on Chromosome 6p21.33 in Human Breast Cancers Revealed by Transcriptome Analysis. J. Cancer. 1, 38-50 (2010).
- Yehuda, R., Yang, R. K., Buchsbaum, M. S., Golier, J. A. Alterations in cortisol negative feedback inhibition as examined using the ACTH response to cortisol administration in PTSD. Psychoneuroendocrinology. 31, 447-451 (2006).
- Zhang, Q., Wu, J., Nguyen, A., Wang, B. D., He, P., Laurent, G. S., Rennert, O. M., Su, A. Molecular mechanism underlying differential apoptosis between human melanoma cell lines UACC903 and UACC903(+6) revealed by mitochondria-focused cDNA microarrays. Apoptosis. 13, 993-1004 (2008).
