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Medicine

PTSD의, 신경 Hematologic, 그리고 행동 상관 관계를 누설하는 행위에 대해서는 동물 모델에서 생체

Published: October 10, 2012 doi: 10.3791/3361
Automatic Translation
1, 2, 1, 1, 1, 2, 1, 1, 2, 1
1Department of Psychiatry, Center for the Study of Traumatic Stress, Uniformed Services University of the Health Sciences, Bethesda, Maryland, 2Department of Gene and Protein Biomarkers, GenProMarkers, Inc.

Summary

우리는 PTSD 환자의 특징 neuroendocrine 기능의 영구적 인 변경 및 지연, 장기, 과장된 공포 반응을 보여 후 외상 후 스트레스 장애 (PTSD)의 쥐 모델을 설명합니다. 동물 모델과 여기에 설명 된 방법은 기계론의이지만 주변 흰색 혈액 세포의 생체과 함께, 환자로 측정 할 수없는 뇌 핵에 생체, 수를 상호 연관 유용합니다.

Abstract

후 외상 후 스트레스 장애의 pathophysiology의 발전을 대표하는 생체 인식은 (PTSD) 목적 진단뿐만 아니라 외상에 대한 치료 효능과 회복력의 평가뿐만 아니라, 매우 중요합니다. 지속적인 연구 과목 '혈액, 타액, 소변, 사후 뇌 조직으로부터 생물학적 샘플을 사용하여 충격으로 스트레스를 유발 단백질, transcriptomes, 게놈 차이와 유전자 변조기를 포함하여 PTSD에 대한 분자 생체를 식별에 관한 것이다. 그러나, PTSD의 정신 증상과 관련된 변경된 뇌 기능에 주변 또는 사후 샘플에서 이러한 biomarker 분자의 상관 관계가 해결되지 않은 남아 있습니다. 여기, 우리는 따라서 기계론의와 pathogno 아르 PTSD의 중심 생체의 필요한 상관 관계를 제공하고, 말초 혈 및 중앙 뇌 생체뿐만 아니라 행동 표현형 모두 수집하고 측정 할 수있는 PTSD의 동물 모델을 제시monic하지만이되는 수, 주변 생체 및 행동 phenotypes와 함께, 사람들로부터 수집 할 수 없습니다.

쥐의 피할 꼬리 - 충격 모델 (ITS) - PTSD 우리의 동물 모델은 구속 세 연속 일 동안 반복 꼬리 충격을 고용하고 있습니다. 이 ITS 모델은 PTSD 17, 7, 4, 10 pathophysiology을 모방 한 것이 었지요. 우리와 다른 ITS 모델이 PTSD 과목 17, 7, 10, 9에서 발견 된 것과 유사한 행동 및 신경 생물학적 변경을 유도하는지 확인했습니다. 특히, 이러한 스트레스 쥐 (1) 인간에 비해 쥐의 삶의 압축 시간 척도를 제공 스트레스 중단 후 몇 일 게재 지연과 과장 펄쩍 뛰게하다 응답, PTSD 환자의 증상의 1~3개월 지연에 해당하는 전시 (DSM-IV-TR PTSD Criterian D / E 13), (2) 향상된 플라즈마 hypothalamopituitary 축 (고전력 증폭기)의 손상을 나타내는 몇 일 동안 corticosterone (CORT), (3) 저능아 보신진 대사 조절의 장애를 나타내는 스트레스 정지 후 마구 체중 증가.

이 모델에 사용 된 실험 패러다임은 다음과 같습니다 음향 펄쩍 뛰게하다 응답 (ASR) 및 신체 질량 차트의 측정에 의해 assayed 쥐 (1) 배운 helplessness 패러다임, 지역 및 핵에 쥐의 뇌의 (2) microdissection ( CORT의 혈액 수준 3) 효소 결합 면역 분석 (엘리사), (4) 유전자 발현의 microarray 플러스 관련 생물 정보학 도구 18. rMNChip 별명이 microarray은, 특히 PTSD에 참여하는 가상 neuronal bioenergetics를 해결하기만큼 쥐의 mitochondrial 및 미토콘드리아 관련 핵 유전자에 초점을 맞추고 있습니다.

Protocol

1. PTSD의 동물 행동 모델

  1. 주제 : 남자 흰둥이 Sprague Dawley 쥐가 (Taconic 농장, Derwood, MD) 사용, 스트레스 프로토콜 관리시 200g에 가중치 150.
  2. 음식, 물 섭취량과 체중 증가의 측정이 : 100 무게 실험실 쥐에 도착 ± 25g에 케이지 (: 45x24x20 cm 케이지 크기)로 두 자리 잡고 있습니다. 케이지 패딩 기판 (woodchips) 2 회 변경됩니다. 및 상대 습도 (30~70%) - 통제 된 환경 일주 - 온도 (22 ± 4 ° C)에 동물은 되돌릴 12 시간 조명주기 (0600-1800 : 1800 / 0600 및 해제에 불이)에 유지됩니다 실험 전에. 물과 표준 pelleted 급식은 (할란 (2018) 18 %의 단백질 쥐 다이어트, 글로벌 식단, 할란 Teklad) 자유롭게 홈 케이지에서 사용할 수 있으며, bodyweights는 스트레스의 중단 후 일 동안 3, 3 일 전에 매일 3 일 기록됩니다 .
  3. Accl​​imation : 고양이는 보 ~ 3 일에 적응 아르동물 시설 및 음향 펄쩍 뛰게하다 챔버 일. 음향 펄쩍 뛰게하다 챔버로 적응하기 위해 동물 초기 측정하기 전에 세 번 일 동안 매일 5 분을 위해에 처리됩니다.
  4. 프로토콜을 강조 : 동물 동등하게 자신의 몸의 무게와 기준 펄쩍 뛰게하다 응답에 따라 각 그룹에 할당됩니다. 16 동물로 이루어진 각 그룹에, 시험은 동물의 두 그룹에 이루어집니다. 그룹 1은 스트레스 프로토콜을 받고 있으며, 그룹 2는 컨트롤입니다.
    스트레스 노출 프로토콜 연속 각 세션이 구속으로 구성되어 2 시간 절차 ( "피할 수")와 꼬리 충격이며, 연속 3 일 동안 하루에 한 번씩 반복. 강조는 (0800과 1200의 창 이내) 아침에 이루어집니다. 동물은 환기가 플렉시 글라스 튜브에 고정 됨으로써 막았 있습니다. 마흔 전기 충격 (2 MA, 3 초 지속 시간, USA 동물 시험 케이지 그리드 층 놀랍군, Coulbourn 기기) 150t의 반 무작위 간격으로 꼬리에 전달됩니다O 210 초 (그래픽 상태 표기법 소프트웨어, Habitest 유니버설 링크 Coulbourn 기기, USA). 2mA의 자극은 자극 출력이 실험의 손가락에 걸쳐 배치되면, 그 aversive 때문에 선택하지만, 고통스러운 수 없습니다. 전극 젤은 전극과 쥐의 꼬리의 피부 사이에 젤을 수행 얇은 층을 형성하기 위해 Q-팁을 사용하여 적용됩니다. 전극 클립 조정과 꼬리의 혈액 순환에 영향을주지 않고 좋은 연결을 보장하기 위해 꼬리에 연결되어 있습니다.
  5. 음향 놀라게 응답 (ASR) : 음향 펄쩍 뛰게하다 응답 측정은 놀라게 응답 음향 테스트 시스템 (Coulbourn 기기, 콜럼버스, 오하이오, 미국) 3으로 진행되었습니다. 이 시스템은 소리 감쇠 챔버의 무게에 맞는 플랫폼으로 구성되어 있습니다. 펄쩍 뛰게하다 플랫폼 각각에 스트레인 게이지입니다 변환기는 사용하기 전에 보정이 필요합니다. 첫째, 커플러는 교정을 위해 DC의 결합 모드에 있어야합니다. 이 모드에서, 커플러의 출력 디rectly 플랫폼에서 입력, 정적 가중치를 보정에 필요한 모드는 다음과 같습니다. 펄쩍 뛰게하다 응답을 나타냅니다 힘의 만 급속한 변화는, 출력 있도록 변환기는 실험 기간 동안 AC 커플 링 모드로 전환됩니다. 소리 자극에 대한 반응으로 동물들의 움직임이 때문에 각 플랫폼 내부 스트레인 게이지에 의해 전압 변화로 측정하고 펄쩍 뛰게하다 - 도출하도록 의도 자극의 발병 200 밀리 초 내에 발생하는 최대 응답으로 기록됩니다.
    자극 시험 여섯 종류가 있습니다 : 혼자 100dB은 사전 펄스, 혼자 110dB, 사전 펄스, 사전 펄스 형없이 자극 제어 110dB와 100dB. 각 시험 유형은 8 번 수여되었습니다. 시험 유형은 주문 효과와 habituation을 피하​​기 위해 무작위 순서로 표시됩니다. 인터 재판 간격은 15에서 25 초에 무작위로 다양합니다. 8 시련 가운데 만 최대 값은 결과에 수집되어 결국 같은 날 동물의 체중을 조절. 동물 어느 날 B를 테스트efore 스트레스 또는 기준 읽기 1, 7, 14, 스트레스 절차 또는 기타 치료의 연속 3 일 마지막 날 다음 21일 등의 다른 치료.
  6. 데이터 분석 :
    1. ASR : % 기준 =의 (절대 진폭 / 기본 절대 진폭) × 100 % : 음향 펄쩍 뛰게하다 응답의 진폭은 각 시간 방정식을 사용하여 계산된다 "기준 비율 (%)"로 표시됩니다 테스트. 각 테스트 일 경우, 반복 측정에 대한 ANOVAs는 SPSS (버전 16) 소프트웨어를 사용하여 스트레스 상태와 약물 투여의 요인으로 펄쩍 뛰게하다 진폭에 수행됩니다. Tukey, Bonferroni, 또는 Dunnett 시험은 각 그룹 간의 상당한 후 특별 차이를 평가하는 데 사용됩니다. 데이터는 ± SEM을 의미로 표현
    2. 성장 : 바디 무게와 음식과 물 소비가 일 -1 위 스트레스와 일 14 21 스트레스 프로토콜의 30 다음 완료를 측정합니다. 통계 분석 : 음식과 물을 섭취 데이터를 받게되는 하나 -분산의 방법으로 반복 - 조치 분석 (ANOVA). 시간이 지남에 따라 식품 소비 속도의 변화를 분석하기 위해, 음식 섭취의 양이 더 스트레스 프로토콜과 그룹 사이의 체중의 초기 차이에 의해 유도 체중의 변화를 최소화하기 위해 피사체의 체중으로 나누어 져 있습니다. 모든 절차는 기관 동물 케어 및 사용위원회 (IACUC)에 따라 승인하에 실시하고 있습니다.

2. 뇌 해부

  1. 장비 및 재료 :
    1. 마취 병 : ". 조미료 병"이 같은 '약종상 항아리 ","솜 뭉치가 병 ", 또는 직경의 약 6 인치 높이 5인치 측정, 뚜껑이있는 유리 병입니다
    2. 이러한 켄트 과학에서 제공하는 쥐를위한 단두대.
    3. Vibratome 1000 :
      1. 길이 방향으로 반으로 면도날을 잘라 클램프에 삽입, 술과 기름을 씻어.
      2. 일반 얼음 조각과 함께 목욕을 입력합니다.
      3. 장소길이 방향으로 트레이.
      4. 시아 노 아세틸렌 한 방울를 걸기 전에 수분의 트레이를 닦아주십시오.
    4. Rongeurs (예 Miltex, 고양이에서 마이크로 프리드먼 rongeur 없습니다. 안돼. 17-4801 또는 정밀 과학 도구 고양이에서 피어슨 rongeur. 더 16015-17).
    5. # 3 # 5 보석상 포셉 (경질를 끌어 정확히).
    6. 날카로운 포인트 (Vantage 사 V95-304은 예입니다)와 작은 가위.
    7. (2) 잔액 규모에 분말 화학 물질을 전송하는 데 사용 등의 평면 스테인레스 스틸 미니 spatulas. telencephalon 및 개관 사이에 맞도록으로 폭 넓은 엔드 그렇게 앞으로 구부리 있습니다.
    8. 뇌 블록을 전송하는 스푼. (식당에서 플라스틱 숟가락 잘 동작합니다.)
    9. 메스 # 10.
    10. 더블 에지 면도날 (탄소강) :
      1. Vibratome 1.5.
      2. 해부 1.5.
    11. 두 유리 페트리 요리 ~ 3.5 인치, 직경 4 인치 하나가 다른 내부 맞 등. B의 얼음 조각ottom 요리. 맨 접시에 두 여과지. 필터 종이를 이동하여 필요한 위치에 조각을 이동합니다.
    12. 100 ML의 비이커.
    13. 얼음 뇌를 관개하기 위해 아이 스포이트는 CSF를 냉각. (1 / 2 인치 와이드 라텍스 고무 전구에 삽입 좁은 끝으로 유리 파스퇴르 피펫은 잘 작동합니다.)
    14. 10인치 폭, 20 센티, 정보 5인치 고 : 얼음 트레이를 납작하게. 포함 :
      1. 얼음 조각의 모든 악기를 명심 해.
      2. 낮은 칼슘 / 얼음을 부수기 위해서는 다구 할 수 있습니다 플라스틱 병에 높은 마그네슘 aCSF.
      3. 시아 노 아세틸렌.
    15. 낮은 칼슘 / 고 마그네슘 인공 뇌척수 (aCSF) :
      1. mm 단위 : 125 NaCl, 2.5 KCl, 0.5 CaCl 2 * 2H 2 O, 2.0 MgCl 2 * 6H 2 0, 1.2 아냐 2 PO 4 * H 2 O, 25 NaHCO, 11 포도당.
      2. 플라스틱 병에 해당이 얼음을 부수기 위해서는 다구 할 수 있습니다.
      3. -80에서 20 분에 칠 ° C의 냉동고 비자금을 만들합니다.
    16. 면봉.
    17. 필터 종이 : 워트 먼지 42.5 mm (CAT 없음 1001 042.).
    18. 미니 원심 분리기 튜브는 조직의 작은 부분을 수집합니다.
    19. 웰스는 판 더 큰 구조와 조직의 섹션을 수집합니다.
    20. 종이 타월.
    21. 레드 생물학적으로 안전한 봉투.
  2. 마취 :
    1. 마취 병, 거즈 패드, isoflurane, 금속 집게는 연기 후드에 위치하고 있습니다.
    2. 쥐가 마취 병에 배치되어 있습니다.
    3. 마취 병에 isoflurane과 장소에 거즈 패드를 저해.
    4. 웹 집게로 몰아 때 손 안에 철수를 - - 페달을 반사 할 때까지 기다리거나 각막 반사는 사라집니다.
    5. 목을 베다 : 뒤에서 가슴 주위에 한 손으로 쥐를 파악하는 것은, 가능한 한 후두부 근처에 같은 단두대로 쥐 목을 벨. 아틀라스는 여전히 일반적으로 두개골에 첨부 된 상태로 유지됩니다.
    6. 혈액 컬렉션 : 경동맥 동맥에서 spurting에서 혈액을 방지하기 위해 가슴에 당겨 쥐.수집 용기에 혈액의 흐름을 제어하는​​ 등 점차적으로 그립을 휴식을 취하실 수 있습니다.
  3. 뇌의 제거 :
    1. 신속 작은 가위로 basiocciput에서 근육과 남은 뼈대을 떼어.
    2. 구멍의 매그넘에서 rongeur와 시작을​​ 사용하여 뒤통수 condyles과 basiocciput을 떼어.
    3. 메스 중간 선 두피 절개.
    4. 가위를 사용하여 뒤통수와 정수리 뼈의 중간 시상 절개를 잘라. rongeurs으로 두개골의 절개 여백을 파악하는 것은 뇌와의 접촉을 최소화하기 위해주의되는, 거리에 중심에서 알 껍질처럼 다시 부러. 중간 선 잘라 내기, 휴식은 뒤로 단계에서 수행 할 수 있습니다.
    5. 뇌가 더 노출되어로서 조직의 무결성과 활력을 유지하기 위해 얼음 차가운 aCSF로 줄여하는 것이 중요합니다.
    6. 마찬가지로 시간적 정면 뼈를 와해.
    7. 고급 집게로를 가장 빠른 시간 내에 받아보실 만드는 경질 떠날tentorum cerebelli.
    8. 충분히 두개골 신경에 긴장을 넣어에 개관에서 뇌를 제기 전두엽 아래에 삽입 미니 주걱을 갖추고 있습니다.
    9. 가위와 두개골 신경을 가로로 쪼개다.
    10. 두개골에서 완전히 뇌을 들어 아이스 낮은 칼슘 / 고 마그네슘 aCSF의 비커에 드롭하자. 조직이 단단한 것 너무 냉각 분 이상 둡니다 명확하게 볼 수있는 구조, 그리고 조직의 건강은 유지됩니다.
    11. 플라스틱 숟가락으로, 얼음 차가운 페트리 접시에 거름 종이에 복부 쪽 뇌를 전송할 수 있습니다.
  4. 뇌의 해부 :
    1. 중간 대뇌 동맥 (그림 2A)에서 면도날과 코로나 절개를합니다.
    2. 얼음에 일시적으로 전두엽을 저장 100 ML의 비커에 낮은 칼슘 / 고 마그네슘 aCSF을 냉각.
    3. 등쪽 표면이 다되도록 뇌를 뒤집습니다. midbrain의 시점에서 brainstem를 가로로 쪼개다차 diencaphalon. 그 결과 뇌 블록은 그림 2B에서 볼 수 있습니다.
    4. 차단 된 뇌를 다시 아이스 낮은 칼슘 / 고 마그네슘 aCSF에 놓습니다.
    5. 미니 spatulas 사용하여 모근 / 폰스에서 소뇌를 해부. 의도 분석에 적합한 미디어에 저장합니다.
    6. 페트리 접시에 차단 뇌를 반환합니다. 이 여과지를 사용 ventrum에 하나의 필터 종이를 배치하여 뇌를 올린다. 그것으로, 두 번째 필터 용지의 가장자리에 차단 된 뇌의 뒤쪽 코로나 비행기를 놓습니다. 이 필터 종이 장소에서 Vibratome 절단 판에서 시아 노 아세틸렌 한 방울에 차단 뇌의 앞쪽 컷 비행기는, 피질 블레이드를 마주보고 있습니다.
    7. Vibratome으로 충분히 꼬리 뇌의 차단되도록 hippcampus 쇼 (그림 2C).
    8. 200g의 쥐에 2,700 μ 두께 125g 쥐에 2,400 μ 두께, 섹션을보십시오. 페트리 접시에 여과지에 면봉을 사용하여 섹션을 전송(그림 2D).
    9. 잘라 내기 및 면도날과 cingulate 피질을 저장합니다.
    10. 치과 주걱으로 다음 isocortex 보지, 그만 할 수있는 코퍼스 callosum의 말초 가장자리로 밀어 넣으십시오.
    11. 그 ventolateral 여백에서, 해마 (그림 2E)에서 껍질을 벗기다.
    12. midbrain를 저장합니다.
    13. 200g의 쥐에서 2,500 μm 두께 120g 쥐에서 2,400 μm 두께의 두 번째 섹션,보세요. 페트리 접시 (그림 2F)에서 여과지 섹션을 배치합니다. 또한, 다섯 500 μm 섹션은 전기 생리학이 시점에서 촬영 될 수 있습니다.
    14. 잘라 내기 및 면도날과 cingulate 피질을 저장합니다.
    15. isocortex (그림 2 층)을 제거 할 수있는 내부 캡슐에서 면도날과 측면 상처를합니다.
    16. amygdali (그림 2 층, G)를 제거 할 수있는 면도날 경사 상처를합니다.
    17. 시상 하부을 제거 면도날로 잘라내 상자를 확인합니다. 측면상처가 표시됩니다 시상 하부의 ventromedial 핵에 측면입니다. 우리는 세 번째 뇌실이나 복부 tegmental 지역 (그림 2H) 위의 등쪽의 몫을합니다.
    18. 코퍼스의 callosum에 주걱을 눌러과 해마에 부착 isocortex의 작은 조각을 멀리 당긴다. hippocampal 접합면에 복부 주걱의 좁은 끝을 배치하고 해마를 끌어 dorsally 올립니다.
  5. RNA의 보존 및 뇌 조직과 혈액의 샘플에서 단백질 :
    1. RNA 분석을위한 미디어 :
      1. 뇌 : RNAlater RNA 안정화 시약, Eppendorf 튜브에 # 76106.
      2. 혈액 : PAXgene 혈액 RNA 튜브 (PreAnalytix, Quagen).
    2. 혈액에서 단백질 (CORT) 분석을위한 미디어 : 솔루션 D-HBSS, w / O Ca2 +와 MG 2 +, (품질 생물학, Inc의).
    3. 저장 :
      1. 수집 뇌 세포가 처음 더 이상 12 이상의 시간에 드라이 아이스 바구니에 저장 한 후 -70 ° C 냉동고에6 개월 연구 기간 내에 사용하십시오.
      2. 수집 혈액은 시약이는 6 개월 이내에 사용 연구 기간 동안 -70 ° C의 냉동고에 저장되어있는 후 통과 할 수있는 할 밤새 실온에서 보관됩니다.

3. Mitochondrial 및 미토콘드리아 관련 핵 유전자의 유전자 Microarray

뇌 조직에 쥐 mitochondrial 기능을 연구하기 위해, 우리는 최근 쥐 mitochondrion-신경 세포에 초점을 맞춘 microarray (rMNChip)과 뇌 조직 18 미분 경로의 급속한 식별 생물 정보학 도구를 개발했습니다. rMNChip는 mitochondrial 기능, 스트레스 반응, circadian 리듬과 신호 전달에 관여 1,500 유전자가 포함되어 있습니다. 생물 정보학 도구는 differentially 표현 유전자의 컴퓨팅을위한 알고리즘, 그리고 microarray 결과에 대한 간단하고 직관적 인 해석을위한 데이터베이스가 포함되어 있습니다.

  1. Purificatio조직의 총 RNA의 N (고양이 # GPM-키트 2011-1, GenProMarkers) :
    1. RNA의 특정 핵의 쥐의 뇌 조직은 나중에 안정화 시약 (Qiagen)를 RNA.
    2. Dispergierstation (IKA Labortechnik)에 초 Turrax T8을 사용하여 조직 (600 μl GPM-L / B 버퍼에서 30 밀리그램) 균질화.
    3. 15 분에 Sorvall 21,000 rpm으로 1.5 ML 튜브에 원심 분리기.
    4. 2 ML 수집 관과 스핀 열에 표면에 뜨는을 가만히 따르다.
    5. 3 분에 15,000 rpm으로 열 튜브를 원심 분리기, 흐름을 통해 폐기하십시오.
    6. 스핀 열 각각 700 μl GPM-B / W 버퍼를 추가 흐름을 통해 폐기, 15 초에 16,000 rpm으로 열 튜브를 원심 분리기.
    7. 스핀 열 각각 500 μl GPM-W 버퍼를 추가 한 번 반복, 15 초에 16,000 rpm으로 열 튜브를 원심 분리기.
    8. 새로운 1.5 ML 수집 관에 스핀 열을 삽입합니다.
    9. 스핀 컬럼의 각으로 30 μl DEPC - 처리 물을 추가에 16,000 rpm으로 원심 분리기1 분, 한 번 반복한다.
    10. RNA 농도를 측정, DNase-& RNase 무료 물 1 μg / μl로 농도를 조정, 샘플은 microarray 라벨에 대한 준비가되어 있습니다.
  2. Microarray 라벨 및 하이브리드 (CAT # 배열 900, Genisphere) :
    1. 1.0 μg 쥐 총 RNA는 제조업체의 지시 사항에 따라 cDNA 합성 및 microarray 라벨에 사용됩니다.
    2. 이전에 설명 된대로 Microarray의 하이브리드는 12-16 시간에 65 ° C에서 rMNChip에 진행됩니다. 18
  3. Hybridized Microarray 슬라이드 (고양이 # GPM0101-6, GenProMarkers)를 세척 :
    솔루션 세탁 음량 20 X SSC 10% SDS ddH 2 O
    0.5 X SSC/0.01 SDS 500 ML 12.5 ML 0.5 ML 최대 500m까지리터
    0.5 X SSC 500 ML 12.5 ML 최대 500 ML에
    0.1 X SSC 500 ML 2.5 ML 최대 500 ML에
    0.01 X SSC 500 ML 0.25 ML 최대 500 ML에

    세탁 동안 슬라이드는 빛으로부터 보호되어야합니다. 슬라이드가 모든 단계에서 음식을 건조시킬하지 마십시오.
    1. BioShaker (분자 기술 주식회사, 세인트 루이스, MO에 병을 교반하여 실온에서 : 유리 coplin 항아리에서 250 ML 솔루션 1 (70312-20, 전자 현미경 과학, 하트 필드, PA 고양이 #)에 슬라이드를 씻으십시오 ) 커버 용지의 모든 때까지 유리 슬라이드를 (그것은 <3 분 소요) 떨어질.
    2. 3 분의 병을 교반하여 다른 항아리에 250 ML 솔루션 2 슬라이드를 씻으십시오.
    3. 250 ML 솔루션 3 슬라이드를 씻으십시오, 3 분의 병을 돌려 두 번이 단계를 반복하여 다른 항아리 인치
    4. 10 초를 위해 다른 용기에 250 ML 솔루션 4 슬라이드를 씻으십시오. 바로 5 분 1,000 rpm으로 Sorvall 슈퍼 T21 원심 분리기에 PN11779 접시와 ST-H750 회에 위치 단지를 centrifuging하여 슬라이드를 건조.
    5. 가능한 한 빨리 검사를위한 상자에서 한물 슬라이드를 놓습니다.
  4. Microarray 이미지 스캔 및 사용 설명서 및 초점에 따라 ScanArray 익스프레스 Microarray 스캐너 (PerkinElmer)를 사용하여 분석 :
    1. Microarray 이미지 검색 : 프로토콜을 스캔 대 쉽게 스캔.
    2. 데이터 결과에 레이저 전원, PMT와 정규화 방법의 효과.
    3. 이미지로 GAL 파일의 정렬.
    4. 정확하게 격자에 장소의 정렬.
  5. 데이터 분석 : microarray 데이터 분석을위한 사용자 정의 계산 절차는 microarray 이미지 평가, 데이터 필터링, 스폿 사이즈 보정, 포함, normalizatio을 포함N과 비교는 이전에 18 설명했다. 복사 및 검증 microarray 결과 2, 22, 25, 19, 20, 8, 23, 18 세대를 보장하기 위해 이전에 설명 된대로 또한, 온톨로지, 경로 및 네트워크 분석을위한 방법은 동일합니다.

4. 혈액 샘플 수집 및 플라즈마 CORT 농도 측정

  1. anesthetized 동물에서 사전 또는 사후 스트레스 꼬리 혈액 샘플은 순환 CORT 수준 결정을 위해, 일 - 1 heparinized 튜브에 14, 21 및 30를 수집하고 있습니다.
  2. 동물 euthanized 된 후 트렁크의 혈액 샘플도 heparinized 튜브로 수집하고 있습니다. 플라즈마는 -70에서 추출 및 저장 ° C 분석까지.
  3. 플라즈마 추출을위한 미디어 :
    1. RNA 추출을위한 혈액 샘플은 PAXgene 혈액 RNA 튜브 (PreAnalytix, Quagen)를 사용하여 수집됩니다
    2. DNA 추출을위한 혈액 샘플은 PAXgene 혈액 DNA 튜브를 (PreAnalytix, Quagen)를 사용하여 수집하고 있습니다. 단백질 분석을위한 혈액 샘플은 MaketLab # ML5601에서 리튬 헤파린 모세관 수집 관 (200 μl)를 사용하여 수집하고 있습니다.
  4. 플라즈마 CORT 농도는 Active 쥐 Cort EIA (진단 시스템 연구소 주식회사에서 테스트 및 분석 http://www.beckmancoulter.com/ 다음과 같이) :
    1. 사용되는 microtitration 스트립을 선택합니다.
    2. 공액 희석제에 쥐 CORT의 효소 켤레 농축을 diluting하여 쥐 CORT 효소의 공액 솔루션을 준비합니다.
    3. 피펫 25 μl 표준, 컨트롤 및 우물에 미확인.
    4. 반자동 디스펜서를 사용하여 각 잘 ~ 100 μl 효소 켤레 솔루션을 추가합니다. 부드럽게 잘 홀더 5-10 초를 누릅니다.
    5. 잘 반자동 디스펜서를 사용하여 각에 100 μl 쥐 CORT 항혈청을 추가합니다.
    6. 60 분에 500-700 rpm으로 흔드는 세트에 실내 온도 25 ° C에서 우물을 품다.
    7. 각 나르는를 대기음 씻어자동 microplate 와셔를 사용하여 씻어 솔루션과 내가 5 번. 흡착제에 반전 플레이트에 의해 건조 되리.
    8. 잘 반자동 디스펜서를 사용하여 각에 TMB의 Chromogen 솔루션 100 μl를 추가합니다.
    9. 500-700 rpm으로 설정 궤도 microplate 흔드는에서 실내 온도 15-20 분에 품다. 색의 변화를 감상하세요.
    10. 반자동 디스펜서를 사용하여 각도에서 100 μl 중지하는 솔루션을 추가 할 수 있습니다.
    11. 손 5-10 초에서 판을 흔들어.
    12. 30 분 안에 잘에있는 솔루션의 흡광도를 참조하십시오.
    13. 필터는 450 나노 미터에서 설정됩니다. * EIA 키트는 또한 Immunobiological 연구소 (에서 구입하실 수 있습니다 www.ibl - america.com ).

5. 대표 결과

그림 1
그림 1. 고양이는 막았와 꼬리 충격에 노출되어있다. 후속 체중플라즈마 corticosterone 농도 및 음향 펄쩍 뛰게하다 응답은 측정 A :. 스트레스 노출 : 동물은 환기가 플렉시 글라스 튜브에 고정 됨으로써 막았 아르가. 마흔 전기 충격 (2 MA, 3 초 기간 ;)은 150-210 초 B와 C의 반 무작위 간격으로 꼬리에 전달됩니다 :. 성장하는 동안 체중의 스트레스 짓 게인 : 바디 무게와 음식과 물을 소비 측정 이 날 14까지 후 즉시 스트레스의 3 일 당일 스트레스 (일 -3), 이전 후 매일. 스트레스 동안 체중 증가의 부족은 보상되지 않습니다 D는 :.. 스트레스가 증가 플라즈마 corticosterone 농도 E : 음향 놀라게 : 동물의 마지막 날 다음 기준 읽기 12 일간 스트레스가 전에 하루 (하루 1) 테스트 스트레스의 연속 삼일. 스트레스 및 제어 - - 각 그룹에 대한 데이터는 음향의 비율로 표현됩니다하루에 일 -1 ~ 12 상대를 깜짝 놀라게. 스트레스는 현저히 음향 펄쩍 뛰게하다 반사를 증가시킨다. 큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오 .

그림 2
그림 2 편도, 해마, 그리고 뇌 슬라이스에서 시상 하부의 해부 A :.. 쥐의 뇌에, 복부보기 : 중간 대뇌 동맥에 화살표가 지점 B :. Vibratome으로 이송 할 준비가 뇌 블록, 복부 전망. C : 최대 vibratome 쟁반, 꼬리 옆에 접착 뇌 블록, 대뇌 피질의 칼을 마주보고 있습니다. 꼬리 뇌는 이미 꼬리 해마를 노출 떼어되었습니다. . 블록은 2,500 μm 촬영 할 해마의 주요 부분을 포함하는 갈라 D를위한 준비가 : 꼬리 해마를 포함하는 2,500 μm 두께의 슬라이스 E :. T그는 isocortex (ISO)은 해마 (HC)와 midbrain에서 벗겨 해마에서 벗겨됩니다 F :.. 편도선과 뱃 부리 장식이있는 해마를 포함하는 2,500 μm 두께의 슬라이스는 G는 : isocortex은 excised과 편도 (Amyg) resected되었습니다 . H :. 시상 하부 (HT)가 excised과 변위되어가 큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오 .

그림 3
그림 3. 글루코 코르티코이드 수용체 (GR)와 편도의 minerocorticoid 수용체 (MR), 해마, 시상 하부, 그리고 전두엽 피질 전에 (C, 제어)과 후 (STR) 꼬리 충격 스트레스의 mRNA에 대한 표현 수준. 단위 컨트롤의 비율이다; 바 SEM은 다음과 같습니다 딜라 : 스트레스 minerocorticoid 수용체의 mRNA 발현을 감소 B : 해마 : 스트레스 increa.SES minerocorticoid 수용체 mRNA 발현 C :. 시상 하부 :. 스트레스는 minerocorticoid 수용체의 mRNA 발현을 증가 D : 전두엽 피질 : 스트레스는 글루코 코르티코이드 수용체의 mRNA 발현뿐만 아니라 minerocorticoid 수용체의 mRNA 발현을 감소시킵니다.

쥐 GR에 대한 (121bp) PCR의 프리 머은 다음과 같습니다 1f.CCACTGCAGGAGTCTCACAA
1rAACACCTCGGGTTCAATCAC
쥐 MR에 대한 (99 BP) PCR 프리 머은 다음과 같습니다 1f.GCCTTCAGCTATGCCACTTC
1rAACGTCGTGAGCACCTTTCT

그림 4
그림 4. 클러스터와 RNA의 히트는 differentially 소뇌 (CL), 뇌 (CR), 전두엽 피질 (FC), 시상 하부 (HT) 및 해마 (HC) 등 5 쥐의 뇌 조직에서 파생 64 유전자에서 표명했다. 컬러 맵은 D의 배 변경 사항을 나타냅니다자신의 - (녹색) 및 최대 - (빨간색) 표현 유전자. 이 다섯 뇌 조직 15 microarray 실험에서 파생 된 64 유전자의 각 9 측정의 정규화 된 신호 강도의 (A) 클러스터와 히트 맵. 각 유전자의 표현은 기술 triplicates 및 실험 triplicates에 의해 측정되었다. (B) 64 유전자 각각의 이러한 9 측정의 평균 RNA 수준의 클러스터와 히트 맵. 이러한 결과는 mitochondrial 유전자 발현에 명확 차이와 서로 다른 뇌 영역이 다른 에너지 수요를 가지고 우리의 가설을 지원하므로 관련 기능을 표시합니다. 큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오 .

rMNChip 및 bioinformatic 도구를 우리의 응용 프로그램은 소뇌 (CL), 뇌 (CR), 전두엽 피질 (FC), hypotha 등 5 쥐의 뇌 조직에서 파생 differentially 표현 RNA 64 유전자의 클러스터와 히트의 식별을 주도lamus (HT) 및 해마 (HC) (그림 4). 이 데이터는 mitochondrial 유전자 발현하기 때문에 관련 기능에 뚜렷한 차이를 보여줍니다. 결과는 서로 다른 뇌 영역은 해당 뇌 기능을 수행하기 위해에서 에너지의 다른 금액을 요구하는 보여줍니다.

Discussion

PTSD의 진단은 잠재적 인 대상으로 자기보고 정신 증상 (DSM IV)에 기반을두고 있습니다. 더 잘 정의 된 biomarker는 현재 잠재적 인 PTSD 환자의 pathophysiological 상태를 액세스 할 수 없습니다. PTSD 인생은 외상성 사건을 위협하고 주요 정신 증상이 초기 사건 이후 몇 달, 심지어 몇 년 동안 생존자의 삶에 존재 유지에 의해 도발 장애입니다. PTSD 환자에 공개 가장 유명하고 지속적인 증상은 hypervigilance, 지연 과장 펄쩍 뛰게하다 응답 14, 15, 16 및 고전력 증폭기 축 명백한 타협입니다. 외상성 스트레스 (24)의 정지 후, 인간에서 이러한 증상이 남아, 또는 3 개월 지연 나타납니다. 150g 무게 쥐의 피할 꼬리 - 충격 모델 (ITS) - PTSD의 biomarker 연구에 대한 우리의 현재 모델은 구속 세 연속 일 (40, 2 석사 tailshocks의 2 시간 세션)에 대한 반복 꼬리 충격을 고용하고 있습니다. 이 ITS 모델이 있습니다상당한 정도 PTSD 17 pathophysiology, 7, 4, 10 흉내 게재 된. 우리 연구실 및 기타 실험실 쥐의 스트레스의 ITS 모델이 PTSD 과목 17, 7, 10, 9에서 발견 된 것과 유사한 행동 및 신경 생물학적 변경을 유도하는지 확인했습니다. 특히, 이러한 스트레스 쥐 (1) 인간에 비해 쥐의 삶의 압축 시간 척도를 제공 스트레스 중단 후 몇 일 게재 지연과 과장 펄쩍 뛰게하다 응답, PTSD 환자의 증상의 1~3개월 지연에 해당하는 전시 (DSM-IV-TR PTSD Criterian D / E 13), (2) hypothalamopituitary 축 (고전력 증폭기)의 손상을 나타내는 몇 가지 (10) 일, 그리고 (3) 저능아가 체중 증가에 대한 강화 된 플라즈마 corticosterone (CORT) 후 스트레스 PTSD의 신진 대사 조절의 장애에 해당하는 중단. 여우 냄새, 육식 동물에 노출, 또는 potentiated 펄쩍 뛰게하다 응답 exhi을 두려워하는 문학의 증거는 없습니다비트이 지속적 행동 및 neuroendocrinologic phenotypes는 PTSD와 관련된.

하나의 스트레스 세션 (1DS)에 노출 쥐가 과도 전시했지만, 3DS 쥐 17으로 표시 지속적인 이상은 본 실험은 3DS와 1DS 쥐 4, 7, 그리고 스트레스 정지 후 10 일 펄쩍 뛰게하다 응답을 비교 없습니다. 이전 작품과 일치, 쥐가 높은 기초 플라즈마 CORT 수준에게 첫 날 후 스트레스 17 전시 강조했다. 이 CORT 수준은 1DS 쥐에 비해 3DS의 쥐에서 더 높은 CORT 수준과 스트레스 노출의 수에 민감했다. 펄쩍 뛰게하다 sensitization은 3DS의 쥐에 10 일 게시 스트레스 분명해집니다 반면에 펄쩍 뛰게하다 응답은, 1DS의 쥐가 과장 펄쩍 뛰게하다 응답 7 일 후 스트레스을 나타냅니다. 따라서, 스트레스 정지 후 과장 펄쩍 뛰게하다 응답의 모양은 스트레스 세션 노출 수에 관련이있는 것으로 나타납니다. 3DS 스트레스 모델에 나타납니다PTSD의 증상과 스트레스의 중단에 따라 타이밍과 관련된 주요 측정 행동 phenotypes와 관련된 생체의 변경된 표현에 대한 통찰력을 얻을하는 데 유용합니다. 게놈 결과는 크게 PTSD 등의 복잡하고 multifactorial neurologic 장애, 하부 분자 메커니즘을 시스템 - 생물 연구와 이해를 촉진 할 차동 경로와 유전자 및 단백질 생체를 식별 할 수 rMNChip 및 생물 정보학 도구를 적용하기위한 원칙을 증명하는 서류를 제시 발표했다.

우리의 패러다임은인지와 PTSD의 더 복잡한 행동 측면으로 탐구하지 않지만, 우리는 ITS 모델 1에 해당 변경된 수면 패턴은 어려움 내려와 잠 숙박과 PTSD 환자 11 (DSM-IV-TR PTSD의 악몽에 해당합니다 기준 D 13), 그리고 탈출 / 회피 ITS 모델 학습 및 appetitive 작업의 학습에 결함 5 (DSM-IV-TR PTSD 기준 C 13)의 메모리 적자로> 12에 해당합니다. 현재 모델은 PTSD의 특징 주요 증상과 잘 상관 관계 및 중앙, 기계론의 생체과 함께, 환자로부터 수집 할 수 있습니다 PTSD의 주변 생체를 상호 연관에 대한 좋은 모델, 할 수없는 여섯을 제공합니다.

Disclosures

관심 없음 충돌이 선언 없습니다.

Acknowledgments

이 작품은 CDMRP, USUHS 보조금 G188LE, G188MG, 그리고 G188QC (HL까지), 그리고 충격으로 스트레스 연구에 대한 USUHS 센터에 의해 지원되었다.

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PTSD의, 신경 Hematologic, 그리고 행동 상관 관계를 누설하는 행위에 대해서는 동물 모델에서 생체
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Jia, M., Meng, F., Smerin, S. E.,… More

Jia, M., Meng, F., Smerin, S. E., Xing, G., Zhang, L., Su, D. M., Benedek, D., Ursano, R., Su, Y. A., Li, H. Biomarkers in an Animal Model for Revealing Neural, Hematologic, and Behavioral Correlates of PTSD. J. Vis. Exp. (68), e3361, doi:10.3791/3361 (2012).

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