Summary
Nous présentons une méthode pour visualiser les cuticules en direct
Abstract
La cuticule de C. elegans est une structure hautement résistante qui entoure l'extérieur de 1-4 animaux. La cuticule protège non seulement l'animal de l'environnement, mais détermine aussi la forme du corps et joue un rôle dans la motilité 4-6. Plusieurs couches sécrétées par les cellules épidermiques comprennent la cuticule, y compris une couche lipidique externe 7.
Crêtes circonférentielle dans la cuticule appelé pattern anneaux de la longueur de l'animal et sont présents pendant toutes les étapes du développement 8. Alae sont des crêtes longitudinales qui sont présents lors des étapes spécifiques du développement, y compris L1, Dauer, et les stades adultes 2,9. Des mutations dans les gènes qui affectent l'organisation du collagène cuticulaire peut modifier la structure et la morphologie cuticulaires corps animal 5,6,10,11. Alors que l'imagerie par microscopie cuticulaires composé avec l'optique DIC est possible, les méthodes actuelles qui mettent en évidence les structures cuticulaires comprennent fluorescentescent l'expression du transgène 12, 13 coloration des anticorps, et la microscopie électronique 1. Étiqueté de germe de blé agglutinine (WGA) a également été utilisé pour visualiser les glycoprotéines cuticulaires, mais il est limité dans la résolution plus fine des structures cuticulaires 14. Coloration de la surface de la cuticule en utilisant un colorant fluorescent a été observée, mais jamais caractérisés en détail 15. Nous présentons une méthode pour visualiser en direct la cuticule C. elegans utilisant le colorant rouge fluorescent lipophile DII (1,1 '-dioctadécyl-3, 3,3', 3'-tetramethylindocarbocyanine perchlorate), qui est couramment utilisé en C. elegans pour visualiser les neurones écologiquement exposés. Ce protocole optimisé pour la coloration de Dii est une méthode simple et robuste pour la visualisation haute résolution fluorescentes d'anneaux, du nez, vulve, queue du mâle, et la queue hermaphrodites pic en C. elegans.
Protocol
1. Préparation de DiI tache
- Préparer une solution stock de 20 mg / mL DII (Biotium, Inc, Hayward, CA) dans le DMF. Dii est sensible à la lumière, afin de protéger de la lumière DiI en enveloppant dans du papier.
- Créer une dilution de travail de DiI en ajoutant 0,6 uL DiI stocks d'399,4 uL M9 pour chaque population. Cela devrait donner une dilution finale de travail de 30 ug / ml dans le DiI M9. Cela peut être étendu pour la coloration des populations multiples simultanément. Bouclier DiI de la lumière en enveloppant le tube (s) au fleuret.
2. Préparation de nématodes
- Utilisez une plaque de 60 mm contenant une population de nématodes non contaminée. Lavez les animaux de la plaque en utilisant une solution de 0,5% de Triton X-100 dans le tampon M9 en remuant doucement de liquide dans un mouvement circulaire sur la surface de la plaque à desserrer tous les animaux larvaire et adulte. Transfert de lavage dans une stérile de 1,5 ml tube.
- Immédiatement spin-down des animaux à 2000 rpm pendant 30 sec. Retirez et jetez autant soutenirernatant que possible sans déranger la masse des animaux au fond du tube.
- Afin de réduire résiduelle de Triton X-100, rincez les animaux en utilisant M9 tampon, spin, et enlever le surnageant. Répétez cette étape une fois.
- Ajouter 400 ul de solution de travail dans DiI M9 dans le tube et brièvement au vortex pour remettre les animaux dans la solution.
- Agiter le tube à 20 ° C à l'horizontale pendant 3 heures à 350 rpm dans un environnement lumineux protégé. Si désiré, les animaux peuvent être mis à incuber jusqu'à 16 heures pour la coloration.
- Pour réduire la quantité de colorant non lié, ralentit les animaux à 2000 rpm pendant 20 sec. Retirez et jetez autant que possible le surnageant sans déranger la masse des animaux.
- Remettre en suspension dans 400 animaux M9 pi de tampon et de verser le liquide sur une partie libre de bactéries d'une plaque de gélose ensemencés avec NGM OP50 E. coli. Permettre aux animaux de récupérer au moins 30 minutes. Pendant le temps de récupération, les animaux doivent ramper dans le liquide coloration DII et sur les aliments. Cette étaperéduit la fluorescence de fond auprès de DII libre.
3. Montage et l'observation des spécimens
- Faire fondre la gélose de 4% dans de l'eau en utilisant un autoclave ou un four micro-ondes.
- Créer entretoises réutilisable, qui peut être utilisé pour assurer une épaisseur uniforme de la plaquette de gélose, par superposition de deux morceaux de ruban de laboratoire sur une lame de verre. Faites deux diapositives entretoise total.
- Convenir d'une lame de verre propre entre deux lames d'espacement. Pipeter environ 150 uL (quatre gouttes) de 4% agar fondu sur le centre de la lame de verre propre. Couvrir rapidement l'agar fondu en utilisant une lame supplémentaire pour former un coussin d'agar. Retirez délicatement la lamelle, en gardant le pad centrée sur le haut de la montage des diapositives.
- Pipeter environ 5 pi de nématodes anesthésie (100 uM - 1 lévamisole mM, par exemple) sur le pavé.
- Mont de 8 à 12 animaux dans l'anesthésie et couvrir avec une lamelle de microscope.
- Observez les animaux en utilisant un microscope confocal composé ou équipés d'au moins une l'objectivation 40x ve et une DsRed / TRITC (ou autre compatible) filtre. Le maximum d'excitation de fluorescence de Dii est 549 nm et son émission maximum est de 565 nm pour le colorant lié (Biotium, Inc, Hayward, CA).
4. Les résultats représentatifs
Taches DiI la cuticule de type sauvage et mutant C. elegans. La surface cuticulaire contient anneaux séparés par des sillons circonférentielle et, dans certains stades, des crêtes longitudinales appelées ailes. Chaque phase de développement a des structures cuticulaires avec des compositions distinctes 2. Crêtes ou sillons des deux ailes du nez et anneaux fluorescence tache, selon la composition de surface, à travers les stades larvaire et adulte et reste visible jusqu'à une journée après la récupération en utilisant cette méthode. Taches de fond fluorescents sont parfois observées (figures 2F, G), mais pas systématiquement (Figure 1, Figure 2A-E, H, I). Toutes les images ont été prises avec disque rotatif confocale ou, lorsqu'il est apposé, à la microscopie à champ large composé (WF).
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Figure 1. DiI taches cuticules et les neurones écologiquement exposés. Bête de scène L2. Un grossissement de 630x. Parties d'image mosaïque ont été capturées à l'aide iVision-logiciels Mac (Technologies de BioVision, Exton, PA). Les images ont été jointes à l'aide d'Adobe Photoshop CS3 (Adobe Systems, Inc, San Jose, CA). Barre d'échelle = 10 um. DiI aussi par fluorescence des taches et des amphid phasmide neurones sensoriels de la tête et la queue, respectivement (flèches indiquent certains).
Figure 2. DiI fluorescence des taches C. cuticules elegans à toutes les étapes du développement post-embryonnaire. Un grossissement de 630x. Barre d'échelle = 10 um. Coloration des animaux de type sauvage dans une L1); B) L2; C) Dauer; D) L3, E) L4 et F) stades adultes. Les arêtes du nez et annulaire sont tachés par fluorescence chez les animaux L1 et Dauer (A, C). DiI taches nervures annulaires chez les animaux L2(B). Annulaire sillons tache dans L3 et L4 animaux (D, E). Les sillons des ailes et des anneaux sont colorées chez les animaux adultes (FH). Alae sont composées de deux, cinq ou trois crêtes (en L1, Dauer, ou les animaux adultes, respectivement) qui courent le long de l'animal (flèches) 16. Annuli créer des arêtes circonférentielles autour de l'animal (pointes de flèches, F et J). La cuticule de l'adulte des animaux mutants affichage modérée défauts organisation cuticulaires (GH). G) Ridges des ailes sont discontinus (WF). H) arêtes du nez surnuméraires sont fondus et ramifiés ou bifurquée (WF). Mutants du gène du collagène présentent ailes et les défauts de l'organisation annulaire (IJ). I) Chez les animaux transgéniques surexprimant pRF4 (rol-6 (su1006)), les crêtes du mensonge ailes à un angle à la longueur de l'animal. J) anneaux au transgéniques surexprimant pRF4 animaux (rol-6 (su1006)) affiche un motif irrégulier.
Figure 3. Externestructures morphologiques al sont illuminés par coloration DII. grossissement de 630x. Barres d'échelle = 10 um. DiI souligne également d'autres caractéristiques extérieures, y compris A) pour adultes hermaphrodites vulve, B) les rayons pour adultes queue du mâle et de ventilateur, et C) hermaphrodites queue pointe (fourchue dans ce contexte mutant).
Cuticule Figure 4. Prend plus de tache avec DiI que les neurones écologiquement exposés. Un grossissement de 630x. Barre d'échelle = 10 um. Après deux heures de coloration, amphid (non représenté) et phasmide neurones sensoriels (flèches) sont suffisamment colorés. En revanche, la cuticule des animaux plus jeunes n'est que partiellement teinté en plaques (tête de flèche).
| Laver | Solution de coloration (+ DII) | Le temps d'incubation | Tachés cuticules |
| M9 + 0,5% TrIton X-100 | M9 + 0,5% de Triton X-100 | 2 heures | pas |
| M9 + 0,5% de Triton X-100 | M9 + 0,5% de Triton X-100 | 3 heures | pas |
| M9 + 0,5% de Triton X-100 | M9 | 2 heures | partielle |
| M9 + 0,5% de Triton X-100 | M9 | 3 heures | oui |
| M9 + 0,5% de Triton X-100 | H 2 0 | 2 heures | partielle |
| M9 + 0,5% de Triton X-100 | H 2 0 | 3 heures | oui |
Tableau 1. Coloration cuticulaire dans des conditions différentes. Différentes solutions d'incubation et les délais ont été testés afin d'optimiser coloration cuticulaires chez les animaux. H 2 0, l'eau distillée stérile. Coloration partielle indique coloration inégale de la cuticule larvaire (figure 4), bien que les taches de la cuticule adulte consistently.
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Discussion
La méthode de coloration DiI présenté ici permet d'une façon relativement rapide et pratique pour visualiser la cuticule chez C. elegans. En réorientation et l'optimisation d'une méthode couramment utilisée pour l'image écologiquement exposés neurones sensoriels 15,17, Dii peut être utilisé pour fluorescence tache deux ailes du nez et des structures annulaires (figures 1 et 2), ainsi que la vulve, queue du mâle, et la queue hermaphrodites pic (Figure 3). Nous avons trouvé que la solution d'incubation et de l'influence du temps de la capacité des DiI de toujours tache de la cuticule (tableau 1, figure 4). La méthode de coloration DiI neurones écologiquement exposés utilise un temps d'incubation de deux heures dans M9 avec Triton X-100 15. Un lavage initial de M9 avec le surfactant Triton X-100 permet d'éliminer la contamination de la surface de la cuticule et empêche les animaux de l'agglutination. Cependant, l'incubation des trois animaux heures dans une solution de coloration dans le même tampon empêche le colorant de coloration de la cuticule (tableau 1).Cela peut être causé par les lipides à la surface des nématodes étant dépouillé par le traitement plus long dans la solution détergente. L'incubation des animaux dans l'eau avec des taches DiI la cuticule, ce qui indique que la solution du sel M9 n'est pas nécessaire pour la coloration des DiI cuticule. Bien que le protocole à base d'eau est recommandée pour DiI coloration neuronales 15, nous constatons que les animaux traités de cette manière apparaissent souvent malsain. Lavage des animaux brièvement dans 0,5% de Triton X-100 dans M9, suivie d'une incubation de trois heures dans la solution de coloration fait avec M9, fournit coloration uniforme des structures cuticulaires et entretient le bien-être des animaux.
Les animaux peuvent être secourus après l'observation et maintenu, permettant des analyses directes en aval. Cette méthode est un outil pratique qui peut être utilisé dans de nombreuses études, y compris, mais non limité à, la sécrétion de la cuticule et de l'organisation, le développement des cellules épidermiques, les voies du gène heterochronic, et l'évolution des nématodes.
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Disclosures
Nous n'avons rien à révéler.
Acknowledgments
Nous tenons à remercier S. Taneja-Bageshwar, K. Beifuss, S. Kedroske, et HC. Hsiao pour les discussions utiles. Ce travail a été financé par des fonds de démarrage du ministère TAMHSC de médecine moléculaire et cellulaire. Le champ composé et disque rotatif ont été achetés avec des fonds fournis par le ministère et le Bureau du doyen TAMHSC. Certaines souches ont été fournis par le Centre de Génétique Caenorhabditis, qui est financé par le National Center for Research Resources. pRF4 (rol-6 (su1006)) a été un don de feu A..
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DiI (1,1’-Dioctadecyl-3,3,3’,3’-tetramethylindocarbocyanine perchlorate) | Biotium, Inc. | 60010 | Stock dilution: 20 mg/mL in DMF working dilution: 30 mg/mL |
| DMF (Dimethylformamide) | Sigma-Aldrich | D4551 | |
| Triton X-100 (Octylphenoxypolyethoxyethanol) | VWR international | EM-9410 | |
| M9 (22mM KH2PO4, 42mM Na2HPO4, 86mM NaCl, 1mM MgSO4) | |||
| NGM (Nematode growth medium) | IPM Scientific, Inc. | 11006-501 | Can be prepared following NGM agar protocol18 |
| Agar-agar | EMD Millipore | 1.01614 | 4% in water |
| Levamisole (Levamisole hydrochloride) | Sigma-Aldrich | 31742 | 100 μM - 1 mM levamisole as required |
| Microscope slides | VWR international | 16005-106 | |
| Microscope cover glasses | VWR international | 16004-302 | |
| Compound scope | Carl Zeiss, Inc. | A1m | Use objectives to match the needs of the experiment |
| TRITC or other compatible filter | Chroma Technology Corp. | 49005 | ET - DSRed (TRITC/Cy3) sputtered filter set |
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