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Medicine

PTSD के तंत्रिका, hematologic, व्यवहार और संबद्ध खुलासा करने के लिए एक पशु मॉडल में Biomarkers

Published: October 10, 2012 doi: 10.3791/3361
Automatic Translation
1, 2, 1, 1, 1, 2, 1, 1, 2, 1
1Department of Psychiatry, Center for the Study of Traumatic Stress, Uniformed Services University of the Health Sciences, Bethesda, Maryland, 2Department of Gene and Protein Biomarkers, GenProMarkers, Inc.

Summary

हम पोस्ट अभिघातजन्य तनाव (PTSD) विकार है कि neuroendocrine समारोह में लगातार परिवर्तन और देरी दीर्घकालिक, अतिरंजित भय प्रतिक्रिया, PTSD रोगियों की विशेषता का पता चलता है की एक चूहे मॉडल का वर्णन. पशु मॉडल और यहां वर्णित विधियों का मस्तिष्क नाभिक में biomarkers, जो यंत्रवत हैं, लेकिन नहीं मापा जा सकता रोगियों में परिधीय सफेद रक्त कोशिकाओं में biomarkers के साथ, जो कर सकते हैं correlating के लिए उपयोगी होते हैं.

Protocol

1. पशु PTSD के व्यवहार मॉडल

  1. विषय: नर सूरजमुखी मनुष्य Sprague Dawley चूहों (Taconic फार्म, Derwood, एमडी) का इस्तेमाल कर रहे हैं, तनाव प्रोटोकॉल के प्रशासन के समय 200 ग्राम भार 150.
  2. भोजन, पानी का सेवन और शरीर के वजन के मापन: 100 वजन प्रयोगशाला चूहों में आगमन ± 25 ग्राम पर दो एक पिंजरे (: 45x24x20 सेमी पिंजरे का आकार) के लिए रखे जाते हैं. केज padding सब्सट्रेट (woodchips) सप्ताह में दो बार बदल रहे हैं. पशु और सापेक्ष आर्द्रता (30-70%) नियंत्रित वातावरण एक सप्ताह तापमान (22 ± सेल्सियस 4) में एक उलट प्रकाश 12-घंटा चक्र (: 1800/0600 और बंद 0600-1800 पर रोशनी) पर बनाए रखा जाता है प्रयोगों से पहले. जल और मानक pelleted चाउ (Harlan (2018) 18% प्रोटीन कृंतक आहार, ग्लोबल आहार, Harlan Teklad) आज़ादी से घर पिंजरों में उपलब्ध हैं, और दैनिक bodyweights दर्ज कर रहे हैं 3 दिन पहले, दौरान और तनाव की समाप्ति के बाद 3 दिन 3 दिन .
  3. Acclimation: चूहों बो के लिए तीन दिनों के लिए आदतपशु सुविधा और एक ध्वनिक डराना चैम्बर वें. उन्हें ध्वनिक डराना कक्ष acclimate, पशुओं को यह में 5 मिनट के लिए प्रत्येक दिन संभाला लगातार तीन प्रारंभिक मापन के लिए पहले के दिनों के लिए.
  4. प्रोटोकॉल तनावग्रस्त: जानवरों को समान रूप से अपने शरीर के वजन और आधारभूत डराना प्रतिक्रिया के आधार पर प्रत्येक समूह के लिए आवंटित कर रहे हैं. प्रत्येक 16 पशुओं के निर्वाचकगण समूह, परीक्षण पशुओं के दो समूहों पर किया जाता है. समूह 1 तनाव प्रोटोकॉल प्राप्त करता है, और 2 समूह नियंत्रण है.
    तनाव जोखिम प्रोटोकॉल एक सतत प्रक्रिया 2 घंटा, ("अपरिहार्य") जहां प्रत्येक सत्र संयम के होते हैं और पूंछ झटके है, लगातार 3 दिनों में एक दिन में एक बार दोहराया. पर बल देते हुए सुबह में किया जाता है (0800 और 1200 की खिड़की के भीतर). पशु किया जा रहा है एक हवादार plexiglass ट्यूब में immobilized से रोका जाता है. चालीस बिजली के झटके (2 मा 3 सेकंड अवधि; पशु टेस्ट केज ग्रिड तल घिनौना, Coulbourn उपकरण, संयुक्त राज्य अमरीका) 150 टी के अर्द्ध यादृच्छिक अंतराल पर अपनी पूंछ को वितरित कर रहे हैंओ 210 सेकंड (ग्राफिक राज्य संकेतन सॉफ्टवेयर, Habitest यूनिवर्सल लिंक, Coulbourn उपकरण, अमरीका). 2 मा उत्तेजना क्योंकि यह aversive है चुना गया था, लेकिन दर्दनाक नहीं है, जब उत्तेजक उत्पादन experimenter उंगली भर में रखा गया है. इलेक्ट्रोड जेल क्यू की नोक का उपयोग करने के लिए इलेक्ट्रोड और चूहे की पूंछ की त्वचा के बीच जेल के संचालन की एक पतली परत के रूप में लागू किया जाता है. इलेक्ट्रोड क्लिप समायोजित और पूंछ से जुड़ा पूंछ के रक्त परिसंचरण को प्रभावित किए बिना एक अच्छे संबंध सुनिश्चित कर रहे हैं.
  5. ध्वनिक डराना रिस्पांस (ASR): ध्वनिक डराना प्रतिक्रिया माप एक डराना रिस्पांस ध्वनिक टेस्ट सिस्टम (Coulbourn इंस्ट्रूमेंट्स, कोलंबस, ओहियो, संयुक्त राज्य अमरीका) 3 के साथ आयोजित किया गया. इस प्रणाली ध्वनि तनु एक कक्ष में वजन के प्रति संवेदनशील प्लेटफार्मों के होते हैं. डराना प्लेटफार्मों में से प्रत्येक में transducer जो एक तनाव गेज है, का उपयोग करने से पहले जांच की आवश्यकता है. सबसे पहले, युग्मक अंशांकन के लिए डीसी युग्मित मोड में होना चाहिए. इस मोड में, युग्मक उत्पादन directly मंच से इनपुट स्थिर वजन के साथ अंशांकन के लिए आवश्यक मोड निम्नानुसार है. transducer प्रयोगों के दौरान एसी युग्मित मोड के लिए बदल दिया है इतना है कि सेना में केवल तेजी से परिवर्तन, जो डराना प्रतिक्रिया इंगित करता है उत्पादन है. ध्वनि उत्तेजनाओं के जवाब में 'जानवरों के आंदोलनों को इस तरह प्रत्येक मंच अंदर एक तनाव गेज द्वारा एक वोल्टेज परिवर्तन के रूप में मापा और अधिकतम 200 एमएस प्रोत्साहन डराना eliciting की शुरुआत के भीतर होने वाली प्रतिक्रिया के रूप में दर्ज की गई.
    प्रोत्साहन परीक्षणों के छह प्रकार के होते हैं: 100 अकेले डीबी, पूर्व नाड़ी, 110 अकेले DB, पूर्व नाड़ी, पूर्व पल्स अकेले और कोई प्रोत्साहन नियंत्रण के साथ 110 डीबी के साथ 100 DB. प्रत्येक परीक्षण प्रकार आठ बार पेश किया गया. आदेश प्रभाव और habituation से बचने के परीक्षण प्रकार यादृच्छिक क्रम में प्रस्तुत कर रहे हैं. इंटर - परीक्षण के अंतराल 15 से 25 सेकंड के लिए बेतरतीब ढंग से सीमा होती है. आठ परीक्षणों के अलावा केवल अधिकतम मान परिणामों में एकत्र कर रहे हैं और अंत में एक ही दिन के पशु शरीर के वजन के साथ समायोजित. पशु एक दिन ख का परीक्षण कर रहे हैंefore तनाव या एक आधारभूत पढ़ने और 1, 7, 14 और तनाव प्रक्रिया या अन्य उपचार के लगातार 3 दिनों के अंतिम दिन के बाद 21 दिनों के रूप में अन्य उपचार.
  6. डेटा विश्लेषण:
    1. ASR: ध्वनिक डराना प्रतिक्रिया के आयाम परीक्षण हर बार "आधारभूत%" है, जो समीकरण का उपयोग कर की गणना के रूप में प्रतिनिधित्व किया है:% = आधारभूत (निरपेक्ष / आयाम आधारभूत पूर्ण आयाम) ×% 100. प्रत्येक परीक्षण के दिन के लिए दोहराया उपायों के लिए ANOVAs डराना amplitudes पर तनाव की स्थिति और दवा की खुराक (16) SPSS सॉफ्टवेयर का उपयोग कर के कारकों के साथ प्रदर्शन कर रहे हैं. Tukey, Bonferroni, या Dunnett परीक्षण करने के लिए अलग - अलग समूहों के बीच महत्वपूर्ण बाद अस्थायी मतभेद का आकलन किया जाता है. डेटा के रूप में प्रतिनिधित्व कर रहे हैं मतलब ± SEM
    2. विकास: शरीर के वजन और भोजन और पानी की खपत दिन -1 पूर्ववर्ती तनाव और 14 दिन, 21 और 30 के पूरा होने के बाद तनाव प्रोटोकॉल पर मापा जाता है. सांख्यिकीय विश्लेषण: खाद्य और पानी का सेवन डेटा के अधीन हैं एकरास्ते में अंतर का विश्लेषण दोहराया - उपायों (एनोवा). समय पर भोजन की खपत दर में परिवर्तन का विश्लेषण करने के लिए, भोजन का सेवन की मात्रा और विषय के शरीर के वजन से विभाजित है शरीर के वजन में विचरण तनाव प्रोटोकॉल और समूहों के बीच शरीर के वजन में प्रारंभिक अंतर से प्रेरित कम से कम. सभी प्रक्रियाओं संस्थागत पशु की देखभाल और उपयोग समिति (IACUC) के अनुसार में अनुमोदन के तहत आयोजित की जाती हैं.

2. मस्तिष्क विच्छेदन

  1. उपकरण और सामग्री:
    1. संज्ञाहरण जार: "मसाला जार" यह ढक्कन के साथ एक ग्लास जार है, के बारे में 6 इंच ऊंची और apothecary जार "," कपास की गेंद जार ", या के रूप में व्यास में 5 इंच मापने
    2. चूहों ऐसे केंट वैज्ञानिक द्वारा आपूर्ति के रूप में, के लिए गिलोटिन.
    3. 1000 Vibratome:
      1. धार longitudinally आधे में कट, तेल धोने से शराब के साथ, दबाना में डालने.
      2. साधारण कुचल बर्फ के साथ स्नान भरें.
      3. जगहlongitudinally ट्रे.
      4. नमी की ट्रे cyanoacrylate की एक बूंद रखने से पहले साफ कर लें.
    4. Rongeurs (उदाहरण Miltex, बिल्ली से एक माइक्रो फ्राइडमैन rongeur नहीं कर रहे हैं. 17-4801 या ललित विज्ञान उपकरण बिल्ली से एक Pearson rongeur कोई 16015-17).
    5. # 3 या 5 # जौहरी संदंश (बंद ड्यूरा खींच तेज).
    6. तेज अंक (V95-304 सहूलियत एक उदाहरण है) के साथ छोटे कैंची.
    7. (2) एक संतुलन पैमाने पर करने के लिए पाउडर रसायन हस्तांतरण इस्तेमाल किया जैसे फ्लैट स्टेनलेस स्टील मिनी spatulas,. व्यापक अंत तुला आगे है तो telencephalon और calvarium के बीच फिट करने के लिए.
    8. मस्तिष्क ब्लॉक हस्तांतरण चम्मच. (कैफेटेरिया से एक प्लास्टिक सूप चम्मच ठीक काम करता है.)
    9. # 10 स्केल्पल.
    10. डबल बढ़त रेजर ब्लेड (कार्बन स्टील):
      1. एक आधा Vibratome लिए.
      2. विच्छेदन के लिए एक आधा.
    11. दो गिलास पेट्री डिश, ~ 3.5 इंच और 4 इंच व्यास में, जैसे कि एक दूसरे के अंदर फिट बैठता है. ख में कुचल बर्फottom पकवान. शीर्ष डिश में दो फिल्टर कागजात. जरूरी पदों के लिए फिल्टर पेपर हिल द्वारा टुकड़ा ले जाएँ.
    12. 100 मिलीलीटर बीकर.
    13. नेत्र dropper को बर्फ के साथ मस्तिष्क को सिंचाई की सुविधा के एक सी.एस.एफ. ठंडा. (ग्लास पाश्चर विंदुक संकीर्ण 1/2 इंच चौड़ी लेटेक्स रबर बल्ब में डाला अंत के साथ अच्छी तरह से काम करता है.)
    14. के बारे में 5 इंच ऊंची, 20 इंच लंबी, 10 इंच चौड़ी: बर्फ ट्रे कुचल. शामिल हैं:
      1. कुचल बर्फ में सभी उपकरणों को छड़ी.
      2. कम कैल्शियम / प्लास्टिक की बोतल में उच्च मैग्नीशियम aCSF है कि करने के लिए बर्फ को कुचलने टक्कर लगी किया जा सकता है.
      3. Cyanoacrylate.
    15. कम कैल्शियम / उच्च मैग्नीशियम कृत्रिम मस्तिष्कमेरु द्रव (aCSF):
      1. मिमी: 125 NaCl, KCl 2.5, 0.5 2 CACL 2H 2 * हे, 2.0 2 MgCl 6H * 2 1.2 0, नाह 2 4 पीओ * एच 2 हे, NaHCO 25, 11 ग्लूकोज.
      2. प्लास्टिक की बोतल में है कि करने के लिए बर्फ को कुचलने टक्कर लगी जा सकता है.
      3. -80 में 20 मिनट के लिए शांत डिग्री सेल्सियस फ्रीजर यह एक कीचड़ में बनाने के लिए.
    16. कपास swabs.
    17. फिल्टर पेपर वाटमान 42.5 मिमी (कैट नहीं 042 1001.):.
    18. मिनी अपकेंद्रित्र ट्यूब ऊतक के छोटे वर्गों को इकट्ठा करने के लिए.
    19. वेल्स को बड़ा संरचनाओं और ऊतक के वर्गों इकट्ठा थाली.
    20. कागज तौलिया.
    21. लाल biohazard बैग.
  2. अनेस्थेसिया:
    1. संज्ञाहरण जार, धुंध पैड, isoflurane, धातु संदंश, एक धूआं हुड में तैनात हैं.
    2. चूहा संज्ञाहरण जार में रखा गया है.
    3. Isoflurane और संज्ञाहरण जार में जगह के साथ धुंध पैड गीला हो जाना.
    4. पेडल पलटा तक रुको - पंजा की वापसी जब वेब संदंश के साथ pinched है या corneal पलटा गायब हो जाता है.
    5. सिर काटना: पीछे से छाती के आसपास एक हाथ के साथ चूहे लोभी, संभव के रूप में डब करने के लिए पास के रूप में गिलोटिन के साथ चूहे का सिर काटना. एटलस अभी भी आमतौर पर खोपड़ी से जुड़ा रहेगा.
    6. रक्त संग्रह: छाती में निचोड़ चूहे मन्या धमनियों से spurting से खून को रोकने के लिए.धीरे - धीरे पकड़ आराम के रूप में तो संग्रह कंटेनर में रक्त के प्रवाह को नियंत्रित करने के लिए.
  3. मस्तिष्क के हटाने:
    1. जल्दी से छोटे कैंची से काटना साथ basiocciput से मांसपेशियों और किसी भी शेष कशेरुकाओं दूर कटौती.
    2. रंध्र मैग्नम rongeur और शुरुआत का प्रयोग, दूर पश्चकपाल condyles और basiocciput में कटौती.
    3. स्केलपेल के साथ midline खोपड़ी चीरा.
    4. कैंची का प्रयोग, पश्चकपाल और पार्श्विका हड्डियों में एक मध्य बाण के समान चीरा में कटौती. Rongeurs साथ खोपड़ी की कटौती मार्जिन लोभी, इसे तोड़ने के एक अंडे का खोल की तरह वापस midline से दूर, सावधान किया जा रहा करने के लिए मस्तिष्क के साथ किसी भी संपर्क कम से कम. midline कट और तोड़ वापस चरणों में किया जा सकता है.
    5. के रूप में मस्तिष्क आगे उजागर हो रहा है, यह यह बर्फ ठंडा aCSF के साथ पानी में गोता लगाना अखंडता और ऊतकों के जीवन शक्ति को बनाए रखने के लिए महत्वपूर्ण है.
    6. इसी तरह दूर लौकिक और ललाट हड्डियां टूट.
    7. ठीक संदंश के साथ, आंसू दूर ड्यूरा, पाने के लिए सुनिश्चित कर रही हैtentorum अनुमस्तिष्क.
    8. मिनी ललाट लोब के नीचे डाला calvarium से मस्तिष्क बस कपाल नसों पर तनाव डाल पर्याप्त जुटाने के रंग के साथ.
    9. कैंची से काटना के साथ कपाल नसों आड़ा काट.
    10. मस्तिष्क पूरी तरह से खोपड़ी और लिफ्ट आइस्ड कम कैल्शियम / उच्च मैग्नीशियम aCSF के बीकर में ड्रॉप. एक मिनट या अधिक छोड़ दो इतना शांत है कि ऊतक ठोस होगा, स्पष्ट रूप से दिखाई दे संरचनाओं, और ऊतक के स्वास्थ्य को संरक्षित किया जाएगा.
    11. प्लास्टिक के चम्मच के साथ, फिल्टर पेपर पर बर्फ ठंडा पेट्री डिश में मस्तिष्क, उदर पक्ष हस्तांतरण ऊपर.
  4. मस्तिष्क के विच्छेदन:
    1. मध्य मस्तिष्क धमनी (2A चित्रा) में एक धार के साथ राज्याभिषेक transection बनाओ.
    2. बर्फ में अस्थायी रूप से ललाट लोब सहेजें 100 मिलीलीटर बीकर में कम कैल्शियम / उच्च मैग्नीशियम aCSF ठंडा.
    3. मस्तिष्क फ्लिप इतना है कि पृष्ठीय सतह है. मध्यमस्तिष्क के एक मोड़ पर brainstem आड़ा काटएन डी diencaphalon. परिणामस्वरूप मस्तिष्क ब्लॉक चित्रा 2B में देखा जाता है.
    4. अवरुद्ध मस्तिष्क आइस्ड कम कैल्शियम / उच्च मैग्नीशियम aCSF में वापस ड्रॉप.
    5. मिनी spatulas का प्रयोग, मज्जा / पोंस से सेरिबैलम काटना. इरादा विश्लेषण के लिए उपयुक्त मीडिया में सहेजें.
    6. पेट्री डिश अवरोधित मस्तिष्क लौटें. दो फिल्टर कागजात का प्रयोग करते हैं, ventrum पर एक फिल्टर पेपर रखने के द्वारा मस्तिष्क उठा. इसके साथ, दूसरा फिल्टर पेपर के किनारे पर अवरुद्ध मस्तिष्क के पीछे राज्याभिषेक विमान जगह है. पर अवरुद्ध कर मस्तिष्क Vibratome काटने प्लेट पर cyanoacrylate की एक बूंद के पूर्वकाल कटौती विमान इस फिल्टर पेपर जगह के साथ, प्रांतस्था ब्लेड का सामना करना पड़ रहा है.
    7. इतना है कि Vibratome के साथ काट दिया सिर्फ दुम का मस्तिष्क के लिए पर्याप्त hippcampus शो (चित्रा 2C).
    8. एक अनुभाग ले लो, 2400 μ 125 ग्राम चूहे, 2700 μ 200 ग्राम चूहे में मोटी मोटी. पेट्री डिश पर फिल्टर कागज पर एक कपास झाड़ू का उपयोग कर खंड स्थानांतरित(चित्रा 2 डी).
    9. काटें और रेजर ब्लेड के साथ सिंगुलेट प्रांतस्था को बचाने.
    10. एक दंत चिकित्सा रंग के साथ, कोष callosum के लिए यह कटौती बाहर का धार में, तो isocortex छील धक्का.
    11. अपने ventolateral मार्जिन से हिप्पोकैम्पस (चित्रा 2 ई) से दूर छील.
    12. मध्यमस्तिष्क सहेजें.
    13. एक दूसरे अनुभाग, 2400 सुक्ष्ममापी 120 ग्राम चूहे में मोटी, 2500 सुक्ष्ममापी 200 ग्राम चूहे में मोटी लो. पेट्री डिश (चित्रा 2 एफ) पर फिल्टर कागजात पर अनुभाग रखें. वैकल्पिक रूप से, पाँच 500 सुक्ष्ममापी वर्गों इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी के लिए इस बिंदु पर ले जाया जा सकता है.
    14. काटें और रेजर ब्लेड के साथ सिंगुलेट प्रांतस्था को बचाने.
    15. आंतरिक कैप्सूल में धार के साथ पार्श्व में कटौती करने के लिए हटा isocortex (चित्रा 2 एफ).
    16. धार के साथ परोक्ष कटौती हटा amygdali (चित्रा 2 एफ, जी).
    17. एक धार के साथ कटौती करने के लिए hypothalamus हटाने बॉक्स. पार्श्विककटौती hypothalamus है, जो दिखाई देता है ventromedial नाभिक पार्श्व हैं. हम 3 निलय या वेंट्रल टेगमेंटल क्षेत्र (2H चित्रा) बस के ऊपर पृष्ठीय कटौती बनाते हैं.
    18. महासंयोजिका में रंग पुश और दूर खींच isocortex के छोटे टुकड़े हिप्पोकैम्पस से जुड़ी. Hippocampal संयोजिका उदर रंग की संकीर्ण अंत प्लेस और पीछे की ओर बढ़ाने के लिए बंद हिप्पोकैम्पस खींच.
  5. शाही सेना के संरक्षण और मस्तिष्क के ऊतकों और रक्त के नमूनों में प्रोटीन:
    1. आरएनए परख के लिए मीडिया:
      1. ब्रेन: RNAlater आरएनए स्थिरीकरण अभिकर्मक, # Eppendorf ट्यूब में 76106.
      2. रक्त: PAXgene रक्त आरएनए ट्यूब (PreAnalytix, Quagen).
    2. खून से प्रोटीन परख (कॉर्ट) के लिए मीडिया: समाधान D-HbSS, w / ओ सीए 2 + और मिलीग्राम 2 +, (गुणवत्ता जैविक, इंक).
    3. संग्रहण:
      1. एकत्र मस्तिष्क के ऊतकों में पहली बार कोई 12 से अधिक घंटे के लिए सूखी बर्फ की एक टोकरी में जमा हो जाती है और फिर एक -70 ° C फ्रीजर में6 महीने, अध्ययन की अवधि के भीतर उपयोग के लिए.
      2. एकत्र रक्त अभिकर्मकों घुसना, जिसके बाद यह 6 महीने के भीतर उपयोग, अध्ययन की अवधि के लिए एक -70 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर में संग्रहीत किया जाता है की अनुमति रात कमरे के तापमान पर रखा जाता है.

3. Mitochondrial और Mitochondria से संबंधित परमाणु जीन की जीन माइक्रोएरे

मस्तिष्क के ऊतकों में चूहे mitochondrial कार्यों का अध्ययन करने के लिए, हम हाल ही में चूहे mitochondrion न्यूरॉन केंद्रित (rMNChip) माइक्रोएरे और 18 मस्तिष्क के ऊतकों में अंतर रास्ते की तेजी से पहचान के लिए जैव सूचना विज्ञान उपकरण विकसित किया है. 1500 rMNChip mitochondrial काम करता है, तनाव प्रतिक्रिया, circadian लय और संकेत पारगमन में शामिल जीन होते हैं. जैव सूचना विज्ञान उपकरण विभिन्न व्यक्त जीनों की कंप्यूटिंग के लिए एक एल्गोरिथ्म, और माइक्रोएरे परिणामों के लिए सरल और सहज व्याख्या के लिए एक डेटाबेस में शामिल हैं.

  1. Purificatioऊतकों से कुल शाही सेना के n (# 2011-1 जीपीएम किट बिल्ली, GenProMarkers):
    1. शाही सेना में विशिष्ट नाभिक का चूहा मस्तिष्क के ऊतकों बाद स्थिरीकरण अभिकर्मक (Qiagen) शाही सेना.
    2. ऊतक (600 μl बफर / जीपीएम एल बी में 30 मिलीग्राम) homogenization T8 अल्ट्रा Turrax Dispergierstation (IKA Labortechnik) का उपयोग.
    3. Sorvall 15 मिनट के लिए 21,000 rpm पर 1.5 मिलीलीटर ट्यूब में अपकेंद्रित्र.
    4. एक संग्रह 2 मिलीलीटर ट्यूब के साथ एक स्पिन स्तंभ में तैरनेवाला छानना.
    5. 3 मिनट के लिए 15,000 rpm पर स्तंभ ट्यूबों अपकेंद्रित्र, प्रवाह के माध्यम से त्यागें.
    6. स्पिन स्तंभों की प्रत्येक के लिए 700 μl जीपीएम बी / डब्ल्यू बफर जोड़ें, 15 सेकंड के लिए 16,000 rpm पर स्तंभ ट्यूब, अपकेंद्रित्र प्रवाह के माध्यम से त्यागें.
    7. स्पिन स्तंभों की प्रत्येक के लिए 500 μl जीपीएम-W बफर जोड़ें, 15 सेकंड के लिए 16,000 rpm पर स्तंभ ट्यूब, अपकेंद्रित्र एक बार फिर दोहराना.
    8. एक नया 1.5 मिलीलीटर संग्रह ट्यूब में स्पिन स्तंभ रखें.
    9. स्पिन स्तंभों की प्रत्येक के लिए 30 μl DEPC का इलाज पानी जोड़ें, rpm १६००० पर अपकेंद्रित्र के लिए1 मिनट, एक बार फिर दोहराना.
    10. आरएनए एकाग्रता को मापने, DNase और RNase मुफ्त पानी के साथ 1 ग्राम / μl एकाग्रता को समायोजित करने के लिए, नमूने माइक्रोएरे लेबलिंग के लिए तैयार कर रहे हैं.
  2. माइक्रोएरे लेबलिंग और संकरण (बिल्ली # 900 सरणी, Genisphere):
    1. 1.0 ग्राम चूहे कुल शाही सेना सीडीएनए संश्लेषण और निर्माता के निर्देशों का पालन माइक्रोएरे लेबलिंग के लिए प्रयोग किया जाता है.
    2. माइक्रोएरे संकरण एक rMNChip पर 65 डिग्री सेल्सियस पर आयोजित किया जाता है 12-16 घंटे के लिए पहले से वर्णित 18.
  3. वॉशिंग hybridized माइक्रोएरे स्लाइड (बिल्ली # GPM0101-6, GenProMarkers):
    समाधान धुलाई खंड एक्स 20 एसएससी 10% एसडीएस DDH 2 हे
    0.5 एक्स SSC/0.01 एसडीएस 500 मिलीलीटर 12.5 मिलीलीटर 0.5 मिलीलीटर 500 मीटर के लिएएल
    0.5 एक्स एसएससी 500 मिलीलीटर 12.5 मिलीलीटर 500 मिलीलीटर तक
    0.1 एक्स एसएससी 500 मिलीलीटर 2.5 मिलीलीटर 500 मिलीलीटर तक
    0.01 एक्स एसएससी 500 मिलीलीटर 0.25 मिलीलीटर 500 मिलीलीटर तक

    धोने के दौरान स्लाइड्स प्रकाश से संरक्षित किया जाना चाहिए. स्लाइड्स के किसी भी चरण में बाहर सूखी मत देना.
    1. कमरे के तापमान पर एक BioShaker एमओ (आण्विक टेक्नोलॉजीज इंक, सेंट लुइस, जार आंदोलन द्वारा: एक कांच coplin जार में 250 मिलीलीटर 1 (70312-20, इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी विज्ञान, Hatfield, PA # बिल्ली) समाधान में स्लाइड धोने ) कवर फिसल जाता है जब तक सभी बंद कांच स्लाइड (<3 मिनट लगते हैं) गिर जाते हैं.
    2. एक और जार में 250 मिलीलीटर 2 समाधान के साथ 3 मिनट के लिए जार आंदोलन स्लाइड्स धो लें.
    3. 250 मिलीलीटर 3 समाधान के साथ स्लाइड्स धो3 मिनट के लिए जार घूर्णन, इस कदम को दो बार दोहरा द्वारा एक और जार में.
    4. 10 सेकंड के लिए एक और जार में 250 मिलीलीटर 4 समाधान के साथ स्लाइड्स धो लें. तुरंत एक Sorvall सुपर T21 अपकेंद्रित्र में PN11779 प्लेटें और अनुसूचित जनजाति H750 रोटर पर 5 मिनट के लिए 1000 rpm पर रखा जार centrifuging द्वारा स्लाइड्स सूखी.
    5. जितनी जल्दी हो सके स्कैनिंग के लिए एक बॉक्स में धोया स्लाइड रखें.
  4. माइक्रोएरे छवि स्कैन और अनुदेश पुस्तिका और पर ध्यान केंद्रित करने के बाद ScanArray एक्सप्रेस माइक्रोएरे स्कैनर (PerkinElmer) का उपयोग करते हुए विश्लेषण:
    1. माइक्रोएरे छवि स्कैनिंग: प्रोटोकॉल स्कैनिंग बनाम आसान स्कैन.
    2. लेजर डेटा परिणामों पर बिजली PMT, और सामान्य तरीकों के प्रभाव.
    3. लड़की फ़ाइल की छवि पर संरेखण.
    4. ठीक करने के लिए स्पॉट ग्रिड के संरेखण.
  5. डेटा विश्लेषण: माइक्रोएरे डेटा विश्लेषण के लिए अनुकूलित कम्प्यूटेशनल प्रक्रियाओं माइक्रोएरे छवि मूल्यांकन, डेटा फ़िल्टरिंग, स्थान आकार सुधार, शामिल किए जाने, normalization और तुलना के रूप में पहले से वर्णित 18. इसके अलावा, आंटलजी मार्ग, और नेटवर्क विश्लेषण के लिए तरीकों के रूप में वही कर रहे हैं पहले से वर्णित क्रम में प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य और निरीक्षण माइक्रोएरे 2 परिणाम, 22, 25, 19, 20, 8, 23, 18 की पीढ़ी को आश्वस्त.

4. रक्त का नमूना संग्रह और प्लाज्मा कॉर्ट एकाग्रता मापन

  1. Anesthetized जानवरों से पूर्व या बाद तनाव पूंछ रक्त के नमूनों के दिवस-1 पर एकत्र होते हैं, परिसंचारी कॉर्ट स्तर के निर्धारण के लिए 21 14, और heparinized ट्यूब में 30.
  2. ट्रंक रक्त के नमूने भी heparinized ट्यूबों में एकत्र कर रहे हैं के बाद पशुओं euthanized हैं. प्लाज्मा निकाले और संग्रहीत सी -70 में जब तक ° विश्लेषण.
  3. प्लाज्मा निकासी के लिए मीडिया:
    1. शाही सेना निष्कर्षण के लिए रक्त के नमूने PAXgene रक्त आरएनए ट्यूब (PreAnalytix, Quagen) का उपयोग कर एकत्र कर रहे हैं
    2. डीएनए निष्कर्षण के लिए रक्त के नमूने PAXgene रक्त डीएनए ट्यूबों (PreAnalytix, Quagen) का उपयोग कर एकत्र कर रहे हैं. प्रोटीन विश्लेषण के लिए रक्त के नमूने से MaketLab # ML5601 लिथियम हेपरिन केशिका संग्रह ट्यूब (200 μl) का उपयोग कर एकत्र कर रहे हैं.
  4. प्लाज्मा कॉर्ट एकाग्रता का परीक्षण और विश्लेषण के रूप में निम्नानुसार सक्रिय चूहा Cort ईआईए (निदान सिस्टम्स लैब्स इंक के साथ http://www.beckmancoulter.com/ ):
    1. मार्क microtitration करने के लिए इस्तेमाल किया जा स्ट्रिप्स.
    2. चूहा कॉर्ट एनजाइम संयुग्मी समाधान में संयुग्म तनुकारक (वस्तु) में चूहा कॉर्ट एनजाइम संयुग्म ध्यान कमजोर द्वारा तैयार करो.
    3. पिपेट 25 μl मानक, नियंत्रण, और कुओं में Unknowns.
    4. 100 μl एनजाइम संयुग्म एक अच्छी तरह से समाधान अर्द्ध स्वचालित एक मशीन का उपयोग कर जोड़ें. धीरे अच्छी तरह धारक 5-10 सेकंड नल.
    5. अच्छी तरह से एक मशीन अर्द्ध स्वचालित का उपयोग कर प्रत्येक के लिए 100 μl चूहा कॉर्ट सीरमरोधी जोड़ें.
    6. कमरे के तापमान 25 डिग्री सेल्सियस पर कुओं 500-700 rpm पर 60 मिनट के लिए एक प्रकार के बरतन सेट पर सेते हैं.
    7. Aspirate और प्रत्येक wel धोनेएल धो एक स्वचालित microplate वॉशर का उपयोग कर समाधान के साथ 5 बार. शोषक सामग्री पर inverting प्लेट द्वारा शुष्क ब्लाट.
    8. अच्छी तरह से एक मशीन अर्द्ध स्वचालित का उपयोग कर प्रत्येक TMB वर्णकोत्पादक समाधान के 100 μl जोड़ें.
    9. एक कक्षीय microplate हिलनेवाला पर कमरे के तापमान 15-20 मिनट 500-700 rpm पर सेट पर सेते हैं. रंग बदलने के देखो.
    10. 100 μl रोक रहा है प्रत्येक अर्द्ध स्वचालित एक मशीन का उपयोग अच्छी तरह से करने के लिए समाधान जोड़ें.
    11. हाथ 5-10 सेकंड के द्वारा थाली हिला.
    12. 30 मिनट के भीतर अच्छी तरह से में समाधान की absorbance पढ़ें.
    13. तक 450 एनएम पर सेट कर दिया जाता है. * ईआईए किट भी Immunobiological लेबोरेटरीज (पर खरीदा जा सकता है -america.com www.ibl ).

5. प्रतिनिधि परिणाम

चित्रा 1
चित्रा 1. चूहे स्र्द्ध और पूंछ सदमे को उजागर कर रहे हैं. बाद में शरीर के वजनमापा जाता है, प्लाज्मा corticosterone एकाग्रता, और ध्वनिक डराना प्रतिक्रिया एक: तनाव एक्सपोजर: पशु किया जा रहा है एक हवादार plexiglass ट्यूब में immobilized रोका जाता है. चालीस बिजली के झटके (2 एमए, 3 सेकंड अवधि ;) 150 210 सेकंड बी और सी के अर्द्ध यादृच्छिक अंतराल पर अपनी पूंछ को वितरित कर रहे हैं: तनाव शरीर के वजन में वृद्धि के दौरान retards लाभ: शरीर के वजन और भोजन और पानी की खपत मापा जाता है तुरंत (-3 दिन) तनाव का तीन दिनों के दिन पर तनाव, पहले और फिर वहाँ 14 दिन के बाद हर दूसरे दिन. तनाव के दौरान शरीर के वजन के लाभ की कमी कभी नहीं मुआवजा डी है: तनाव बढ़ता प्लाज्मा corticosterone एकाग्रता ई: ध्वनिक डराना: पशु एक आधारभूत पढ़ने और 12 दिनों के अंतिम दिन के बाद तनाव से पहले एक दिन (दिन-1) का परीक्षण कर रहे हैं तनाव के लगातार 3 दिनों. तनाव और नियंत्रण - प्रत्येक समूह के लिए डेटा ध्वनिक के प्रतिशत के रूप में व्यक्त कर रहे हैंदिन पर 12 -1 दिन रिश्तेदार डराना. तनाव स्पष्ट रूप से ध्वनिक डराना पलटा बढ़ जाती है. बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें .

चित्रा 2
चित्रा 2 प्रमस्तिष्कखंड, हिप्पोकैम्पस, और मस्तिष्क टुकड़ा से hypothalamus के विच्छेदन एक:. चूहा मस्तिष्क, उदर दृश्य: तीर मध्य मस्तिष्क धमनियों को इंगित बी: मस्तिष्क ब्लॉक, उदर देखने के लिए, को Vibratome तक ले जाया जा तैयार. सी: मस्तिष्क vibratome ट्रे, दुम का पक्ष चिपके ब्लॉक, प्रांतस्था ब्लेड का सामना करना पड़ रहा है. दुम का मस्तिष्क पहले से ही दूर में कटौती की गई है लांगुलिय हिप्पोकैम्पस उजागर. ब्लॉक अब 2500 सुक्ष्ममापी लिया जा हिप्पोकैम्पस के प्रमुख हिस्सा युक्त टुकड़ा विकास के लिए तैयार है: 2500 सुक्ष्ममापी मोटी टुकड़ा लांगुलिय हिप्पोकैम्पस युक्त ई: टी.वह isocortex (आईएसओ) (एचसी) हिप्पोकैम्पस और मध्यमस्तिष्क से खुली हिप्पोकैम्पस से खुली है: एफ. 2500 सुक्ष्ममापी मोटी टुकड़ा प्रमस्तिष्कखंड और व्याख्यान चबूतरे वाला हिप्पोकैम्पस युक्त जी: isocortex excised किया गया है और प्रमस्तिष्कखंड resected (Amyg) एच: hypothalamus (एचटी) excised है और विस्थापित बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें .

चित्रा 3
चित्रा 3. Glucocorticoid रिसेप्टर (जीआर) और प्रमस्तिष्कखंड में minerocorticoid रिसेप्टर (एमआर), हिप्पोकैम्पस, hypothalamus, और (सी, नियंत्रण) के पहले और बाद में ललाट प्रांतस्था (Str) तनाव पूंछ सदमे की mRNA के लिए अभिव्यक्ति के स्तर. इकाइयों नियंत्रण के अनुपात में कर रहे हैं, सलाखों के एक SEM हैं: Amygdala: तनाव minerocorticoid रिसेप्टर mRNA अभिव्यक्ति कम हो जाती है बी: हिप्पोकैंपस: तनाव increa.सत्र minerocorticoid रिसेप्टर mRNA अभिव्यक्ति सी: Hypothalamus: तनाव minerocorticoid रिसेप्टर mRNA अभिव्यक्ति बढ़ डी: ललाट प्रांतस्था: तनाव glucocorticoid रिसेप्टर mRNA अभिव्यक्ति के रूप में के रूप में अच्छी तरह से minerocorticoid रिसेप्टर mRNA अभिव्यक्ति कम हो जाती है.

(121bp) चूहा जीआर के लिए पीसीआर प्राइमरों हैं: 1f.CCACTGCAGGAGTCTCACAA
1rAACACCTCGGGTTCAATCAC
के लिए चूहा एमआर (99 बीपी) पीसीआर प्राइमरों हैं: 1f.GCCTTCAGCTATGCCACTTC
1rAACGTCGTGAGCACCTTTCT

चित्रा 4
चित्रा 4. क्लस्टर और शाही सेना के heatmap विभिन्न प्रकार से 64 5 चूहे के मस्तिष्क के ऊतकों से निकाली गई (सीएल) सेरिबैलम, मस्तिष्क (सीआर), ललाट प्रांतस्था (एफसी), hypothalamus (हिंदुस्तान टाइम्स), और हिप्पोकैम्पस (एचसी) सहित जीन से व्यक्त की है. रंग नक्शा घ में गुना परिवर्तन का संकेतखुद की (हरा) और ऊपर (लाल) व्यक्त जीनों. (ए) क्लस्टर और 64 15 माइक्रोएरे प्रयोगों से इन पाँच मस्तिष्क के ऊतकों के लिए प्राप्त जीन में से प्रत्येक के लिए 9 माप की सामान्यीकृत संकेत तीव्रता के heatmap. प्रत्येक जीन की अभिव्यक्ति तकनीकी triplicates और प्रयोगात्मक triplicates द्वारा मापा गया था. (बी) और 64 जीनों में से प्रत्येक के इन 9 माप का मतलब शाही सेना के स्तर के क्लस्टर heatmap. इन परिणामों mitochondrial जीन की अभिव्यक्ति और इसलिए संबंधित कार्य करता है, जो हमारी परिकल्पना का समर्थन है कि अलग मस्तिष्क क्षेत्रों विभिन्न ऊर्जा की मांग में स्पष्ट मतभेद दिखा. बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें .

हमारे rMNChip और Bioinformatic उपकरण के आवेदन एक क्लस्टर और विभिन्न व्यक्त 5 चूहा (सीएल) सेरिबैलम, मस्तिष्क (सीआर), ललाट (एफसी) प्रांतस्था, hypotha सहित मस्तिष्क के ऊतकों से निकाली गई शाही सेना के साथ heatmap 64 जीन की पहचान करने के लिए नेतृत्व(एचटी) lamus और हिप्पोकैम्पस (एचसी) (चित्रा 4). इन आंकड़ों mitochondrial जीन की अभिव्यक्ति है और इसलिए संबंधित कार्यों में स्पष्ट मतभेद प्रदर्शित करता है. परिणाम दर्शाते हैं कि अलग मस्तिष्क क्षेत्रों में ऊर्जा के विभिन्न राशि की मांग के क्रम में इसी मस्तिष्क कार्यों से बाहर ले जाने के लिए.

Discussion

PTSD के निदान स्वयं रिपोर्ट संभावित विषयों द्वारा मनोरोग के लक्षण (DSM चतुर्थ) पर आधारित है. वर्तमान में कोई अच्छी तरह से परिभाषित biomarker संभावित PTSD रोगियों pathophysiological स्थिति का उपयोग करने के लिए उपलब्ध है. PTSD एक जीवन दर्दनाक घटनाओं धमकी और मुख्य मनोरोग के लक्षण भी महीनों और वर्षों के लिए प्रारंभिक घटनाओं के बाद उत्तरजीवी जीवन में मौजूद रहते हैं द्वारा उत्तेजित विकार है. सबसे प्रमुख और लगातार PTSD के साथ रोगियों में पता चला लक्षण hypervigilance, देरी अतिरंजित डराना 14 प्रतिक्रिया, 15, 16 और HPA अक्ष के एक स्पष्ट समझौता कर रहे हैं. इन लक्षणों मनुष्यों में रहते हैं, या दर्दनाक stressor 24 की समाप्ति के बाद तीन महीने की देरी के साथ दिखाई देते हैं. हमारे PTSD के biomarker अध्ययन के लिए वर्तमान मॉडल संयम और पूंछ झटके लगातार तीन दिनों (40, 2 मा tailshocks सत्र 2-घंटा) के लिए दोहराया 150 ग्राम वजन चूहों में अपरिहार्य मॉडल पूंछ झटका (आईटीएस) कार्यरत हैं. यह अपने मॉडल हैकिया गया है एक हद तक पर्याप्त 17 PTSD के pathophysiology, 7, 4, 10 की नकल करने के लिए दिखाया गया है. हमारी प्रयोगशाला और अन्य प्रयोगशालाओं सत्यापित किया है कि चूहों में तनाव के मॉडल व्यवहार और neurobiological परिवर्तन कि PTSD विषयों 17, 7, 10, 9 में पाया उन लोगों के लिए समान हैं लाती. विशेष रूप से, इन पर बल दिया चूहों एक्ज़िबिट (1) एक देरी और अतिरंजित डराना प्रतिक्रिया stressor समाप्ति के बाद कई दिनों दिखने, है जो चूहा जीवन के संकुचित समय एक मनुष्य की तुलना में बड़े पैमाने दिया एक से तीन लक्षण PTSD रोगियों महीनों में देरी करने के लिए मेल खाती है (DSM-IV-टी.आर. PTSD Criterian डी / ई 13), (2) stressor के बाद कई दिनों (10), hypothalamopituitary अक्ष (hPa) के समझौते का संकेत है, और (3) मंद शरीर के वजन के लिए बढ़ाया प्लाज्मा corticosterone (कॉर्ट) समाप्ति, PTSD के चयापचय विनियमन की शिथिलता इसी. वहाँ साहित्य में कोई सबूत नहीं है कि लोमड़ी गंध, शिकारी, या जोखिम potentiated डराना प्रतिक्रिया, exhi डर हैथोड़ा इन लगातार व्यवहार और neuroendocrinologic phenotypes PTSD के साथ जुड़ा हुआ है.

एक एकल तनाव सत्र (1DS) उजागर चूहे क्षणिक प्रदर्शन किया है, लेकिन वर्तमान प्रयोग 3DS और 4 1DS चूहों, 7, और stressor समाप्ति के बाद 10 दिनों के डराना प्रतिक्रिया लगातार 3DS चूहों 17 के द्वारा प्रदर्शित असामान्यताएं तुलना नहीं की. लगातार पिछले काम के साथ पर बल दिया, चूहों ऊंचा बेसल प्लाज्मा कॉर्ट स्तर 1 दिन के बाद 17 तनाव का प्रदर्शन किया. इन कॉर्ट स्तर उच्च 3DS चूहों में कॉर्ट के स्तर साथ stressor जोखिम के 1DS चूहों की तुलना में अधिक संख्या के प्रति संवेदनशील थे. डराना प्रतिक्रिया के लिए के रूप में, 1DS चूहों एक अतिरंजित डराना प्रतिक्रिया 7 दिनों के बाद stressor प्रदर्शन, जबकि डराना संवेदीकरण ही स्पष्ट 3DS चूहों में 10 दिनों के बाद तनाव हो जाता है. इस प्रकार, stressor समाप्ति के बाद एक अतिरंजित डराना प्रतिक्रिया की उपस्थिति तनाव सत्र जोखिम की संख्या से संबंधित होता है. 3DS बल दिया मॉडल करने के लिए प्रकट होता हैPTSD के लक्षण और कुंजी औसत दर्जे का व्यवहार phenotypes तनाव की समाप्ति के बाद समय के साथ जुड़े के साथ जुड़े बायोमार्कर के बदल अभिव्यक्ति में अंतर्दृष्टि हासिल करने के लिए उपयोगी हो सकता है. जीनोमिक परिणाम प्रस्तुत सिद्धांत का rMNChip और जैव सूचना विज्ञान उपकरण को लागू करने के लिए अंतर रास्ते, और जीन और प्रोटीन biomarkers, जो बहुत सिस्टम जैविक और आणविक जटिल और multifactorial PTSD सहित neurologic विकारों अंतर्निहित तंत्र के अध्ययन समझ की सुविधा होगी की पहचान करने के लिए सबूत प्रदान.

जबकि हमारे प्रतिमान संज्ञानात्मक और PTSD के और अधिक जटिल व्यवहार सभी पहलुओं में तल्लीन करना नहीं है, हम ध्यान दें कि अपनी 1 मॉडल में बदल नींद पैटर्न कठिनाई गिरने और सो रह और PTSD रोगियों 11 (DSM-IV-टी.आर. PTSD के बुरे सपने के अनुरूप मानदंड 13 डी), और / भागने की परिहार सीखने और अपने मॉडल में एक क्षुधावर्धक कार्य के सीखने में कमी 5 (DSM-IV-टी.आर. PTSD मानदंड 13 सी) PTSD के गरीब सांद्रता और स्मृति घाटे के लिए 12 से मेल खाती है. मौजूदा मॉडल महत्वपूर्ण PTSD के लक्षण लक्षण के साथ अच्छी तरह से संबद्ध और PTSD के परिधीय biomarkers correlating के लिए एक अच्छा मॉडल है, जो रोगियों से एकत्र किया जा सकता है, केंद्रीय, यंत्रवत biomarkers के साथ कर सकते हैं जो नहीं 6 प्रदान करता है.

Disclosures

ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.

Acknowledgments

यह काम CDMRP, USUHS अनुदान G188LE, G188MG, और G188QC (एच. एल), और USUHS अभिघातजन्य तनाव के अध्ययन के लिए केंद्र द्वारा समर्थित किया गया.

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चिकित्सा अंक 68 जेनेटिक्स फिजियोलॉजी तंत्रिका विज्ञान इम्यूनोलॉजी PTSD biomarker तनाव भय डराना corticosterone पशु मॉडल आरएनए RT-पीसीआर जीन चिप सीडीएनए माइक्रोएरे oligonucleotide माइक्रोएरे प्रमस्तिष्कखंड prefrontal प्रांतस्था हिप्पोकैम्पस सिंगुलेट प्रांतस्था hypothalamus सफेद रक्त कोशिकाओं
PTSD के तंत्रिका, hematologic, व्यवहार और संबद्ध खुलासा करने के लिए एक पशु मॉडल में Biomarkers
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Jia, M., Meng, F., Smerin, S. E.,… More

Jia, M., Meng, F., Smerin, S. E., Xing, G., Zhang, L., Su, D. M., Benedek, D., Ursano, R., Su, Y. A., Li, H. Biomarkers in an Animal Model for Revealing Neural, Hematologic, and Behavioral Correlates of PTSD. J. Vis. Exp. (68), e3361, doi:10.3791/3361 (2012).

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