Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

Biomarkörer i en djurmodell för att avslöja Neurala, Hematologiska och Behavioral korrelat till PTSD

Published: October 10, 2012 doi: 10.3791/3361
Automatic Translation
1, 2, 1, 1, 1, 2, 1, 1, 2, 1
1Department of Psychiatry, Center for the Study of Traumatic Stress, Uniformed Services University of the Health Sciences, Bethesda, Maryland, 2Department of Gene and Protein Biomarkers, GenProMarkers, Inc.

Summary

Vi beskriver en råtta modell av posttraumatiskt stressyndrom (PTSD) som avslöjar ihållande förändringar i neuroendokrin funktion och det fördröjda långsiktigt överdriven rädsla svar, kännetecknar PTSD patienter. Den djurmodell och metoder som beskrivs här är användbara för att korrelera biomarkörer i hjärnan kärnor, som är mekanistisk men kan inte mätas i patienter, med biomarkörer i perifera vita blodkroppar, vilket kan.

Abstract

Identifiering av biomarkörer som representerar utvecklingen av patofysiologin vid Post Traumatic Stress Disorder (PTSD) är mycket viktigt, inte bara för objektiv diagnos, men också för utvärdering av terapeutiska effekt och motståndskraft mot trauma. Pågående forskning är inriktad på att identifiera molekylära biomarkörer för PTSD, inklusive traumatisk stress inducerade proteiner, transcriptomes, genomiska avvikelser och genetiska modulatorer, som använder biologiska prover från försökspersonernas blod, saliv, urin och obduktion hjärnvävnad. Dock fortfarande korrelationen av dessa biomarkörer molekyler i perifera eller döden prover till förändrade hjärnfunktioner samband med psykiatriska symptom i PTSD olöst. Här presenterar vi en djurmodell av PTSD i vilken både perifert blod och centrala biomarkörer hjärnan, liksom beteendemässiga fenotyp, kan uppsamlas och mätas, vilket ger den nödvändiga korrelationen av de centrala biomarkörer för PTSD, som är mekaniskt och pathognomonic men kan inte hämtas från människor med de perifera biomarkörer och beteendemässiga fenotyper, som kan.

Vår djurmodell av PTSD sysselsätter återhållsamhet och stötar svans upprepas för tre kontinuerliga dagar - det ofrånkomliga svans-chock modell (ITS) i råttor. Detta dess modell efterliknar patofysiologin av PTSD 17, 7, 4, 10. Vi och andra har verifierat att dess modell inducerar beteendemässiga och neurobiologiska förändringar liknande de som finns i PTSD ämnen 17, 7, 10, 9. Specifikt dessa stressade råttor uppvisar (1) en fördröjd och överdriven reaktion vid oväntade yttre visas flera dagar efter stressfaktor upphörande, vilket med tanke på den komprimerade tidsskala råttans livslängd jämfört med en människa, motsvarar den 1-3 månaders försening av symtom i PTSD patienter (DSM-IV-TR PTSD Criterian D / E 13), (2) ökad plasma kortikosteron (CORT) i flera dagar, vilket indikerar kompromiss av hypothalamopituitary axeln (HPA), och (3) efterbliven body viktökning efter stressfaktor upphörande, vilket indikerar dysfunktion av metabolisk reglering.

De experimentella paradigm som används för denna modell är: (1) en inlärd hjälplöshet paradigm hos råtta analyserades genom mätning av akustisk reaktion vid oväntade yttre (ASR) och en kartläggning av kroppsmassa, (2) mikrodissektion av råtthjärna i regioner och kärnor, ( 3) enzymkopplad immunosorbentanalys (ELISA) för blodnivåer av CORT, (4) en genexpression microarray plus relaterad bioinformatik verktyg 18. Denna microarray, dubbad rMNChip, fokuserar på mitokondriella och mitokondrier-relaterade nukleära gener i råtta så speciellt för att hantera de neuronala bioenergetik hypotes att delta i PTSD.

Protocol

1. Animal Behavioral modell av PTSD

  1. Ämnen: Man albino Sprague Dawley-råttor (Taconic Farms, Derwood, MD) användes, viktning 150 till 200 g vid tidpunkten för administrering av stress protokollet.
  2. Mätning av mat, vatten intag och viktökning: Vid ankomsten i laboratorieråttor vägande 100 ± 25 g inryms två till en bur (bur storlek: 45x24x20 cm). Cage stoppning substrat (flis) byts två gånger per vecka. Djuren hålls på en omvänd 12-timmar ljus cykel (ljus på: 1800/0600 och av: 0600-1800) i en temperatur (22 ± 4 ° C) - och den relativa luftfuktigheten (30-70%)-kontrollerad miljö en vecka före experiment. Vatten och standard pelleterat foder (Harlan (2018) 18% protein Gnagare kost, Global dieter, Harlan Teklad) är fritt tillgängliga i hemmet burar och bodyweights registreras dagligen 3 dagar före, 3 dagar under och 3 dagar efter avslutad stressen .
  3. Acklimatisering: Råttor acklimatiserades i tre dagar till Boe djuret anläggningen och en akustisk startle kammare. Att acklimatisera dem till den akustiska startle kammaren djuren hanteras i det i 5 minuter varje dag under tre på varandra följande dagar före de första mätningarna.
  4. Stressad protokoll: Djuren är lika tilldelas varje grupp baserat på deras kroppsvikt och baslinje skrämsel. Tester utförs på två grupper av djur, varvid varje grupp bestod av 16 djur. Grupp 1 erhåller stress protokollet, och grupp 2 är kontrollen.
    Den stress exponering protokollet är en kontinuerlig 2-HR procedur, där varje session består av återhållsamhet ("oundviklig") och svans-chocker, upprepas en gång om dagen under 3 dagar i följd. Betona sker på morgonen (i fönstret i 0800 och 1200). Djuren är fastspända med att immobiliseras i ett ventilerat plexiglas rör. Fyrtio elchocker (2 mA, 3 sek varaktighet, djurförsök Cage gallergolv Shocker, Coulbourn Instruments, USA) levereras till deras svansar på halvslumpvalda intervall 150 tonO 210 sek (Grafisk statliga notation programvara, Habitest Universal Link, Coulbourn Instruments, USA). Stimulering vid 2 mA valdes eftersom den är aversiv, men inte smärtsamt, när den stimulerande utsignalen placeras över försöksledaren finger. Elektrodgel appliceras med Q-tips att bilda ett tunt skikt av ledande gel mellan elektroden och huden på råttans svans. Elektrodelementen klippen justeras och anslutna till svansen att säkerställa en god förbindelse utan att påverka blodcirkulationen av svansen.
  5. Akustisk skrämsel (ASR): Akustisk reaktion vid oväntade yttre mätning utfördes med en skrämsel Acoustic Test System (Coulbourn Instruments, Columbus, Ohio, USA) 3. Detta system består av vikt-känsliga plattformar i en ljud-dämpad kammare. Omvandlaren, som är en töjningsmätare, i varje skrämmer plattformarna kräver kalibrering före användning. Först måste kopplaren vara i DC-kopplade läget för kalibrering. I detta läge, kopplingen produktion direkt följer input från plattformen, läget som krävs för kalibrering med statiska vikter. Givaren kopplas till AC kopplade läget under experiment så att endast en snabb förändring i kraft, vilket tyder skrämsel, matas ut. Djurens rörelser som svar på ljudstimuli således mäts som en spänning förändring genom en töjningsgivare inuti varje plattform och registreras som den maximala responsen inträffar inom 200 ms starten av den skrämma-framkallande stimulans.
    Det finns sex typer av stimulansåtgärder prövningar: 100 dB ensam, 100 dB med pre-puls, 110 dB enbart 110 dB med pre-puls, före puls ensam och ingen stimulans kontroll. Varje försök typ presenterades åtta gånger. Trial typer presenteras i slumpmässig ordning för att undvika ordningens effekter och tillvänjning. Inter-rättegång intervall varierar slumpmässigt från 15 till 25 sekunder. Bland de åtta försöken endast maximivärden samlas i resultaten och slutligen justeras med djurets kroppsvikt samma dag. Djuren testas en dag Böre stress eller annan behandling som en baslinje läsning och 1, 7, 14 och 21 dagar efter den sista dagen av de på varandra följande 3 dagar stressen förfarande eller annan behandling.
  6. Dataanalys:
    1. ASR: Amplituden av akustisk reaktion vid oväntade yttre testade varje gång representeras som "% av baslinjen", som beräknas med hjälp av ekvationen:% av utgångsvärdet = (absolut amplitud / baslinjen absolut amplitud) × 100%. För varje testdag är ANOVA för upprepade mätningar utförs på skrämmer amplituder med faktorer till stress status och drog dosering med SPSS (version 16) mjukvara. Tukey, Bonferroni eller Dunnett tester används för att bedöma betydande post-hoc skillnader mellan olika grupper. De data representeras som medelvärde ± SEM
    2. Tillväxt: Kroppsvikt och mat och vatten förbrukning mäts på dag -1 föregående stress och på dagarna 14, 21 och 30 efter genomförandet av stress protokollet. Statistisk analys: De mat-och vätskeintag uppgifter genomgått en-sätt upprepad åtgärder variansanalys (ANOVA). Att analysera förändringarna i livsmedelskonsumtion hastighet över tiden, är mängden av födointag ytterligare dividerat med kroppsvikten hos patienten för att minimera variansen i kroppsvikt som induceras av stressen protokollet och ursprungliga skillnaden i kroppsvikt mellan grupperna. Alla procedurer utförs under godkännande i enlighet med de institutionella Animal Care och användning kommittén (IACUC).

2. Brain Dissektion

  1. Instrument och material:
    1. Anestesi burk: ". Krydda burk" Detta är en glasburk med lock, mäter ca 6 inches hög och 5 inches i diameter, såsom en "apotekare burk", "bomull boll burk", eller
    2. Giljotin för råttor, såsom tillhandahålls av Kent Scientific.
    3. Vibratome 1000:
      1. Skär rakblad i halv longitudinellt, tvättolja av med alkohol, sätt i klämman.
      2. Fyll badkaret med vanligt krossad is.
      3. Platsfacket längdled.
      4. Torka facket av fukt innan du placerar en droppe cyanoakrylat.
    4. Rongeurs (exempel är en Micro Friedman rongeur från Miltex, kat. Nr. 17-4801 eller Pearson rongeur från Fine Science Tools kat. Ingen 16.015-17).
    5. # 3 eller # 5 juvelerare pincett (skarp att dra bort dura).
    6. Små sax med vassa spetsar (Vantage V95-304 är ett exempel).
    7. (2) Platta rostfria mini spatlar, såsom används för att överföra pulverformiga kemikalier till en balans skala. Den breda änden är böjd framåt så att den passar mellan telencefalon och Calvarium.
    8. Sked för att överföra hjärnans blocket. (En plast soppsked från cafeterian fungerar bra.)
    9. Skalpell # 10.
    10. Dubbel kant rakblad (kolstål):
      1. En halv till vibratome.
      2. En halv till dissektion.
    11. Två glas petriskålar, ~ 3,5 inches och 4 tum i diameter, så att en passar inuti den andra. Krossad is i bottom skålen. Två filterpapper i den övre skålen. Flytta skiva till önskade positioner genom att flytta filterpapperet.
    12. 100 ml bägare.
    13. Pipett för att bevattna hjärnan med is kylda en GSR. (Glas pasteurpipett med smal ände införd i 1/2 tum bred latex glödlampa fungerar bra.)
    14. Krossad is fack: Om 5 inches hög, 20 inches lång, 10 inches bred. Innehåller:
      1. Stick alla instrument i krossad is.
      2. Låg kalcium / hög magnesium aCSF i plastflaska som kan slog att krossa isen.
      3. Cyanoakrylat.
    15. Låg kalcium / hög magnesiumhalt artificiell cerebrospinalvätska (aCSF):
      1. I mm: 125 NaCl, 2,5 KCl, 0,5 CaCl 2 * 2H 2 O, 2,0 MgCl 2 * 6H 2 0, 1,2 NaH 2 PO 4 * H 2 O, 25 NaHCOs, 11 Glukos.
      2. I plastflaska som kan slog att krossa isen.
      3. Chill för 20 min i -80 ° C frys för att göra det till en slask.
    16. Bomullstoppar.
    17. Filtrerpapper: Whatman 42,5 mm (kat nr 1001 042.).
    18. Mini centrifugrör att samla mindre delar av vävnad.
    19. Wells platta för att samla större strukturer och delar av vävnad.
    20. Pappershandduk.
    21. Röd Biohazard påse.
  2. Anestesi:
    1. Anestesi burk, gaskuddar, isofluran, metall pincett, är placerade i ett dragskåp.
    2. Råttan placeras i anestesi burk.
    3. Fukta kompress med isofluran och plats i anestesi burken.
    4. Vänta tills pedalen reflex - ett tillbakadragande av tassen när banan är klämd med pincett - eller kornealreflex försvinner.
    5. Halshugga: Gripande råtta med en hand runt bröstkorgen bakifrån, halshugga råtta med giljotinen så nära till nackknöl som möjligt. Atlas kommer fortfarande oftast sitter kvar på skallen.
    6. Blod Samling: Squeeze råtta vid thorax för att förhindra blod från sprutande från halspulsåder.Gradvis relax grepp för att reglera flödet av blod in i uppsamlingsbehållaren.
  3. Borttagning av hjärnan:
    1. Snabbt klippa muskler och eventuellt kvarvarande ryggkotor från basiocciput med den lilla saxen.
    2. Använda rongeur och början på foramen magnum, skära bort occipital kondyler och basiocciput.
    3. Mittlinjen hårbotten snitt med skalpell.
    4. Med hjälp av sax, klippa en mitten sagittal snitt i skallbenet och parietala ben. Greppa skurna kanten av skallen med rongeurs, bryta tillbaka som ett äggskal från mittlinjen, var noga med att minimera all kontakt med hjärnan. Mittlinjen snitt och bryta tillbaka kan ske i etapper.
    5. Eftersom hjärnan är vidare exponerad, är det viktigt att släck den med is kyld aCSF att bevara integriteten och vitalitet av vävnaden.
    6. Likaså bryta temporala och frontala ben.
    7. Med fin pincett, riva bort duran och se till att få dententorum cerebelli.
    8. Med mini spatel införas under frontalloben höja hjärnan från Calvarium precis tillräckligt för att sätta spänning på de kraniala nerverna.
    9. Transekt de kranialnerver med sax.
    10. Lyft hjärnan helt från skallen och låt släpp i bägaren av iced låg kalcium / hög magnesium ACSF. Lämna en minut eller mer för att kyla så att vävnaden blir fast, kommer strukturerna klart synliga, och hälsan hos vävnaden bevaras.
    11. Med plast sked, överföra hjärnan på filterpapperet i isen kylda petriskål, ventrala sidan uppåt.
  4. Dissektion av hjärnan:
    1. Gör ett koronalt transektion med rakblad vid den mellersta cerebrala artären (figur 2A).
    2. Spara frontalloben tillfälligt is kylda låg kalcium / hög magnesium aCSF i 100 ml-glasbägare.
    3. Flip hjärnan så att den dorsala ytan är upp. Transekt hjärnstammen vid övergången av mellanhjärnan ennd diencaphalon. Den resulterande hjärnan blocket visas i figur 2B.
    4. Släpp blockerade storhjärnan tillbaka till iskallt låg kalcium / hög magnesium ACSF.
    5. Med hjälp av mini spatlar, dissekera cerebellum från medulla / pons. Spara i media som är lämpliga för avsedd analys.
    6. Returnera blockerade storhjärnan till petriskål. Med hjälp av två filterpapper, lyft hjärnan genom att placera ett filterpapper på ventrum. Med det placerar den bakre koronala plan blockerade hjärnan på kanten av den andra filterpapper. Med denna filterpapper plats den främre snittet plan blockerade hjärnan på en droppe cyanoakrylat på vibratome skärplatta, cortex mot bladet.
    7. Med vibratome, avskuren precis tillräckligt för kaudala hjärnan så att hippcampus visar (Figur 2C).
    8. Ta ett avsnitt 2.400 μ tjock i en 125 g råtta, 2.700 μ tjock i 200 g råtta. Överför avsnittet med en bomullspinne på filtret papper på petriskålen(Figur 2D).
    9. Klipp och spara cingulate cortex med rakblad.
    10. Med en tand spatel, tryck i den distala kanten på corpus callosum att klippa det, sedan dra av isocortex.
    11. Från dess ventolateral marginal lossna hippocampus (figur 2E).
    12. Spara mitthjärnan.
    13. Ta en andra sektion, 2.400 | im tjock i 120 g råtta, 2.500 | im tjock i 200 g råtta. Placera avsnittet om filterpapper på petriskålen (Figur 2F). Alternativt kan fem 500 um sektioner göras vid denna punkt för elektrofysiologi.
    14. Klipp och spara cingulate cortex med rakblad.
    15. Gör laterala snitt med rakbladet i den inre kapseln för att ta bort isocortex (figur 2F).
    16. Gör sneda snitt med rakblad för att ta bort amygdali (Figur 2F, G).
    17. Gör en låda skars med rakblad för att avlägsna hypotalamus. Den lateralasnitt är lateralt mot ventromediala kärnan i hypotalamus, som är synlig. Vi gör den dorsala snitt strax ovanför den tredje ventrikeln eller ventrala tegmentala område (figur 2H).
    18. Tryck spatel i corpus callosum och dra bort den lilla biten av isocortex fäst hippocampus. Placera den smala änden av spateln ventrala till hippocampus kommissuren och höja dorsalt att dra bort hippocampus.
  5. Bevarande av RNA och protein i prover av hjärnvävnad och blod:
    1. Media för RNA-analys:
      1. Brain: RNAlater RNA-stabilisering reagens, # 76106 i Eppendorf-rör.
      2. Blod: PAXgene Blood RNA Tube (PreAnalytix, Quagen).
    2. Media för protein (CORT) analys från blod: Lösning D-HBSS, w / o Ca2 + och Mg 2 +, (Quality Biological, Inc.).
    3. Förvaring:
      1. Uppsamlat hjärnvävnad lagras först i en korg av torris för inte mer än 12 timmar och sedan i en -70 ° C frysför användning inom 6 månader, hur länge studien.
      2. Uppsamlat blod hålls vid rumstemperatur över natten för att tillåta reagens att penetrera, varefter den lagras i en -70 ° C frys för användning inom 6 månader, varaktigheten av studien.

3. Gene Microarray av mitokondriell & Mitokondrierna-relaterade nukleära gener

Att studera råtta mitokondriella funktioner i hjärnan vävnader, har vi nyligen utvecklat råtta mitokondrierna-neuron fokuserad microarray (rMNChip) och bioinformatiska verktyg för snabb identifiering av differentiella vägar i hjärnan vävnader 18. rMNChip innehåller 1.500 gener involverade i mitokondriella funktioner, stress, dygnsrytm och signaltransduktion. I bioinformatik Verktyget innehåller en algoritm för beräkning av differentiellt uttryckta gener och en databas för enkel och intuitiv tolkning för microarray resultat.

  1. PurificatioN av totalt RNA från vävnader (Cat # GPM-Kit 2011-1, GenProMarkers):
    1. Råtthjäma vävnader av specifik kärnor i RNA RNA senare stabilisering reagens (Qiagen).
    2. Vävnad (30 mg i 600 ul GPM-L / B buffert) homogenisering med Ultra-Turrax T8 om Dispergierstation (IKA Labortechnik).
    3. Centrifugera i 1,5-ml rör vid Sorvall 21.000 rpm under 15 minuter.
    4. Dekantera supernatanten i en spinnkolonn med en 2-ml uppsamlingsrör.
    5. Centrifugera kolonn-rören vid 15.000 rpm under 3 minuter, kasta genomflödet.
    6. Lägg 700 pl GPM-B / W-buffert till varje spinnkolonner, centrifugeras kolonn-rören vid 16.000 rpm under 15 sekunder, kassera genomflödet.
    7. Lägg 500 pl GPM-W buffert till varje spinnkolonner, centrifugeras kolonn-rören vid 16.000 rpm under 15 sekunder, upprepa en gång.
    8. Placera spinnkolonn i ett nytt 1,5 ml uppsamlingsrör.
    9. Lägg 30 il DEPC-behandlat vatten till varje spinnkolonner, centrifugera vid 16.000 varv per minut för1 minut, upprepa en gång.
    10. Mät RNA-koncentrationen, justera koncentrationen till 1 ng / l med DNas-& RNas-fritt vatten, proverna är klara för microarray märkning.
  2. Microarray märkning och hybridisering (Cat # Array 900, Genisphere):
    1. 1,0 pg råtta totalt RNA användes för cDNA-syntes och microarray märkning enligt tillverkarens instruktioner.
    2. Microarray hybridisering utförs på en rMNChip vid 65 ° C under 12-16 timmar såsom tidigare beskrivits. 18
  3. Tvätt Hybridiserade Mikroarray Slides (Cat # GPM0101-6, GenProMarkers):
    Tvättlösningen Volym 20 X SSC 10% SDS DDH 2 O
    0,5 X SSC/0.01 SDS 500 ml 12,5 ml 0,5 ml upp till 500 ml
    0,5 x SSC 500 ml 12,5 ml upp till 500 ml
    0,1 x SSC 500 ml 2,5 ml upp till 500 ml
    0,01 X SSC 500 ml 0,25 ml upp till 500 ml

    Under tvättningen bilderna bör skyddas från ljus. Låt inte bilderna torka ut i något skede.
    1. Tvätta objektglasen i 250-ml lösning 1 i ett glas Coplin-kärlet (Kat #: 70.312-20, Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA) vid rumstemperatur genom omrörning av burken på en BioShaker (Molecular Technologies Inc., St Louis, MO ) tills alla täckglas falla av glasskivor (Det tar <3 minuter).
    2. Tvätta objektglasen med 250-ml lösning 2 i en annan burk genom att röra burken under 3 min.
    3. Tvätta diabilder med 250-ml lösning 3i en annan burk genom att rotera burken i 3 min, upprepa detta steg två gånger.
    4. Tvätta diabilder med 250-ml lösning 4 i en annan burk för 10 sek. Omedelbart torka objektglasen genom centrifugering burkarna ställs på PN11779 plattorna och ST-H750 rötor i en Sorvall Super T21 centrifug vid 1.000 rpm under 5 min.
    5. Placera tvättade bilder i en låda för skanning så snart som möjligt.
  4. Microarray bild skanning och analys med hjälp ScanArray Express Microarray Scanner (PerkinElmer) efter bruksanvisningen och fokusera på:
    1. Microarray bild skanning: Easy Scan vs skanning protokoll.
    2. Effekter av lasereffekt, PMT och normalisering metoder för data-resultat.
    3. Inriktning av GAL-filen till bilden.
    4. Justering av fläckar på galler exakt.
  5. Dataanalys: De anpassade beräkningsmodeller förfaranden för microarray analys av data inkluderar microarray bild utvärdering, uppgifter filtrering, punktstorlek korrigering, integration, normalization och jämförelse såsom beskrivits tidigare 18. Dessutom, metoderna för ontologi, pathway och nätverk analyser är desamma som tidigare beskrivits för att säkerställa alstringen av reproducerbara och kontrollerbara microarray resultat 2, 22, 25, 19, 20, 8, 23, 18.

4. Blod Provtagning och Plasma CORT koncentrationsmätning

  1. Pre-eller post-stress tail blodprover från bedövade djur samlas på dag-1, 14, 21 och 30 in i hepariniserade rör för bestämning av cirkulerande nivåer CORT.
  2. Trunk blodprov samlas också in i hepariniserade rör efter djur avlivas. Plasma extraheras och lagras vid -70 ° C fram till analys.
  3. Media för plasma-extraktion:
    1. Blodprov för RNA-extraktion samlas med PAXgene Blood RNA-rör (PreAnalytix, Quagen)
    2. Blodprov för DNA-extraktion som samlas in med hjälp PAXgene rör Blood DNA (PreAnalytix, Quagen). Blodprover för proteinanalys samlas in med hjälp litiumheparin Capillary uppsamlingsrör (200 pl) från MaketLab # ML5601.
  4. Plasma CORT koncentration testas och analyseras med Active Rat Cort MKB (Diagnostic Systems Labs Inc. http://www.beckmancoulter.com/ ) enligt följande:
    1. Markera mikrotitreringsutspädare remsor som ska användas.
    2. Förbered Rat CORT Solution enzymkonjugat genom att späda Rat CORT Koncentrat enzymkonjugat i konjugatet diluent.
    3. Pipettera 25 pl standarder, kontroller och okända i brunnar.
    4. Tillsätt 100 ul lösning enzymkonjugat i varje brunn med en halvautomatisk dispenser. Knacka försiktigt på väl innehavaren 5-10 sek.
    5. Tillsätt 100 | il Rat CORT antiserum till varje brunn med användning av en halvautomatisk dispenser.
    6. Inkubera brunnarna vid rumstemperatur, 25 ° C, på en skakapparat vid 500-700 rpm under 60 minuter.
    7. Aspirera och tvätta varje well 5 gånger med tvättlösning med en automatisk mikroplatta bricka. Torka genom att vända plattan på absorberande material.
    8. Tillsätt 100 | il av TMB kromogenlösning till varje brunn med användning av en halvautomatisk dispenser.
    9. Inkubera vid rumstemperatur 15-20 min på en orbital mikroplatt skakapparat 500-700 rpm. Titta på färgförändringen.
    10. Tillsätt 100 | il stopplösning till varje brunn med användning av en halvautomatisk dispenser.
    11. Skaka plattan för hand 5-10 sek.
    12. Läs absorbans av lösningen i brunnen inom 30 minuter.
    13. Filtret är inställt vid 450 nm. * MKB kit kan också köpas på immunbiologiska Laboratories ( www.ibl-america.com ).

5. Representativa resultat

Figur 1
Figur 1. Råttor återhållsamma och utsätts för svans chock. Efterföljande kroppsviktÄr plasma kortikosteron koncentration och akustisk reaktion vid oväntade yttre mätt A:. Stress Exponering: Djur är fastspända med att immobiliseras i ett ventilerat plexiglas rör. Fyrtio elchocker (2 mA, 3 sek varaktighet ;) levereras till deras svansar på halvslumpvalda intervall från 150 till 210 sek B och C:. Stress fördröjer vinst i kroppsvikt under tillväxt: Kroppsvikt och mat och vatten förbrukning mäts omedelbart före stress (Dag -3), samma dag som de tre dagarna av stress och sedan varannan dag där efter upp till Dag 14. Bristen på viktökning under stress är aldrig kompenseras D:.. Stress ökar plasma kortikosteron koncentration E: Akustisk startle: Djur testas en dag innan stressen (dag-1) som en baslinje läsning och 12 dagar efter den sista dagen av de på varandra följande 3 dagarna av stress. Data för varje grupp - Stress och kontroll - uttrycks som procent av akustiskaskrämma dag 12 i förhållande till dag -1. Stress ökar markant den akustiska startle reflex. Klicka här för att se större bild .

Figur 2
Figur 2 Dissektion av amygdala, hippocampus, och hypotalamus från hjärnan skiva A:.. Råtthjärna, ventrala vy: Pilarna pekar på mitten cerebrala artärerna B:. Hjärnan blocket, ventrala vy, redo att transporteras till vibratome. C: Hjärnan blocket limmas på vibratome facket, kaudalt uppåt cortex mot bladet. Den kaudala hjärna har redan skurits bort exponerar den kaudala hippocampus. Blocket är nu redo för 2.500 um slice innehållande den större delen av hippocampus tas D:. Det 2.500 xm tjock skiva innehållande den kaudala hippocampus E:. Than isocortex (ISO) skalas från hippocampus (HC) och hippocampus skalades från mellanhjärnan F:.. Det 2.500 xm tjock skiva innehållande amygdala och den rostrala hippocampus G: isocortex har ut och amygdala (Amyg) resekerade . H:. Hypotalamus (HT) skärs och förskjuts Klicka här för att se större bild .

Figur 3
Figur 3. Expressionsnivåer för mRNA för glukokortikoidreceptorn (GR) och minerocorticoid receptorn (MR) i amygdala, hippocampus, hypotalamus, och frontala cortex före (C, kontroll) och efter (Str) svans-slagpåkänning. Enheter är andelen kontroll, barer är SEM A: Amygdala: Stress minskar minerocorticoid uttryck receptor mRNA B: Hippocampus: Stress increa.SES minerocorticoid receptor-mRNA-expression C:. Hypothalamus:. Stress ökar minerocorticoid uttryck receptor-mRNA D: frontala cortex: Stress minskar glukokortikoid uttryck receptor-mRNA samt minerocorticoid receptor mRNA-expression.

De (121bp) PCR-primers för råtta GR är: 1f.CCACTGCAGGAGTCTCACAA
1rAACACCTCGGGTTCAATCAC
Den (99 bp) PCR-primers för råtta MR är: 1f.GCCTTCAGCTATGCCACTTC
1rAACGTCGTGAGCACCTTTCT

Figur 4
Figur 4. Cluster och heatmap av RNA uttryckt differentiellt från 64 gener härledda från 5 hjärnvävnad från råtta, inklusive lillhjärnan (CL), cerebrum (CR), frontala cortex (FC), hypothalamus (HT), och hippocampus (HC). Färgkarta visar faldig förändringar i degna-(grön) och upp-(röd) uttryckta gener. (A) Kluster och heatmap av de normaliserade signalintensiteterna av 9 mätningar för varje 64 gener som härrör från 15 microarray experiment för dessa fem hjärnan vävnader. Expressionen av varje gen mättes genom tekniska triplikat och experimentella triplikat. (B) Kluster och heatmap av de genomsnittliga RNA-nivåer för dessa 9 mätningar av var och en av de 64 generna. Dessa resultat visar tydliga skillnader i mitokondrie-genuttryck och därmed relaterade funktioner, som stöder vår hypotes att olika delar av hjärnan har olika energibehov. Klicka här för att se större bild .

Vår tillämpning av rMNChip och bioinformatiska verktyg ledde till identifiering av ett kluster och heatmap av 64 gener med differentiellt uttryckta RNA härrör från 5 hjärnvävnad från råtta, inklusive lillhjärnan (CL), storhjärnan (CR), frontala cortex (FC), hypothaLamus (HT), och hippocampus (HC) (Figur 4). Dessa data visar de tydliga skillnaderna i mitokondrie genuttryck och därmed relaterade funktioner. Resultaten visar att de olika hjärnregioner kräver olika mängd energi för att utföra motsvarande hjärnfunktioner.

Discussion

Diagnosen av PTSD är baserad på själv rapporterade psykiatriska symptom (DSM IV) av potentiella ämnen. Ingen väldefinierade biomarkör är för närvarande tillgänglig för att komma åt patofysiologiska status potentiella PTSD patienter. PTSD är en sjukdom framkallad av livshotande traumatiska händelser och de viktigaste psykiatriska symtom kvar i den efterlevande liv i månader och tom år efter den första händelserna. De mest framträdande och ihållande symptom visade patienter med PTSD är hypervigilance, fördröjd överdrivet spritta svar 14, 15, 16 och en uppenbar kompromiss av HPA-axeln. Hos människor dessa symtom kvarstår eller visas med en fördröjning på tre månader, efter upphörande av traumatiska stressfaktorn 24. Vår nuvarande modell för biomarkörer studier av PTSD använder återhållsamhet och stötar svans upprepas för tre kontinuerliga dagar (2-hr sessioner 40, 2 mA tailshocks) - det ofrånkomliga svans-chock modell (ITS) i råttor som väger 150 gram. Detta ITS modell harvisats imitera i väsentlig utsträckning patofysiologin av PTSD 17, 7, 4, 10. Vårt labb och andra laboratorier har verifierat att dess modell av stress i råttor inducerar beteende och neurobiologiska förändringar som liknar dem som finns i PTSD ämnen 17, 7, 10, 9. Specifikt dessa stressade råttor uppvisar (1) en fördröjd och överdriven reaktion vid oväntade yttre visas flera dagar efter stressfaktor upphörande, vilket med tanke på den komprimerade tidsskala råttans livslängd jämfört med en människa, motsvarar den 1-3 månaders försening av symtom i PTSD patienter (DSM-IV-TR PTSD Criterian D / E 13), (2) ökad plasma kortikosteron (CORT) för flera (10) dagar, vilket tyder kompromiss av hypothalamopituitary axeln (HPA), och (3) efterbliven viktökning efter stressfaktor upphörande, motsvarande dysfunktion av metabolisk reglering av PTSD. Det finns inga belägg i litteraturen att räven lukt, rovdjur exponering, eller fruktar potentierade spritta svar, utställningarbitars dessa ihållande beteende och neuroendocrinologic fenotyper förknippade med PTSD.

Råttor som exponerats för en enda spänning session (1DS) har ställt övergående, men inte de ihållande avvikelser visas av 3DS råttor 17 Den nuvarande experiment jämförde skrämsel av 3DS och 1DS råttor 4, 7 och 10 dagar efter stressfaktor upphörande. I överensstämmelse med tidigare arbete, betonade råttor uppvisade förhöjda basala plasmanivåer CORT nivåer den första stressen dagen efter 17. Dessa CORT nivåerna var känsliga för antalet stressfaktorer exponeringar med högre CORT nivåer i 3DS råttor än 1Ds råttor. När det gäller skrämsel, 1Ds råttorna uppvisar en överdriven reaktion vid oväntade yttre 7 dagar efter stressfaktor, medan skrämma sensibilisering bara visar sig 10 dagar efter stressfaktor i 3DS råttor. Således verkar utseendet på en överdriven reaktion vid oväntade yttre efter stressfaktor upphörande vara relaterade till antalet exponeringar stressen session. Den 3DS stressade modellen verkarvara bra att få insikt i den förändrade uttrycket av biomarkörer associerade med symtom på PTSD och de viktigaste mätbara beteende fenotyper förknippade med tidpunkten efter upphörande av stress. Genomiska resultat som presenteras styrka princip för tillämpningen rMNChip och bioinformatik för att identifiera differentiella vägar och gen och protein biomarkörer, som i hög grad kommer att underlätta system-biologiska studier och förståelse av molekylära mekanismer bakom komplexa och multifaktoriella neurologiska sjukdomar, däribland PTSD.

Medan vår paradigm inte gräva i kognitiva och mer komplexa beteendemässiga aspekter av PTSD, noterar vi att förändrade sömnmönster i sin modell 1 motsvarar svårigheter att somna och sova och mardrömmar på PTSD patienter 11 (DSM-IV-TR PTSD Kriterier D 13), och brister i flykt / undvikande inlärning och inlärning av ett appetitive uppgift i sin modell 5 (DSM-IV-TR PTSD Kriterier C 13). Den nuvarande modellen korrelerar väl med de viktigaste symptomen som kännetecknar PTSD och ger en bra modell för att korrelera perifera biomarkörer för PTSD, som kan samlas från patienter med central, mekanistiska biomarkörer, som inte kan 6.

Disclosures

Inga intressekonflikter deklareras.

Acknowledgments

Detta arbete stöddes av CDMRP, USUHS Grants G188LE, G188MG och G188QC (till HL) och USUHS Centrum för studier av traumatisk stress.

References

  1. Adrien, J., Dugovic, C., Martin, P. Sleep-wakefulness patterns in the helpless rat. Physiol. Behav. 49, 257-262 (1991).
  2. Bai, X., Wu, J., Zhang, Q., Alesci, S., Manoli, I., Blackman, M. R., Chrousos, G. P., Goldstein, A. L., Rennert, O. M., Su, Y. A. Third-generation human mitochondria-focused cDNA microarray and its bioinformatic tools for analysis of gene expression. Biotechniques. 42, 365-375 (2007).
  3. Blaszczyk, J. W. Startle response to short acoustic stimuli in rats. Acta Neurobiol. Exp. (Wars.). 63, 25-30 (2003).
  4. Braga, M. F., roniadou-Anderjaska, V., Manion, S. T., Hough, C. J., Li, H. Stress impairs alpha(1A) adrenoceptor-mediated noradrenergic facilitation of GABAergic transmission in the basolateral amygdala. Neuropsychopharmacology. 29, 45-58 (2004).
  5. Bremner, J. D., Vythilingam, M., Vermetten, E., Anderson, G., Newcomer, J. W., Charney, D. S. Effects of glucocorticoids on declarative memory function in major depression. Biol. Psychiatry. 55, 811-815 (2004).
  6. Garrick, T., Morrow, N., Eth, S., Marciano, D., Shalev, A. Psychophysiologic parameters of traumatic stress disorder in rats. Ann. N.Y. Acad. Sci. 821, 533-537 (1997).
  7. Garrick, T., Morrow, N., Shalev, A. Y., Eth, S. Stress-induced enhancement of auditory startle: an animal model of posttraumatic stress disorder. Psychiatry. 64, 346-354 (2001).
  8. Hsiao, Y. H., Su, Y. A., Tsai, H. D., Mason, J. T., Chou, M. C., Man, Y. G. Increased invasiveness and aggressiveness in breast epithelia with cytoplasmic p63 expression. Int. J. Biol. Sci. 6, 428-442 (2010).
  9. Jiang, X., Xing, G., Yang, C., Verma, A., Zhang, L., Li, H. Stress Impairs 5-HT(2A) Receptor-Mediated Serotonergic Facilitation of GABA Release in Juvenile Rat Basolateral Amygdala. Neuropsychopharmacology. , (2008).
  10. Jiang, X., Zhang, Z. J., Zhang, S., Gamble, E. H., Jia, M., Ursano, R. J., Li, H. 5-HT2A receptor antagonism by MDL 11,939 during inescapable stress prevents subsequent exaggeration of acoustic startle response and reduced body weight in rats. J. Psychopharmacol. , (2009).
  11. Maher, H. K. Sleep deprivation: are you a victim. AAOHN. J. 54, 548 (2006).
  12. Maier, S. F. Exposure to the stressor environment prevents the temporal dissipation of behavioral depression/learned helplessness. Biol. Psychiatry. 49, 763-773 (2001).
  13. North, C. S., Suris, A. M., Davis, M., Smith, R. P. Toward validation of the diagnosis of posttraumatic stress disorder. Am. J. Psychiatry. 166, 34-41 (2009).
  14. Orr, S. P., Metzger, L. J., Pitman, R. K. Psychophysiology of post-traumatic stress disorder. Psychiatr. Clin. North Am. 25, 271-293 (2002).
  15. Orr, S. P., Roth, W. T. Psychophysiological assessment: clinical applications for PTSD. J. Affect. Disord. 61, 225-240 (2000).
  16. Pitman, R. K., Orr, S. P., Shalev, A. Y., Metzger, L. J., Mellman, T. A. Psychophysiological alterations in post-traumatic stress disorder. Semin. Clin. Neuropsychiatry. 4, 234-241 (1999).
  17. Servatius, R. J., Ottenweller, J. E., Natelson, B. H. Delayed startle sensitization distinguishes rats exposed to one or three stress sessions: Further evidence toward an animal model of PTSD. Biological Psychiatry. 38, 539-546 (1995).
  18. Su, Y. A., Zhang, Q., Su, D. M., Tang, M. X. Rat Mitochondrion-Neuron Focused Microarray (rMNChip) and Bioinformatics Tools for Rapid Identification of Differential Pathways in Brain Tissues. Int. J. Biol. Sci. 7, 308-322 (2011).
  19. Su, D. M., Zhang, Q., Wang, X., He, P., Zhu, Y. J., Zhao, J., Rennert, O. M., Su, Y. A. Two types of human malignant melanoma cell lines revealed by expression patterns of mitochondrial and survival-apoptosis genes: implications for malignant melanoma therapy. Mol. Cancer Ther. , (2009).
  20. Identification of stress-responsive genes, canonical pathways, molecular networks and drug targets in brain tissues of human and animals for systems-biology study of post-traumatic stress disorder. Su, Y. A., Li, H., He, P., Webster, M. J., Zhang, Q., Zhang, L., Wang, X., Su, D. M., Ursano, R. J., Rennert, O. M. The DOD Congressionally Directed Medical Research Programs, the third Military Health Research Forum (MHRF), August 31 - September 3, 2009, Hallmark Crown Center, Kansas City, Missouri, , (2009).
  21. Su, Y. A., Wu, J., Zhang, L., Zhang, Q., Su, D. M., He, P., Wang, B. D., Li, H., Webster, M. J., Rennert, O. M., Ursano, R. J. Dysregulated mitochondrial genes and networks with drug targets in postmortem brain of patients with posttraumatic stress disorder (PTSD) revealed by human mitochondria-focused cDNA microarrays. Int. J Biol. Sci. 4, 223-235 (2008).
  22. Su, Y. A., Yang, J., Tao, L., Nguyen, H., He, P. Undetectable and Decreased Expression of KIAA1949 (Phostensin) Encoded on Chromosome 6p21.33 in Human Breast Cancers Revealed by Transcriptome Analysis. J. Cancer. 1, 38-50 (2010).
  23. Yehuda, R., Yang, R. K., Buchsbaum, M. S., Golier, J. A. Alterations in cortisol negative feedback inhibition as examined using the ACTH response to cortisol administration in PTSD. Psychoneuroendocrinology. 31, 447-451 (2006).
  24. Zhang, Q., Wu, J., Nguyen, A., Wang, B. D., He, P., Laurent, G. S., Rennert, O. M., Su, A. Molecular mechanism underlying differential apoptosis between human melanoma cell lines UACC903 and UACC903(+6) revealed by mitochondria-focused cDNA microarrays. Apoptosis. 13, 993-1004 (2008).

Tags

Medicin genetik fysiologi neurovetenskap immunologi PTSD biomarkör stress rädsla spritta kortikosteron djurmodell RNA RT-PCR gen-chip cDNA microarray oligonukleotid microarray amygdala prefrontala cortex hippocampus cingulate cortex hypotalamus vita blodkroppar
Biomarkörer i en djurmodell för att avslöja Neurala, Hematologiska och Behavioral korrelat till PTSD
Play Video
PDF DOI

Cite this Article

Jia, M., Meng, F., Smerin, S. E.,… More

Jia, M., Meng, F., Smerin, S. E., Xing, G., Zhang, L., Su, D. M., Benedek, D., Ursano, R., Su, Y. A., Li, H. Biomarkers in an Animal Model for Revealing Neural, Hematologic, and Behavioral Correlates of PTSD. J. Vis. Exp. (68), e3361, doi:10.3791/3361 (2012).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter