Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

Biomarkører i en dyremodell for Avslører Neural, Hematologic, og Behavioral korrelerer av PTSD

Published: October 10, 2012 doi: 10.3791/3361
Automatic Translation
1, 2, 1, 1, 1, 2, 1, 1, 2, 1
1Department of Psychiatry, Center for the Study of Traumatic Stress, Uniformed Services University of the Health Sciences, Bethesda, Maryland, 2Department of Gene and Protein Biomarkers, GenProMarkers, Inc.

Summary

Vi beskriver en rotte modell av post traumatisk stress lidelse (PTSD) som avslører vedvarende endringer i nevroendokrine funksjon og forsinket langsiktig, overdrevet frykt respons, karakteristisk for PTSD-pasienter. Dyret modellen og metoder beskrevet her er nyttige for å korrelere biomarkører i hjernen kjerner, som er mekanistisk, men kan ikke måles hos pasienter med biomarkører i perifere hvite blodceller, noe som kan.

Abstract

Identifisering av biomarkører som representerer utviklingen av patofysiologien av Post Traumatisk Stress Disorder (PTSD) er svært viktig, ikke bare for objektiv diagnose, men også for evaluering av terapeutisk effekt og elastisitet til traumer. Pågående forskning er rettet mot å identifisere molekylære biomarkører for PTSD, inkludert traumatiske stress indusert proteiner, transcriptomes, genomiske avvik og genetiske modulatorer, ved hjelp av biologiske prøver fra fagenes blod, spytt, urin, og post mortem hjernevev. Men fortsatt er korrelasjonen av disse biomarkør molekyler i perifere eller postmortem prøvene til endrede hjernens funksjoner knyttet til psykiske symptomer hos PTSD uløste. Her presenterer vi en dyremodell av PTSD der både perifert blod og sentrale hjernen biomarkører samt atferdsdata fenotype, kan samles og måles, og dermed gi den nødvendige korrelasjon av de sentrale biomarkører PTSD, som er mekanistisk og pathognomonic men kan ikke hentes fra folk, med de perifere biomarkører og atferdsmessige fenotyper, som kan.

Vår dyremodell av PTSD sysselsetter tilbakeholdenhet og hale sjokk gjentas for tre sammenhengende dager - den uunngåelige halen-sjokk modell (ITS) i rotter. Dette ITS modellen etterligner patofysiologien PTSD 17, 7, 4, 10. Vi og andre har bekreftet at ITS modellen induserer atferdsmessige og nevrobiologiske endringer som ligner de man finner i PTSD 17 personer, 7, 10, 9. Spesielt disse stressede rotter viser (1) en forsinket og overdrevet skremmeeffekt vises flere dager etter stressor opphør, som har gitt den komprimerte tidsskala av rotte liv i forhold til en mennesker, tilsvarer den til tre måneder forsinket symptomer i PTSD pasienter (DSM-IV-TR PTSD kriteriet D / E 13), (2) forbedret plasma corticosterone (CORT) i flere dager, noe som indikerer kompromiss av hypothalamopituitary aksen (HPA), og (3) tilbakestående body vektøkning etter stressor opphør, noe som indikerer dysfunksjon av metabolsk regulering.

De eksperimentelle paradigmer ansatt for denne modellen er: (1) en lært hjelpeløshet paradigme i rotte analysert ved måling av akustisk sjokkrespons (ASR) og en kartlegging av kroppsmasse, (2) mikrodisseksjon av rotte hjernen inn i regioner og kjerner, ( 3) enzym-koblet immunosorbent-analyse (ELISA) for blodnivåer av Cort, (4) en genekspresjon mikroarray PLUS relaterte bioinformatikkverktøy 18. Dette microarray, kalt rMNChip, fokuserer på mitokondrie og mitokondrier-relaterte kjernefysiske gener hos rotte slik spesielt ta de nevrale bioenergi hypoteser for å være involvert i PTSD.

Protocol

1. Animal Behavioral Model of PTSD

  1. Fag: Mann albino Sprague Dawley rotter (Taconic Farms, Derwood, MD) anvendes, vekting 150-200 g ved tidspunktet for administrasjon av stress protokollen.
  2. Måling av mat, vann inntak og vektøkning: Ved ankomst i laboratoriet rotter som veier 100 ± 25 g er plassert to til et bur (bur størrelse: 45x24x20 cm). Cage padding substrat (flis) er endret to ganger ukentlig. Dyr holdes på en omvendt 12-timers lys syklus (lysene på: 1800/0600 og av: 0600-1800) i en temperatur (22 ± 4 ° C) - og relativ luftfuktighet (30-70%)-kontrollert miljø én uke før eksperimentene. Vann og standard pelletert chow (Harlan (2018) 18% protein Rodent diett, Global dietter, Harlan Teklad) er fritt tilgjengelig i hjemmet bur, og bodyweights registreres daglig 3 dager før, 3 dager i løpet og 3 dager etter opphør av stress .
  3. Akklimatisering: Rotter er acclimated i tre dager til Bøth dyret anlegget og en akustisk skremmeeffekt kammer. Å akklimatisere dem til det akustiske skremmeeffekt kammer, er dyr håndteres i det for 5 min hver dag i tre dager før de første målingene.
  4. Stresset protokoll: Dyrene er like tildelt hver gruppe basert på deres kroppsvekt og baseline startle respons. Testing er gjort på to grupper av dyr, og hver gruppe bestående av 16 dyr. Gruppe 1 mottar stress protokollen, og gruppe 2 er kontrollen.
    Stress eksponering protokollen er en kontinuerlig 2-timers prosedyre, der hver økt består av tilbakeholdenhet ("uunngåelig") og hale-sjokk, gjentatt en gang om dagen over 3 påfølgende dager. Understreker er gjort i morgen (i vinduet på 0800 og 1200). Dyr er hemmet av å være immobilisert i en ventilert plexiglass rør. Førti elektriske støt (2 mA, 3 sek varighet, Animal Test Cage Grid Floor Shocker, Coulbourn Instruments, USA) er levert til halene på semi-tilfeldige intervaller på 150 to 210 sek (Graphic State notasjon programvare, Habitest Universal Link, Coulbourn Instruments, USA). Stimulering ved 2 mA ble valgt fordi det er motvilje, men ikke smertefull, når den stimulerende effekt er plassert tvers experimenter finger. Elektrodegel påføres ved hjelp Q-tip å danne et tynt lag av ledende gel mellom elektrode og huden av rotte hale. Elektroderingene klipp er justert og koblet til halen for å sikre en god forbindelse uten å påvirke blodsirkulasjonen av halen.
  5. Acoustic sjokkrespons (ASR): Akustisk sjokkrespons målingen ble utført med en skremmeeffekt Acoustic Test System (Coulbourn Instruments, Columbus, Ohio, USA) 3. Dette systemet består av vekt-sensitive plattformer i en lyd-attenuert kammer. Transduseren, som er en deformasjonsmåler, i hver av de skremme plattformene krever kalibrering før bruk. Først må kopleren være i DC koplede modusen for kalibrering. I denne modusen coupler utgang direkte følger innspill fra plattformen, modusen kreves for kalibrering med statiske vekter. Svingeren er byttet til AC kombinert modus under eksperimenter slik at bare rask endring i kraft, noe som indikerer skremmeeffekt, er utgang. Dyrenes bevegelser i respons til lyd stimuli således målt som en spenning forandringen med en deformasjonsmåler inni hver plattform og registrert som den maksimale respons som forekom innen 200 ms av utbruddet av skremmeeffekt-fremlokkende stimulans.
    Det finnes seks typer stimulans forsøk: 100 dB alene, 100 dB med pre-puls, 110 dB alene, 110 dB med pre-puls, pre-puls alene og ingen stimulans kontroll. Hvert forsøk typen ble presentert åtte ganger. Trial typer presenteres i tilfeldig rekkefølge for å unngå ordens effekter og tilvenning. Inter-prøveperioden intervaller varierer tilfeldig 15-25 sek. Blant de åtte forsøk bare maksimumsverdiene samles i resultatene og endelig justert med dyret kroppsvekt av samme dag. Dyr er testet en dag before stress eller annen behandling som en baseline lesing og 1, 7, 14 og 21 dager etter den siste dagen av de påfølgende tre dagene av stress prosedyren eller annen behandling.
  6. Dataanalyse:
    1. ASR: Amplituden av akustisk skremmeeffekt testet hver gang er representert som "% av baseline", som er beregnet ved hjelp av ligningen:% av baseline = (absolutt amplitude / baseline absolutt amplitude) × 100%. For hver test dag, ANOVAs for repeterte målinger utført på skremme amplituder med faktorer av stress status og narkotika dosering med SPSS (versjon 16) programvare. Tukey, Bonferroni eller Dunnett tester brukes for å vurdere vesentlige post-hoc forskjeller mellom de enkelte gruppene. Dataene er representert som gjennomsnittlig ± SEM
    2. Vekst: Kroppsvekt og mat og vannforbruk måles på dag -1 foregående stress og på dager 14, 21 og 30 etter ferdigstillelse av stress protokollen. Statistisk analyse: mat og vann inntak data utsettes for en-måte gjentatte-tiltak variansanalyse (ANOVA). Å analysere endringer i matforbruk hastighet over tid, blir mengden av matinntaket ytterligere dividert med kroppsvekt av faget å minimere variasjonen i kroppsvekt indusert av stress protokollen og innledende forskjell i kroppsvekt mellom gruppene. Alle prosedyrer er utført under godkjenning i henhold til Institutional Animal Care og bruk komité (IACUC).

2. Brain Dissection

  1. Instrumenter og materialer:
    1. Anestesi jar: ". Condiment jar" Dette er en glasskrukke med lokk, som måler ca 6 inches høye og 5 inches i diameter, slik som en "apoteker jar", "bomullsdott jar", eller
    2. Giljotin for rotter, for eksempel levert av Kent Scientific.
    3. Vibratome 1000:
      1. Skjær barberblad i to på langs, skyll olje av med alkohol, sett i klemme.
      2. Fyll bad med ordinær knust is.
      3. Stedskuffen lengderetningen.
      4. Tørk skuffen av fuktighet før du legger en dråpe cyanoakrylater.
    4. Rongeurs (eksempler er en Micro Friedman rongeur fra Miltex, katt. Nei. 17-4801 eller en Pearson rongeur fra Fine Science Tools katt. Ingen 16015-17).
    5. # 3 eller # 5 gullsmeder tang (skarp å trekke av dura).
    6. Liten saks med skarpe spisser (Vantage V95-304 er et eksempel).
    7. (2) Enkle rustfrie mini stekespader, for eksempel brukt til å overføre pulverformige kjemikalier til et balanse skala. Den brede enden er bøyd fremover slik at det passer mellom telencephalon og calvarium.
    8. Spoon å overføre hjernen blokk. (En plast suppe skje fra kantina fungerer fint.)
    9. Skalpell nr. 10.
    10. Dobbel kant barberblad (karbonstål):
      1. Den ene halvdelen for Vibratome.
      2. Den ene halvdelen for disseksjon.
    11. To glassfiberbaner petriskåler, ~ 3,5 inches og 4 cm i diameter, slik at en passer inne i hverandre. Knust is i bottom parabolen. To papirfiltre i toppen parabolen. Flytt skive til nødvendige posisjoner ved å flytte filteret papir.
    12. 100 ml begerglass.
    13. Dråpetelleren for å vanne hjernen med is kjølt CSF. (Glass Pasteur pipette med smale enden inn i 1/2 cm brede lateksgummi pære fungerer godt.)
    14. Knust is skuffen: Ca 5 inches høy, 20 inches lang, 10 inches bred. Inneholder:
      1. Stokk alle instrumenter i knust is.
      2. Lav kalsium / høy magnesium aCSF i plastflaske som kan være slo for å knuse isen.
      3. Cyanoakrylat.
    15. Lav kalsium / høy magnesium kunstig cerebrospinalvæsken (aCSF):
      1. I mm: 125 NaCl, 2,5 KCl, 0,5 CaCl 2 * 2H 2 O, 2,0 MgCl 2 * 6H 2 0, 1,2 NaH 2 PO 4 * H 2 O, 25 NaHCO, 11 Glukose.
      2. I plastflaske som kan være slo for å knuse isen.
      3. Chill for 20 min i -80 ° C fryseren for å gjøre den til en sørpe.
    16. Bomullspinner.
    17. Filterpapir: Whatman 42,5 mm (Cat ingen 1001 042.).
    18. Mini sentrifugerør å samle mindre deler av vev.
    19. Brønner plate å samle større strukturer og seksjoner av vev.
    20. Papirhåndkle.
    21. Red biohazard bag.
  2. Anestesi:
    1. Anestesi jar, gasbind pads, isofluran, metall tang, er plassert i en avtrekkshette.
    2. Rotte plasseres i anestesi krukke.
    3. Fukt gaskompress med isofluran og plass i anestesi jar.
    4. Vent til pedal refleks - tilbaketrekking av labb når nettet er klemt med tang - eller hornhinnen refleksen forsvinner.
    5. Halshogge: Grasping rotte med en hånd rundt brystkassen bakfra, halshogge rotte med guillotine så nær til bakhodet som mulig. Atlas vil fortsatt forblir vanligvis festet til skallen.
    6. Blood Collection: Squeeze rotte på thorax for å hindre blod fra sprutende fra carotis.Gradvis slappe grep slik som å kontrollere flyten av blod inn i oppsamlingsbeholder.
  3. Fjerning av Brain:
    1. Raskt kutte muskel og eventuelle gjenværende vertebrae unna basiocciput med liten saks.
    2. Bruke rongeur og begynnelsen på foramen magnum, klippe bort occipital condyles og basiocciput.
    3. Midtlinjen hodebunnen snittet med skalpell.
    4. Bruke saks, klippe en mid sagittal snitt i occipital og parietal bein. Grasping kuttet margin av skallen med Rongeurs, bryte den tilbake som et egg skall vekk fra midtlinjen, er forsiktig med å minimere kontakt med hjernen. Midtlinjen snitt og pause tilbake kan gjøres trinnvis.
    5. Som hjernen er ytterligere utsatt, er det avgjørende å slukke den med is kjølt aCSF å bevare integriteten og vitalitet av vevet.
    6. Tilsvarende løsrive seg tidsmessige og frontal bein.
    7. Med fine tang, rive dura, og pass på å fåtentorum cerebelli.
    8. Med mini stekespade inn under frontallappen heve hjernen fra calvarium akkurat nok til å sette spenning på kraniale nerver.
    9. Tversgående Hjernenerve med saks.
    10. Løft hjernen helt fra skallen og la slippe inn begeret avkjølt lav kalsium / høy magnesium aCSF. La et minutt eller mer å kjøle slik at vevet blir solid, vil strukturene klart synlige, og helsen til vevet bli bevart.
    11. Med plast skjeen, overføre hjernen på filterpapiret i isen kjølt petriskål, ventral siden opp.
  4. Disseksjon av Brain:
    1. Foreta en koronale transeksjonen med barberblad på midtre cerebralarterie (figur 2A).
    2. Lagre frontallappen midlertidig i isen kjølt lav kalsium / høy magnesium aCSF i 100 ml begerglass.
    3. Vend hjernen slik at framsiden er opp. Skjære over hjernestammen ved krysset mellom midbrain ennd diencaphalon. Den resulterende hjerne blokken sett i figur 2B.
    4. Slipp blokkert cerebrum tilbake i avkjølt lav kalsium / høy magnesium aCSF.
    5. Ved hjelp av mini spatler, dissekere lillehjernen fra medulla / pons. Lagre i media som passer for tiltenkt analyse.
    6. Returner blokkerte storhjernen til petriskålen. Ved å bruke to papirfiltre, løfter hjernen ved å plassere en filterpapir på ventrum. Med den, plasserer posterior koronale planet av blokkerte storhjernen på kanten av det andre filteret papir. Med dette filteret papir sted fremre kutt plan blokkert cerebrum på en dråpe cyanoakrylater på Vibratome cutting plate, cortex mot bladet.
    7. Med Vibratome, avskåret akkurat nok på bakre hjernen slik at hippcampus viser (Figur 2C).
    8. Ta en del, 2400 μ tykke i en 125 g rotte, 2700 μ tykk 200 g rotte. Overfør delen ved å bruke en bomullspinne på filteret papirer på petriskål(Fig. 2D).
    9. Klippe og lagre cingulate cortex med barberblad.
    10. Med en tannlege slikkepott, presse inn i distale kanten av corpus callosum å klippe det, så løsner det isocortex.
    11. Fra sin ventolateral margin, skrelle av hippocampus (figur 2E).
    12. Lagre midbrain.
    13. Ta en annen seksjon, 2400 mikrometer tykk 120 g rotte, 2500 mikrometer tykk 200 g rotte. Plasser seksjonen på filteret papirer på petriskål (figur 2F). Alternativt kunne fem 500 uM seksjoner tas på dette punkt for elektrofysiologi.
    14. Klippe og lagre cingulate cortex med barberblad.
    15. Gjør lateral kutt med barberblad på den interne kapselen å fjerne isocortex (Figur 2F).
    16. Gjør skrå kutt med barberblad for å fjerne amygdali (Figur 2F, G).
    17. Lage en boks kuttet med barberblad for å fjerne hypothalamus. Den lateralekutt er lateralt for ventromedial kjernen av hypothalamus, som er synlig. Vi gjør dorsal kutt like over det tredje ventrikkel eller ventral tegmentale området (figur 2H).
    18. Skyv stekespade i corpus callosum og trekker seg unna den lille stykke isocortex festet til hippocampus. Plasser den smale enden av spatelen ventral til hippocampus commissure og heve dorsally å trekke av hippocampus.
  5. Bevaring av RNA og protein i prøver av hjernevev og Blood:
    1. Medier for RNA-analyse:
      1. Brain: RNAlater RNA stabilisering reagens, # 76106 i Eppendorf-rør.
      2. Blod: PAXgene Blood RNA Tube (PreAnalytix, Quagen).
    2. Medier for protein (CORT) analysen fra blodet: Solution d-HBSS, w / o Ca2 + og Mg 2 +, (Quality biologiske, Inc).
    3. Lagring:
      1. Collected hjernevevet blir først lagret i en kurv av tørris til ikke mer enn 12 timer og deretter i -70 a ° C fryserfor bruk innen seks måneder, varigheten av studien.
      2. Innsamlede blodet holdes ved romtemperatur over natten for å tillate reagenser å trenge, hvoretter det lagres i en -70 ° C fryser for bruk innen 6 måneder, varigheten av studien.

3. Gene Microarray av Mitokondrielle & Mitokondrier-relaterte Nuclear Genes

Å studere rotte mitokondrie funksjoner i hjernen vev, har vi nylig utviklet rotte mitokondrie-neuron fokusert microarray (rMNChip) og bioinformatikk verktøy for rask identifisering av differensial veier i hjernevev 18. rMNChip inneholder 1500 gener involvert i mitokondrie funksjoner, stress respons, døgnrytme og signaltransduksjon. Den bioinformatikk verktøyet inneholder en algoritme for beregning av ulikt uttrykte gener, og en database for enkel og intuitiv tolkning for microarray resultater.

  1. Renselsesprosessn av total RNA fra vev (Cat # GPM-Kit 2011-1, GenProMarkers):
    1. Rottehjernen vev av spesifikke kjerner i RNA senere RNA stabilisering reagens (Qiagen).
    2. Vev (30 mg i 600 ul GPM-L / B buffer) homogenisering med Ultra-Turrax T8 på Dispergierstation (IKA Labortechnik).
    3. Sentrifuger i 1,5 ml rør ved Sorvall 21.000 opm i 15 min.
    4. Dekanter supernatanten i spinn kolonne med en 2-ml samling rør.
    5. Sentrifuger kolonnen-rør ved 15.000 rpm i 3 min, kast gjennomstrømning.
    6. Legg 700 pl GPM-S / H-buffer til hver av spin kolonnene, sentrifuger kolonneinnsetting rørene 16.000 opm i 15 sek, forkaste gjennomstrømningskanalen.
    7. Tilsett 500 pl GPM-W buffer til hver av spin kolonnene, sentrifuger kolonneinnsetting rørene 16.000 opm i 15 sek, gjenta gang.
    8. Plasser spin kolonnen i en ny 1,5 ml samling rør.
    9. Tilsett 30 pl DEPC-behandlet vann til hver av de spinn kolonner, sentrifuger ved 16 000 opm i1 min, gjentar gang.
    10. Måle RNA konsentrasjon, justere konsentrasjonen til 1 ug / ul med DNase-& RNase-fritt vann, prøvene er klare for microarray merking.
  2. Microarray merking og hybridisering (Cat # Array 900, Genisphere):
    1. 1,0 mikrogram rotte total RNA brukes til cDNA syntese og microarray merking etter produsentens instruksjoner.
    2. Microarray hybridisering er utført på en rMNChip ved 65 ° C i 12-16 timer som tidligere beskrevet. 18
  3. Vasking hybridisert Mikromatrisestudier lysbilder (Cat # GPM0101-6, GenProMarkers):
    Vaskevannet Volum 20 X SSC 10% SDS DDH 2 O
    0,5 X SSC/0.01 SDS 500 ml 12,5 ml 0,5 ml opp til 500 ml
    0,5 X SSC 500 ml 12,5 ml opp til 500 ml
    0,1 X SSC 500 ml 2,5 ml opp til 500 ml
    0,01 X SSC 500 ml 0,25 ml opp til 500 ml

    Under vasking lysbildene bør beskyttes mot lys. Ikke la lysbilder tørke ut på noe tidspunkt.
    1. Vask lysbilder i 250-ml Løsning 1 i et glass Coplin jar (Cat #: 70312-20, elektronmikroskopi Sciences, Hatfield, PA) ved romtemperatur ved å røre glasset på en BioShaker (Molecular Technologies Inc., St. Louis, MO ) før alle dekkglass falle av glassplater (det tar <3 minutter).
    2. Vask objektglassene med 250 ml Løsning 2 i en annen krukke ved omrøring av glasset i 3 min.
    3. Vask lysbilder med 250-ml Løsning 3i en annen krukke ved å rotere slagverktøyet i 3 min, å gjenta dette trinnet to ganger.
    4. Vask objektglassene med 250 ml Løsning 4 i en annen krukke for 10 sek. Umiddelbart tørke lysbildene ved sentrifugering glassene plassert på PN11779 plater og ST-H750 rotor i en Sorvall Super T21 sentrifuge ved 1000 rpm i 5 min.
    5. Plasser de vaskede lysbilder i en boks for skanning så snart som mulig.
  4. Microarray image skanning og analyse ved hjelp ScanArray Express Microarray Scanner (PerkinElmer) etter bruksanvisningen og fokus på:
    1. Microarray bildeskanning: enkel skanning vs skanning protokollen.
    2. Effekter av laser makt, PMS og normalisering metoder på data utfall.
    3. Justering av GAL filen på bildet.
    4. Justering av områder til nett nøyaktig.
  5. Dataanalyse: Den tilpassede beregningsorientert prosedyrer for microarray data analyse inkluderer microarray image evaluering, data filtrering, spot størrelse korreksjon, inkludering, normalization og sammenligning som tidligere beskrevet 18. I tillegg, de metoder for ontologi, bane og nettverk analyser er den samme som beskrevet tidligere for å sikre dannelsen av reproduserbar og verifiserbar microarray resultater 2, 22, 25, 19, 20, 8, 23, 18.

4. Blodprøvetakning og Plasma CORT konsentrasjonsmåling

  1. Pre-eller post-stress hale blodprøver fra bedøvede dyr er samlet på dag-1, 14, 21 og 30 i hepariniserte rør for bestemmelse av sirkulerende Cort nivåer.
  2. Trunk blodprøver er også samlet inn hepariniserte rør etter dyr avlives. Plasma ble ekstrahert og lagret ved -70 ° C inntil analyse.
  3. Medier for plasma utvinning:
    1. Blodprøver for RNA ekstraksjon er samlet inn ved hjelp PAXgene Blood RNA rør (PreAnalytix, Quagen)
    2. Blodprøver for DNA-ekstraksjon er samlet inn ved hjelp PAXgene Blood DNA rør (PreAnalytix, Quagen). Blodprøver for protein analyse er samlet inn ved hjelp Lithium Heparin Capillary Collection tube (200 pl) fra MaketLab # ML5601.
  4. Plasma CORT konsentrasjon er testet og analysert med Active Rat Cort EIA (Diagnostic Systems Labs Inc. http://www.beckmancoulter.com/ ) som følger:
    1. Merk Mikrotitreringsplaten strimler som skal brukes.
    2. Forbered Rat CORT enzymforening Solution ved å fortynne Rat CORT enzymforening Konsentrat i konjugat Diluent.
    3. Pipette 25 pl standarder, kontroller og ukjente i brønner.
    4. Tilsett 100 pl enzymforening løsning til hver brønn med en semi-automatisk dispenser. Bank forsiktig på den vel innehaveren 5-10 sek.
    5. Tilsett 100 pl Rat CORT Antiserum til hver brønn med en semi-automatisk dispenser.
    6. Inkuber brønnene ved romtemperatur, 25 ° C, på en ristemaskin sett ved 500-700 rpm i 60 min.
    7. Aspirer og vask hver well 5 ganger med vaskeløsning ved hjelp av en automatisk mikrotiterplatevasker. Tørk ved å snu platen på et absorberende materiale.
    8. Tilsett 100 pl av TMB kromogenløsningen i hver brønn med en semi-automatisk dispenser.
    9. Inkuber ved romtemperatur 15-20 min på en orbital mikroplate shaker satt til 500-700 rpm. Se fargeendring.
    10. Tilsett 100 pl Stoppløsning i hver brønn med en semi-automatisk dispenser.
    11. Riste plate hånd 5-10 sek.
    12. Les absorbansen av løsningen i brønnen innen 30 min.
    13. Filteret er satt ved 450 nm. * EIA kits kan også kjøpes på Immunobiological Laboratories ( www.ibl-america.com ).

5. Representant Resultater

Figur 1
Figur 1. Rotter er behersket og utsatt for hale sjokk. Etterfølgende kroppsvekt, Er plasma corticosterone konsentrasjon, og akustisk sjokkrespons målt A:. Stress Exposure: Dyr er hemmet av å være immobilisert i en ventilert plexiglass rør. Førti elektriske støt (2 mA, 3 sek varighet ;) leveres til halene på semi-tilfeldige intervaller på 150-210 sek B og C:. Stress forsinker gevinst i kroppsvekt under vekst: Kroppsvekt og mat og vann forbruk er målt umiddelbart før stress (Dag -3), på dagen for de tre dagene med stress og deretter annenhver dag der etter opp til dag 14. Mangelen på gevinst på kroppsvekt under stress er aldri kompensert D:.. Stress øker plasma corticosterone konsentrasjon E: Akustisk skremmeeffekt: Dyr er testet én dag før stress (dag-1) som en baseline lesing og 12 dager etter den siste dagen av de påfølgende tre dagene av stress. Dataene for hver gruppe - Stress og kontroll - er uttrykt som prosent av akustiskskremme på dag 12 i forhold til dag -1. Stress øker markant den akustiske skremmeeffekt refleks. Klikk her for å se større figur .

Figur 2
Figur 2 Disseksjon av amygdala, hippocampus, og hypothalamus fra hjernen skive A:.. Rat hjernen, ventral view: Piler peker på midten cerebrale arterier B:. Hjernen blokk, ventral view, klar til å bli transportert til Vibratome. C: Hjernen blokken limt til vibratome skuffen, kaudale side opp, cortex vender bladet. Caudal hjernen har allerede blitt kuttet bort utsette caudal hippocampus. Blokken er nå klar for de 2.500 mikrometer slice inneholdende hoveddelen av hippocampus tas D:. Den 2.500 um tykk skive inneholdende caudal hippocampus E:. Than isocortex (ISO) er skrellet fra hippocampus (HC) og hippocampus skrelles fra midbrain F:.. Den 2.500 um tykk skive inneholdende amygdala og rostral hippocampus G: isocortex har blitt skåret ut og amygdala (Amyg) resected . H:. Hypotalamus (HT) er fjernet og erstattet Klikk her for å se større figur .

Figur 3
Figur 3. Expression nivåer for mRNA av glukokortikoidreseptoren (GR) og minerocorticoid reseptor (MR) i amygdala, hippocampus, hypothalamus og frontal cortex før (C, kontroll) og etter (Str) hale-shock stress. Enheter er andelen av kontroll, barer er SEM A: Amygdala: Stress reduserer minerocorticoid reseptor mRNA uttrykk B: Hippocampus: Stress økt.ses minerocorticoid reseptor mRNA uttrykk C:. Hypothalamus:. Stress øker minerocorticoid reseptor mRNA uttrykk D: Frontal Cortex: Stress reduserer glukokortikoidreseptor mRNA uttrykk samt minerocorticoid reseptor mRNA uttrykk.

De (121bp) PCR primere for rotte GR er: 1f.CCACTGCAGGAGTCTCACAA
1rAACACCTCGGGTTCAATCAC
Den (99 bp) PCR primere for rotte MR er: 1f.GCCTTCAGCTATGCCACTTC
1rAACGTCGTGAGCACCTTTCT

Figur 4
Figur 4. Cluster og heatmap av RNA differensielt uttrykt fra 64 gener avledet fra 5 rottehjernen vev, inkludert cerebellum (CL), cerebrum (CR), frontal cortex (FC), hypothalamus (HT), og hippocampus (HC). Color kartet viser fold endringer i degen-(grønn) og opp-(rød) uttrykte gener. (A) Cluster og heatmap over de normaliserte signal intensiteter av 9 målinger for hver av 64 gener avledet fra 15 microarray eksperimenter for disse fem hjernevev. Uttrykket av hvert gen ble målt ved tekniske triplicates og eksperimentelle triplicates. (B) Cluster og heatmap av gjennomsnittlige RNA nivåer av disse 9 målinger av hvert av de 64 gener. Disse resultatene viser klare forskjeller i mitokondrie genuttrykk og dermed beslektede funksjoner, som støtter vår hypotese om at ulike områder av hjernen har forskjellige energibehov. Klikk her for å se større figur .

Vår søknad av rMNChip og bioinformatiske verktøy ført til identifikasjon av en klynge og heatmap av 64 gener med differensielt uttrykt RNA avledet fra 5 rotter hjernevev inkludert cerebellum (CL), cerebrum (CR), frontal cortex (FC), hypothalamus (HT), og hippocampus (HC) (Figur 4). Disse data viser klare forskjeller i mitokondrie genuttrykk og dermed relaterte funksjoner. Resultatene viser at de forskjellige områder av hjernen krever forskjellig mengde energi for å utføre tilsvarende hjernefunksjoner.

Discussion

Diagnostisering av PTSD er basert på selvrapporterte psykiske symptomer (DSM IV) etter potensielle fag. Ingen veldefinert biomarkør er for tiden tilgjengelig for å få tilgang til patofysiologiske status potensial PTSD pasienter. PTSD er en lidelse provosert av livstruende traumatiske hendelser og de viktigste psykiatriske symptomer være til stede i den overlevende liv i måneder og kanskje år etter den første hendelsene. De mest fremtredende og vedvarende symptomer avdekket hos pasienter med PTSD er vaktsomhet, forsinket overdrevet skremmeeffekt 14, 15, 16 og en tilsynelatende kompromiss av HPA-aksen. Hos mennesker er disse symptomene igjen, eller vises med en forsinkelse på tre måneder, etter opphør av traumatiske stressor 24. Vår nåværende modell for biomarkør studier av PTSD sysselsetter tilbakeholdenhet og hale sjokk gjentas for tre sammenhengende dager (2-timers økter på 40, 2 mA tailshocks) - den uunngåelige halen-sjokk modell (ITS) i rotter som veier 150 gram. Dette ITS modellen harblitt vist å etterligne i betydelig utstrekning patofysiologien av PTSD 17, 7, 4, 10. Vår lab og andre laboratorier har bekreftet at ITS modell av stress hos rotter induserer atferdsmessige og nevrobiologiske endringer som er lik dem som finnes i PTSD 17 personer, 7, 10, 9. Spesielt disse stressede rotter viser (1) en forsinket og overdrevet skremmeeffekt vises flere dager etter stressor opphør, som har gitt den komprimerte tidsskala av rotte liv i forhold til en mennesker, tilsvarer den til tre måneder forsinket symptomer i PTSD pasienter (DSM-IV-TR PTSD kriteriet D / E 13), (2) forbedret plasma corticosterone (CORT) for flere (10) dager, noe som indikerer kompromiss av hypothalamopituitary aksen (HPA), og (3) tilbakestående vektøkning etter stressor opphør, tilsvarende dysfunksjon av metabolske regulering av PTSD. Det er ingen bevis i litteraturen at reven lukt, predator eksponering, eller frykter Forsterket skremmeeffekt, exhiLitt disse vedvarende atferdsmessige og neuroendocrinologic fenotyper forbundet med PTSD.

Rotter eksponert for en enkelt belastning økt (1DS) har stilt forbigående, men ikke vedvarende avvik vises av 3DS rotter 17 Den nåværende eksperimentet sammenlignet skremmeeffekt av 3DS og 1DS 4 rotter, 7 og 10 dager etter stressor opphør. Konsistent med tidligere arbeid, understreket rotter viste forhøyede basal plasma Cort nivåer første dag etter stresset 17. Disse Cort nivåene var følsomme for antall stressor eksponeringer med høyere Cort nivåer i 3DS rotter enn i 1DS rotter. Som for skremmeeffekt, de 1DS rotter viser en overdrevet sjokkrespons 7 dager etter stressor, mens skremmeeffekt sensibilisering bare blir tydelig 10 dager etter stressor i 3DS rotter. Dermed ser utseendet til et overdrevet skremmeeffekt etter stressor opphør å være relatert til antall av stress session eksponeringer. 3DS stresset modellen ser ut til åvære nyttig for å få innsikt i den endrede uttrykk biomarkører forbundet med symptomer på PTSD og nøkkelen målbare atferdsmessige fenotyper forbundet med timingen etter opphør av stress. Genomisk resultatene presentert bevis på prinsippet for å søke rMNChip og bioinformatikk verktøy for å identifisere differensial veier, og gen-og protein biomarkører, som vil i stor grad forenkle systemer-biologiske studier og forståelse av molekylære mekanismene bak komplekse og multifaktorielle nevrologiske lidelser, inkludert PTSD.

Mens våre paradigme ikke dykke ned i kognitive og mer komplekse atferdsmessige aspekter av PTSD, noterer vi at endrede søvnmønster i sin modell en tilsvare vanskeligheter med å falle og forbli sovende og mareritt av PTSD pasienter 11 (DSM-IV-TR PTSD Kriterier D 13), og de ​​mangler i flukt / unngåelse læring og læring av en appetitive oppgave i modellen ITS 5 (DSM-IV-TR PTSD Kriterier C 13). Den nåværende modellen korrelerer godt med de viktigste symptomene er karakteristiske for PTSD og gir en god modell for å korrelere perifere biomarkører for PTSD, som kan hentes fra pasienter, med sentrale, mekanistiske biomarkører, som ikke kan 6.

Disclosures

Ingen interessekonflikter erklært.

Acknowledgments

Dette arbeidet ble støttet av CDMRP, USUHS Grants G188LE, G188MG, og G188QC (til HL), og USUHS Senter for studier av traumatisk stress.

References

  1. Adrien, J., Dugovic, C., Martin, P. Sleep-wakefulness patterns in the helpless rat. Physiol. Behav. 49, 257-262 (1991).
  2. Bai, X., Wu, J., Zhang, Q., Alesci, S., Manoli, I., Blackman, M. R., Chrousos, G. P., Goldstein, A. L., Rennert, O. M., Su, Y. A. Third-generation human mitochondria-focused cDNA microarray and its bioinformatic tools for analysis of gene expression. Biotechniques. 42, 365-375 (2007).
  3. Blaszczyk, J. W. Startle response to short acoustic stimuli in rats. Acta Neurobiol. Exp. (Wars.). 63, 25-30 (2003).
  4. Braga, M. F., roniadou-Anderjaska, V., Manion, S. T., Hough, C. J., Li, H. Stress impairs alpha(1A) adrenoceptor-mediated noradrenergic facilitation of GABAergic transmission in the basolateral amygdala. Neuropsychopharmacology. 29, 45-58 (2004).
  5. Bremner, J. D., Vythilingam, M., Vermetten, E., Anderson, G., Newcomer, J. W., Charney, D. S. Effects of glucocorticoids on declarative memory function in major depression. Biol. Psychiatry. 55, 811-815 (2004).
  6. Garrick, T., Morrow, N., Eth, S., Marciano, D., Shalev, A. Psychophysiologic parameters of traumatic stress disorder in rats. Ann. N.Y. Acad. Sci. 821, 533-537 (1997).
  7. Garrick, T., Morrow, N., Shalev, A. Y., Eth, S. Stress-induced enhancement of auditory startle: an animal model of posttraumatic stress disorder. Psychiatry. 64, 346-354 (2001).
  8. Hsiao, Y. H., Su, Y. A., Tsai, H. D., Mason, J. T., Chou, M. C., Man, Y. G. Increased invasiveness and aggressiveness in breast epithelia with cytoplasmic p63 expression. Int. J. Biol. Sci. 6, 428-442 (2010).
  9. Jiang, X., Xing, G., Yang, C., Verma, A., Zhang, L., Li, H. Stress Impairs 5-HT(2A) Receptor-Mediated Serotonergic Facilitation of GABA Release in Juvenile Rat Basolateral Amygdala. Neuropsychopharmacology. , (2008).
  10. Jiang, X., Zhang, Z. J., Zhang, S., Gamble, E. H., Jia, M., Ursano, R. J., Li, H. 5-HT2A receptor antagonism by MDL 11,939 during inescapable stress prevents subsequent exaggeration of acoustic startle response and reduced body weight in rats. J. Psychopharmacol. , (2009).
  11. Maher, H. K. Sleep deprivation: are you a victim. AAOHN. J. 54, 548 (2006).
  12. Maier, S. F. Exposure to the stressor environment prevents the temporal dissipation of behavioral depression/learned helplessness. Biol. Psychiatry. 49, 763-773 (2001).
  13. North, C. S., Suris, A. M., Davis, M., Smith, R. P. Toward validation of the diagnosis of posttraumatic stress disorder. Am. J. Psychiatry. 166, 34-41 (2009).
  14. Orr, S. P., Metzger, L. J., Pitman, R. K. Psychophysiology of post-traumatic stress disorder. Psychiatr. Clin. North Am. 25, 271-293 (2002).
  15. Orr, S. P., Roth, W. T. Psychophysiological assessment: clinical applications for PTSD. J. Affect. Disord. 61, 225-240 (2000).
  16. Pitman, R. K., Orr, S. P., Shalev, A. Y., Metzger, L. J., Mellman, T. A. Psychophysiological alterations in post-traumatic stress disorder. Semin. Clin. Neuropsychiatry. 4, 234-241 (1999).
  17. Servatius, R. J., Ottenweller, J. E., Natelson, B. H. Delayed startle sensitization distinguishes rats exposed to one or three stress sessions: Further evidence toward an animal model of PTSD. Biological Psychiatry. 38, 539-546 (1995).
  18. Su, Y. A., Zhang, Q., Su, D. M., Tang, M. X. Rat Mitochondrion-Neuron Focused Microarray (rMNChip) and Bioinformatics Tools for Rapid Identification of Differential Pathways in Brain Tissues. Int. J. Biol. Sci. 7, 308-322 (2011).
  19. Su, D. M., Zhang, Q., Wang, X., He, P., Zhu, Y. J., Zhao, J., Rennert, O. M., Su, Y. A. Two types of human malignant melanoma cell lines revealed by expression patterns of mitochondrial and survival-apoptosis genes: implications for malignant melanoma therapy. Mol. Cancer Ther. , (2009).
  20. Identification of stress-responsive genes, canonical pathways, molecular networks and drug targets in brain tissues of human and animals for systems-biology study of post-traumatic stress disorder. Su, Y. A., Li, H., He, P., Webster, M. J., Zhang, Q., Zhang, L., Wang, X., Su, D. M., Ursano, R. J., Rennert, O. M. The DOD Congressionally Directed Medical Research Programs, the third Military Health Research Forum (MHRF), August 31 - September 3, 2009, Hallmark Crown Center, Kansas City, Missouri, , (2009).
  21. Su, Y. A., Wu, J., Zhang, L., Zhang, Q., Su, D. M., He, P., Wang, B. D., Li, H., Webster, M. J., Rennert, O. M., Ursano, R. J. Dysregulated mitochondrial genes and networks with drug targets in postmortem brain of patients with posttraumatic stress disorder (PTSD) revealed by human mitochondria-focused cDNA microarrays. Int. J Biol. Sci. 4, 223-235 (2008).
  22. Su, Y. A., Yang, J., Tao, L., Nguyen, H., He, P. Undetectable and Decreased Expression of KIAA1949 (Phostensin) Encoded on Chromosome 6p21.33 in Human Breast Cancers Revealed by Transcriptome Analysis. J. Cancer. 1, 38-50 (2010).
  23. Yehuda, R., Yang, R. K., Buchsbaum, M. S., Golier, J. A. Alterations in cortisol negative feedback inhibition as examined using the ACTH response to cortisol administration in PTSD. Psychoneuroendocrinology. 31, 447-451 (2006).
  24. Zhang, Q., Wu, J., Nguyen, A., Wang, B. D., He, P., Laurent, G. S., Rennert, O. M., Su, A. Molecular mechanism underlying differential apoptosis between human melanoma cell lines UACC903 and UACC903(+6) revealed by mitochondria-focused cDNA microarrays. Apoptosis. 13, 993-1004 (2008).

Tags

Medisin genetikk fysiologi nevrovitenskap immunologi PTSD biomarkør stress frykt skremmeeffekt corticosterone dyr modell RNA RT-PCR genet chip cDNA microarray oligonukleotid microarray amygdala prefrontal cortex hippocampus cingulate cortex hypothalamus hvite blodlegemer
Biomarkører i en dyremodell for Avslører Neural, Hematologic, og Behavioral korrelerer av PTSD
Play Video
PDF DOI

Cite this Article

Jia, M., Meng, F., Smerin, S. E.,… More

Jia, M., Meng, F., Smerin, S. E., Xing, G., Zhang, L., Su, D. M., Benedek, D., Ursano, R., Su, Y. A., Li, H. Biomarkers in an Animal Model for Revealing Neural, Hematologic, and Behavioral Correlates of PTSD. J. Vis. Exp. (68), e3361, doi:10.3791/3361 (2012).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter