Summary
Vi presentiamo un metodo per visualizzare in vivo cuticola
Abstract
La cuticola di C. elegans è una struttura molto resistente che circonda l'esterno dell'animale 1-4. La cuticola non solo protegge l'animale dall'ambiente, ma determina anche la forma del corpo e svolge un ruolo nella motilità 4-6. Diversi strati secreto dalle cellule epidermiche comprendono la cuticola, tra cui una strato lipidico esterno 7.
Creste circonferenziale nella cuticola chiamato modello annuli la lunghezza dell'animale e sono presenti in tutte le fasi di sviluppo 8. Ali sono creste longitudinali che sono presenti durante le fasi specifiche di sviluppo, tra cui L1, dauer, e le fasi adulti 2,9. Le mutazioni nei geni che influenzano l'organizzazione cuticolare collagene possono alterare la struttura cuticolare e morfologia del corpo animale 5,6,10,11. Mentre l'imaging cuticolare usando la microscopia composto con ottica DIC è possibile, gli attuali metodi che mettono in risalto le strutture cuticolare comprendono fluorescenticento transgene espressione 12, colorazione anticorpale 13, e la microscopia elettronica 1. Etichettati germe di grano agglutinina (WGA) è stato utilizzato anche per visualizzare glicoproteine cuticolare, ma è limitato nella risoluzione dei più fini strutture cuticolare 14. La colorazione della superficie cuticolare con colorante fluorescente è stato osservato, ma mai caratterizzato in dettaglio 15. Vi presentiamo un metodo per visualizzare in vivo cuticola C. elegans con il colorante rosso fluorescente lipofile DII (1,1 '-dioctadecyl-3, 3,3', 3'-tetramethylindocarbocyanine perclorato), che è comunemente usato in C. elegans per visualizzare l'ambiente neuroni esposti. Questo protocollo ottimizzato per la colorazione DII è un metodo semplice e robusto per la visualizzazione ad alta risoluzione fluorescenti di annuli, alae, vulva, coda di sesso maschile e ermafrodita coda picco di C. elegans.
Protocol
1. Preparazione del Dii macchia
- Preparare una soluzione madre di 20 mg / mL DII (Biotium, Inc., Hayward, CA) in DMF. DII è sensibile alla luce, in modo da proteggere i Dii dalla luce, avvolgendo in un foglio.
- Creare una diluizione di lavoro di Dii con l'aggiunta di 0,6 microlitri magazzino DII a 399,4 microlitri M9 per ogni popolazione. Questo dovrebbe dare una diluizione finale di lavoro di 30 mcg / ml Dii a M9. Questo può essere scalata per la colorazione popolazioni contemporaneamente. Dii scudo dalla luce, avvolgendo il tubo (s) in un foglio.
2. Preparazione dei nematodi
- Utilizzare una piastra di 60 millimetri che contiene una popolazione di nematodi incontaminata. Lavare gli animali da lastra con una soluzione di 0,5% Triton X-100 nel buffer M9 rimestando delicatamente liquido in un movimento circolare sulla superficie della piastra per sciogliere tutti gli animali larvali e adulti. Trasferimento lavaggio in un tubo sterile 1,5 ml.
- Immediatamente spin down gli animali a 2000 rpm per 30 sec. Rimuovere e gettare il più supernatant possibile senza disturbare la massa di animali sul fondo della provetta.
- Per ridurre il residuo Triton X-100, lavare gli animali utilizzando M9 tampone, rotazione, e rimuovere il surnatante. Ripetere questa operazione una sola volta.
- Aggiungere 400 ml di soluzione di lavoro DII in M9 al tubo e mescolare brevemente nel vortex per sospendere di nuovo gli animali nella soluzione.
- Agitare tubo a 20 ° C in orizzontale per 3 ore a 350 giri al minuto in una luce-ambiente protetto. Se lo si desidera, gli animali possono essere incubate fino a 16 ore per la colorazione.
- Per ridurre la quantità di colorante, spin down gli animali a 2000 rpm per 20 sec. Rimuovere ed eliminare il più possibile surnatante senza disturbare la massa degli animali.
- Animali risospendere in 400 microlitri di buffer M9 e versare il liquido su una porzione priva di batteri di una piastra di agar NGM seminato con OP50 E. coli. Consentire agli animali di recuperare almeno 30 minuti. Durante il tempo di recupero gli animali devono strisciare via dal liquido colorazione DII e sul cibo. Questo passoriduce la fluorescenza di fondo da DII libero.
3. Montaggio e osservando i campioni
- Sciogliete il 4% agar-agar in acqua con autoclave o un forno a microonde.
- Crea distanziali riutilizzabili, che può essere utilizzato per garantire spessore uniforme del pad agar, con stratificazione due pezzi di nastro di laboratorio su un vetrino. Fai due diapositive distanziatore totale.
- Organizzare un vetrino pulito di vetro tra due diapositive distanziatore. Pipettare circa 150 microlitri (quattro gocce) di agar fuso 4% sul centro del vetrino pulito. Rapidamente coprire l'agar fuso con un ulteriore scivolo di formare un pad agar. Rimuovere con cautela il vetrino di copertura, mantenendo il pad centrato sulla parte superiore della slitta di montaggio.
- Pipettare circa 5 ml di anestetico nematode (100 mM - 1 levamisolo mM, per esempio) sul pad.
- Monte 8-12 animali in anestesia e coprire con un coprioggetto microscopio.
- Osservare gli animali usando un microscopio confocale o dotati di almeno un obietti 40x ve e un DsRed / TRITC (o compatibili) del filtro. La massima eccitazione di fluorescenza di DII è 549 nm e il suo massimo di emissione è 565 nm per il colorante legato (Biotium, Inc., Hayward, CA).
4. Rappresentante Risultati
Macchie Dii la cuticola del wild-type e mutanti C. elegans. La superficie cuticolare contiene annuli separate da solchi circonferenziali e, in alcuni stadi, creste longitudinali chiamati ali. Ogni fase di sviluppo ha strutture cuticolare con composizioni diverse 2. Creste o solchi dei due alae e annuli macchia fluorescente, a seconda della composizione della superficie, in tutta stadi larvali e adulte e rimangono visibili fino ad un giorno dopo il recupero con questo metodo. Macchioline di fondo fluorescente sono a volte osservati (figure 2F, G), ma non di routine (Figura 1, Figura 2A-E, H, I). Tutte le immagini sono state scattate con disco rotante o confocale, quando nota, widefield (wf) microscopio composto.
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Figura 1. DII macchie cuticola e neuroni ambientalmente esposti. L2 stadio animale. Ingrandimento 630x. Parti dell'immagine mosaico sono stati catturati utilizzando ANNULLAMENTO-Mac software (Tecnologie BioVision, Exton, PA). Le immagini sono state unite con Adobe Photoshop CS3 (Adobe Systems, Inc., San Jose, CA). Barra di scala = 10 micron. DII anche fluorescente macchie amphid e fasmide neuroni sensoriali della testa e la coda rispettivamente (frecce indicano alcuni).
Figura 2. Dii macchie fluorescenti C. cuticola elegans in tutte le fasi della post-embrionale di sviluppo. Ingrandimento 630x. Barra di scala = 10 micron. La colorazione di tipo selvaggio animali in A) L1; B) L2; C) dauer; D) L3; E) L4, e F) Ciclo di adulto. Le dorsali ali e anulare sono macchiati fluorescente negli animali L1 e dauer (A, C). Dii macchie dorsali anulare negli animali L2(B). Anulare solchi macchia di L3 e L4 animali (D, E). I solchi delle ali e annuli sono macchiati negli animali adulti (FH). Ali sono composti da due, cinque, o tre creste (in L1, dauer o animali adulti, rispettivamente) che corrono la lunghezza dell'animale (frecce) 16. Annuli creare creste circonferenziale intorno all'animale (punte di freccia, F e J). La cuticola di adulti animali mutanti visualizzare moderati difetti organizzazione cuticolare (GH). G) Creste di alae sono discontinui (wf). H) creste ali soprannumerari sono fusi e ramificati o biforcato (wf). Mutanti del gene del collagene presentano ali e difetti dell'organizzazione anulare (J). I) In animali transgenici sovraesprimono pRF4 (rol-6 (su1006)), creste di alae giacciono in un angolo della lunghezza dell'animale. J) Annuli in animali transgenici iperespressione pRF4 (rol-6 (su1006)) mostra un pattern irregolare.
Figura 3. ExternAl strutture morfologiche sono illuminati dalla colorazione DII. ingrandimento 630x. Barre di scala = 10 micron. Dii evidenzia anche altre caratteristiche esterne, tra cui A) adulti ermafroditi vulva, B) raggi coda maschio adulto e la ventola, e C) ermafrodita punta della coda (biforcuta in questo contesto mutante).
Cuticola Figura 4. Richiede più tempo per macchiare con DII di neuroni ambientalmente esposti. Ingrandimento 630x. Barra di scala = 10 micron. Dopo due ore di colorazione, amphid (non mostrato) e fasmide neuroni sensoriali (frecce) sono abbastanza colorati. Al contrario, la cuticola dei giovani animali è solo parzialmente macchiato in patch (punta di freccia).
| Lavare | Soluzione di macchia (+ DII) | Tempo di incubazione | Cuticola macchiato |
| M9 + 0,5% TrIton X-100 | M9 + 0,5% Triton X-100 | 2 ore | no |
| M9 + 0,5% Triton X-100 | M9 + 0,5% Triton X-100 | 3 ore | no |
| M9 + 0,5% Triton X-100 | M9 | 2 ore | parziale |
| M9 + 0,5% Triton X-100 | M9 | 3 ore | sì |
| M9 + 0,5% Triton X-100 | H 2 0 | 2 ore | parziale |
| M9 + 0,5% Triton X-100 | H 2 0 | 3 ore | sì |
Tabella 1. Colorazione cuticolare in condizioni diverse. Soluzioni diverse e tempi di incubazione sono stati testati per ottimizzare la colorazione cuticolare negli animali. H 2 0, acqua distillata sterile. Colorazione parziale indica colorazione irregolare della cuticola larvale (Figura 4), anche se le macchie cuticola adulti consistently.
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Discussion
Il metodo di colorazione DII qui presentata permette un modo relativamente veloce e conveniente per visualizzare la cuticola in C. elegans. Da riproporre e ottimizzare un metodo comunemente usato per l'immagine dell'ambiente neuroni sensoriali esposti 15,17, DII può essere usato per macchiare fluorescente sia ali e le strutture anulare (Figure 1 e 2), così come la vulva, la coda di sesso maschile e ermafrodita coda picco (Figura 3). Abbiamo trovato che la soluzione di incubazione e l'influenza di tempo la capacità di DII per colorare sempre la cuticola (Tabella 1, Figura 4). Il metodo per DII neuroni colorazione dell'ambiente esposto utilizza due ore di tempo di incubazione in M9 con Triton X-100 15. Un lavaggio iniziale di M9 con il tensioattivo Triton X-100 contribuisce a eliminare la contaminazione dalla superficie cuticolare e impedire agli animali di aggregazione. Tuttavia, incubando le tre ore gli animali in una soluzione colorante nel buffer stesso impedisce il colorante dalla colorazione della cuticola (Tabella 1).Questo può essere causato da lipidi in superficie nematode essere tolto dal trattamento più lungo nella soluzione detergente. L'incubazione di animali in acqua con macchie Dii la cuticola, indicando che la soluzione salina M9 non è richiesto per la colorazione DII di cuticola. Anche se un protocollo a base di acqua è consigliato per neuronale colorazione DII 15, troviamo che gli animali trattati in questo modo appaiono spesso malsana. Lavaggio animali brevemente nello 0,5% Triton X-100 a M9, seguito da tre ore di incubazione nella soluzione colorante a base di M9, fornisce colorazione coerente di strutture cuticolare e mantiene il benessere degli animali.
Gli animali possono essere salvati dopo l'osservazione e la manutenzione, permettendo analisi diretta a valle. Questo metodo è un comodo strumento che può essere utilizzato in molti studi, tra cui, ma non limitato a, la secrezione cuticolare e organizzazione, lo sviluppo delle cellule epidermiche, percorsi gene eterocronici, e l'evoluzione dei nematodi.
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Disclosures
Non abbiamo nulla da rivelare.
Acknowledgments
Ringraziamo S. Taneja-Bageshwar, K. Beifuss, S. Kedroske, e HC. Hsiao per le discussioni utili. Questo lavoro è stato finanziato da fondi di start-up del Dipartimento TAMHSC di Medicina Molecolare e Cellulare. L'ambito complesso e disco rotante sono stati acquistati con i fondi messi a disposizione dal Dipartimento e l'Ufficio TAMHSC del Decano. Alcuni ceppi sono stati forniti dalla genetica Caenorhabditis Center, che è finanziato dal National Center for Research Resources. pRF4 (rol-6 (su1006)) era un dono del Fuoco A..
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DiI (1,1’-Dioctadecyl-3,3,3’,3’-tetramethylindocarbocyanine perchlorate) | Biotium, Inc. | 60010 | Stock dilution: 20 mg/mL in DMF working dilution: 30 mg/mL |
| DMF (Dimethylformamide) | Sigma-Aldrich | D4551 | |
| Triton X-100 (Octylphenoxypolyethoxyethanol) | VWR international | EM-9410 | |
| M9 (22mM KH2PO4, 42mM Na2HPO4, 86mM NaCl, 1mM MgSO4) | |||
| NGM (Nematode growth medium) | IPM Scientific, Inc. | 11006-501 | Can be prepared following NGM agar protocol18 |
| Agar-agar | EMD Millipore | 1.01614 | 4% in water |
| Levamisole (Levamisole hydrochloride) | Sigma-Aldrich | 31742 | 100 μM - 1 mM levamisole as required |
| Microscope slides | VWR international | 16005-106 | |
| Microscope cover glasses | VWR international | 16004-302 | |
| Compound scope | Carl Zeiss, Inc. | A1m | Use objectives to match the needs of the experiment |
| TRITC or other compatible filter | Chroma Technology Corp. | 49005 | ET - DSRed (TRITC/Cy3) sputtered filter set |
References
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