Summary
我々は、ライブでキューティクルを可視化する手法を提案
Abstract
C.のクチクラelegansは動物1-4の外側を取り囲む非常に強い構造です。キューティクルだけではなく環境から動物を保護するだけでなく、ボディの形状を決定し、運動性4-6に役割を果たしている。表皮細胞から分泌されるいくつかの層は最も外側の脂質層7を含む、キューティクルを構成しています。
キューティクルの円周尾根はannulusの複数形のパターン動物の長さと呼ばれ、開発8のすべての段階で存在している。 AlaeはL1、dauer、そして大人のステージ2,9を含む開発の特定の段階で、中に存在する縦方向の尾根です。クチクラコラーゲンの組織に影響を及ぼす遺伝子の変異は、クチクラ構造と動物の体の形態5,6,10,11を変更することができます。 DIC光学系と化合物の顕微鏡を使用してクチクラのイメージングが可能ですが、クチクラ構造を強調する現在の方法は、蛍光を含むセントジーン発現12、抗体染色13、および電子顕微鏡1。ラベルの付いた小麦胚芽レクチン（WGA）もクチクラ糖タンパク質を可視化するために使用されていますが、細かいクチクラ構造14を解決するために制限されています。蛍光色素を使用してクチクラ表面の染色が観察されたが、詳細に15に特徴がないされています。我々は、ライブCでキューティクルを可視化する手法を提案一般的にC言語で使用されている赤色蛍光親油性色素DII（1,1' -ジオクタデシル- 3、3,3'、3' - tetramethylindocarbocyanine過塩素酸塩）を、使用して虫elegansの環境にさらされるニューロンを可視化する。 DIIの染色のためのこの最適化されたプロトコルは、annulusの複数形、alae、外陰部、男性の尾、およびCの雌雄同体尾のスパイクの高分解能蛍光可視化するための、シンプルで堅牢な方法です。 エレガンス 。
Protocol
1。 DIIの調製染色
- DMF中20 mg / mLのDII（Biotium、（株）、ヘイワード、カリフォルニア州）のストック溶液を調製。 DIIは、敏感な光なので、ホイルで包むことによって光からDIIを保護する。
- 各集団に対して399.4μLM9は0.6μLDIIの株式を追加することにより、DIIの希釈率を作成します。これは、30μgの/ M9のmLのDIIの最終的な希釈率を与える必要があります。これは、同時に複数の集団を染色するためにスケールアップすることができます。ホイルにチューブ（s）をラップすることによって、光からシールドDII。
2。線虫の調製
- 汚染されていない線虫の人口を含む60 mmのプレートを使用してください。静かにすべての幼生と成体の動物を緩めるために板の表面全体に円を描くように液体を渦巻くことでM9バッファーに0.5％トリトンの解X - 100を用いてプレートから動物を洗う。滅菌済み1.5 mLチューブに洗って移す。
- すぐに30秒間2000rpmで動物をスピンダウン。できるだけ多く渉取り外して廃棄チューブの底に動物の質量を邪魔することなく可能な限りernatant。
- 残留トリトンX - 100を削減するために、M9バッファー、スピンを使って動物をすすぎ、そして上清を除去します。一度この手順を繰り返します。
- 溶液中で動物を懸濁するためにチューブとボルテックスで短時間にM9の作業DIIの溶液400μLを加える。
- 20℃水平に光で保護された環境で350 rpmで3時間チューブを振る。必要に応じて、動物は染色のために16時間までインキュベートすることができる。
- バインドされていない染料の量を減らすために、20秒間2000rpmで動物をスピンダウン。削除して、動物の質量を乱すことなく、上清をできるだけ捨てる。
- 400μLM9バッファーで再懸濁し、動物とOP50 E.を接種したNGM寒天プレートの無菌の部分に水などの液体を注ぐ大腸菌 。動物は少なくとも30分を回復することができます。回復時間の間、動物は、DIIの染色液から、食品へはい出るてください。このステップフリーDIIからバックグラウンド蛍光が減少します。
3。マウントと観察標本
- オートクレーブやマイクロ波を用いた水の4％の寒天を溶かす。
- スライドガラス上にラボのテープのレイヤーの2つの部分で、寒天のパッドの均一な厚さを確保するために使用できる再利用可能なスペーサーを、作成します。 twoスペーサースライドは合計してください。
- twoスペーサースライド間のきれいなガラスのスライドを手配する。きれいなスライドガラスの中央上に溶融4％寒天のピペット約150μL（4滴）。すぐに寒天のパッドを形成するために追加のスライドを使用して溶融寒天をカバーしています。慎重に取り付けスライドの上部を中心にパッドを保ち、カバースライドを削除します。
- パッドの上に - 線虫麻酔薬（1mMのレバミゾール、例えば100μM）の5μL約ピペット。
- マウント8 - 麻酔薬および顕微鏡のカバーガラスとカバーで12匹。
- 少なくとも40倍objectiを装備した化合物または共焦点顕微鏡を用いて動物を観察 VEとTRITC / DsRedの（または他の互換性のある）フィルタ。 DIIの蛍光励起極大が549 nmであり、その排出量の最大値は、バインドされた色素（Biotium、（株）、ヘイワード、カリフォルニア州）のための565 nmである。
4。代表的な結果
野生型と変異体CのDIIの汚れは、クチクラエレガンス 。クチクラ表面はannulusの複数形、いくつかの段階では、円周畝で区切られて含まれ、長手方向の尾根はalaeと呼ばれる。それぞれの発達段階は、異なる組成2のクチクラ構造を持っています。 alaeとannulusの複数形の両方の尾根や畝は蛍光幼虫と大人の段階を通じて、表面組成に応じて、染色とまでこの方法を使用して回復の翌日から見えます。バックグラウンド蛍光斑点が、時には（図1、図2A - E、H、I）（図2F、G）観察ではなく、日常的にされています。すべての画像は、記載され、回転するディスク共焦点または、、広視野（WF）化合物の顕微鏡で撮影されました。
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図1。 DIIは、汚れキューティクルと環境にさらされるニューロンを 。 L2段の動物。 630x倍率。モザイク画像の部品は、iVision - Macのソフトウェア（バイオビジョンテクノロジーズ、エクストン、ペンシルバニア州）を用いて捕獲された。画像は、Adobe Photoshop CS3（アドビシステムズ社、サンノゼ、CA）を使用して結合した。スケールバー=10μmである。 DIIはまた、蛍光染色をそれぞれ頭と尾のamphidとナナフシ類の感覚ニューロン（矢印があるマークを付ける）。
図2。 DII蛍光染色C.後胚発生のすべての段階で虫がキューティクル 。 630x倍率。スケールバー=10μmである。 B）L2; C）dauer; D）L3; E）L4;）L1における野生型動物の染色およびF）大人のステージが。 alaeと環状の尾根は、蛍光（A、C）L1とdauer動物で染色される。 L2の動物のDIIの汚れ環状隆起部（B）。環状は、L3とL4の動物（D、E）で染色畝。 alaeの畝とannulusの複数形は、成熟した動物（FH）で染色されています。 Alaeは、動物の長さを実行する2つ、五、三尾根（L1、dauer、または成体動物で、それぞれ）（矢）16で構成されています。 annulusの複数形は、動物の周りの周方向の隆起（矢頭、FとJ）を作成します。成人変異動物のキューティクルは、中程度のクチクラ組織の欠陥（GH）を表示。 G）alaeの尾根は、（WF）不連続です。 H）リナalaeの尾根が融合され、分岐または（WF）二股されています。コラーゲン遺伝子の変異体はalaeと環状の組織の欠陥（IJ）を示す。 I）トランスジェニック動物において過剰発現しpRF4（ROL - 6（su1006））、動物の長さに斜めにalaeの嘘の尾根。トランスジェニック動物を過剰発現pRF4（ROL - 6（su1006））におけるJ）annulusの複数形が不規則なパターンが表示されます。
図3。 externをらの形態学的構造は、DIIの染色により照明されています。630x倍率は。スケールバーは=10μmである。 DIIも）成人雌雄同体外陰部、B）成人男性の尾線とファン、およびC）両性テールスパイク（この変異体バックグラウンドでforkされた）を含む他の外部の機能を、強調表示されます。
図4。キューティクルは、環境にさらされるニューロンよりも、DIIで染色するのに時間がかかります。 630x倍率。スケールバー=10μmである。染色の2時間後、amphid（図示せず）とナナフシ類の感覚ニューロン（矢印）十分に染色されています。対照的に、若い動物のキューティクルは、部分的にのみパッチ（矢頭）で染色される。
| 洗う | 染色液（+ DII） | インキュベーション時間 | キューティクルのステンドグラス |
| M9 + 0.5％Trのiton X - 100 | M9 + 0.5％トリトンX - 100 | 2時間 | ない |
| M9 + 0.5％トリトンX - 100 | M9 + 0.5％トリトンX - 100 | 3時間 | ない |
| M9 + 0.5％トリトンX - 100 | M9 | 2時間 | 部分 |
| M9 + 0.5％トリトンX - 100 | M9 | 3時間 | はい |
| M9 + 0.5％トリトンX - 100 | H 2 0 | 2時間 | 部分 |
| M9 + 0.5％トリトンX - 100 | H 2 0 | 3時間 | はい |
表1。異なる条件下でのクチクラ染色。様々なインキュベーションのソリューションおよび時刻は、動物でクチクラ染色を最適化するためにテストされました。 H 2 0、滅菌蒸留水。大人キューティクル汚れCも部分的な染色では、幼虫のクチクラの斑状の染色（図4）を示していますonsistently。
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Discussion
ここで紹介するDIIの染色法は、C. elegansのキューティクルを視覚化するため、比較的迅速かつ便利な方法が可能になります。一般的に画像環境にさらされる感覚ニューロン15,17に使用される方法を再利用して最適化することにより、DIIは、蛍光alaeと環状構造（図1および図2）だけでなく、外陰部、男性の尾、および両性テールスパイクの両方を染色するために使用することができます（図3）。我々は、インキュベーション溶液と時間が常にキューティクル（表1、図4）を染色するためにDIIの能力に影響を及ぼすことを見出した。 DIIの染色環境にさらされるニューロンのための方法は、トリトンX - 100 15とM9で2時間のインキュベーション時間を使用しています。界面活性剤とM9の初期洗浄には、トリトンX - 100は、クチクラ表面から汚れを除去する手助けをし、凝集から動物を防ぐことができます。しかし、同じバッファ内の染色液中での動物三時間インキュベートするキューティクル（表1）染色から色素を防ぎます。これは、洗剤の溶液中で長期の治療によって取り除かれている線虫の表面の脂質が原因である可能性があります。 M9塩溶液はキューティクルのDIIの染色に必要とされていないことを示すDIIの汚れクチクラと水の動物のインキュベーション、。水ベースのプロトコルは神経DIIの染色15に推奨されていますが、我々は、動物がこの方法は頻繁に不健康な出現扱うことがわかります。 0.5％簡単にトリトンX - 100 M9での動物を洗濯、M9で作ったソリューションを染色で三時間のインキュベーションに続いて、クチクラ構造の一貫性のある染色を提供し、動物の健康を維持します。
動物を観察した後、救助され、直接ダウンストリームの解析を可能にして、維持することができます。このメソッドは、を含む、多くの研究で使用することができる便利なツールですが、クチクラ分泌および組織、表皮細胞の開発、異時性遺伝子経路、および線虫の進化に限定されない。
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Disclosures
我々は、開示することは何もない。
Acknowledgments
我々はS.タネジャ-バゲスワル、K. Beifuss、S. Kedroske、そしてHCに感謝したい。有用な議論のためのシャオ。この作品は、分子細胞医学のTAMHSC省からの資金投入を開始することによって資金を供給された。化合物の範囲や回転するディスクは、部門とディーンのTAMHSC Officeが提供する資金で購入した。一部の菌株は、研究資源のためのナショナルセンターによって資金を供給される線虫遺伝学センターによって提供されていました。 pRF4は（ROL - 6（su1006））A.火災の贈り物だった。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DiI (1,1’-Dioctadecyl-3,3,3’,3’-tetramethylindocarbocyanine perchlorate) | Biotium, Inc. | 60010 | Stock dilution: 20 mg/mL in DMF working dilution: 30 mg/mL |
| DMF (Dimethylformamide) | Sigma-Aldrich | D4551 | |
| Triton X-100 (Octylphenoxypolyethoxyethanol) | VWR international | EM-9410 | |
| M9 (22mM KH2PO4, 42mM Na2HPO4, 86mM NaCl, 1mM MgSO4) | |||
| NGM (Nematode growth medium) | IPM Scientific, Inc. | 11006-501 | Can be prepared following NGM agar protocol18 |
| Agar-agar | EMD Millipore | 1.01614 | 4% in water |
| Levamisole (Levamisole hydrochloride) | Sigma-Aldrich | 31742 | 100 μM - 1 mM levamisole as required |
| Microscope slides | VWR international | 16005-106 | |
| Microscope cover glasses | VWR international | 16004-302 | |
| Compound scope | Carl Zeiss, Inc. | A1m | Use objectives to match the needs of the experiment |
| TRITC or other compatible filter | Chroma Technology Corp. | 49005 | ET - DSRed (TRITC/Cy3) sputtered filter set |
References
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