Summary
Nós apresentamos um método para visualizar cutícula ao vivo
Abstract
A cutícula do C. elegans é uma estrutura altamente resistente que envolve o exterior do 1-4 animal. A cutícula não só protege o animal do meio ambiente, mas também determina a forma do corpo e desempenha um papel na motilidade 4-6. Várias camadas secretadas por células epidérmicas compreendem a cutícula, incluindo uma camada lipídica externa 7.
Sulcos circunferenciais na cutícula chamados anéis padrão o comprimento do animal e estão presentes durante todas as fases de desenvolvimento 8. Asa são sulcos longitudinais, que estão presentes durante fases específicas de desenvolvimento, incluindo L1, Dauer e estágios adultos 2,9. Mutações em genes que afetam a organização do colágeno cuticular pode alterar a estrutura cuticular e morfologia do corpo de animais 5,6,10,11. Enquanto imagem cuticular usando microscopia óptica composto com DIC é possível, os métodos atuais que destacam estruturas cuticulares incluem fluorescentecento expressão do transgene 12, coloração de anticorpos 13, e microscopia eletrônica de 1. Rotulados aglutinina de gérmen de trigo (WGA) também tem sido usado para visualizar glicoproteínas cuticular, mas é limitada na resolução de estruturas mais finas cuticular 14. Coloração da superfície cuticular usando corante fluorescente tem sido observado, mas nunca caracterizados em detalhe 15. Nós apresentamos um método para visualizar cutícula ao vivo C. elegans utilizando o corante vermelho fluorescente lipofílico DII (1,1 '-dioctadecyl-3, 3,3', 3'-tetramethylindocarbocyanine perclorato), que é comumente usado em C. elegans para visualizar os neurônios expostos ambientalmente. Este protocolo otimizado para a coloração de DII é um método simples e robusta para a visualização de alta resolução fluorescentes de anéis, asa, vulva, da cauda dos machos, e cauda hermafrodita pico de C. elegans.
Protocol
1. Preparação de DII mancha
- Prepare uma solução estoque de 20 mg / mL DII (Biotium, Inc., Hayward, CA) em DMF. DII é sensível à luz, de modo a proteger da luz DII por envolvimento em folha.
- Criar uma diluição de trabalho de DII, adicionando 0,6 mL de ações DII para 399,4 M9 mL para cada população. Isso deve dar uma diluição final de trabalho de 30 mcg / mL em DII M9. Isto pode ser ampliada para a coloração de múltiplas populações simultaneamente. DII escudo da luz envolvendo o tubo (s) em folha.
2. Preparação de nematóides
- Use uma placa de 60 milímetros contendo uma população de nematóides não contaminada. Lavar os animais de placa usando uma solução de 0,5% Triton X-100 em tampão M9 rodando suavemente líquido em um movimento circular em toda a superfície da placa para soltar todos os animais de larva e adulto. Transferência de lavar em um tubo estéril 1,5 mL.
- Imediatamente girar os animais a 2000 rpm por 30 segundos. Remova e descarte o máximo supernatant possível sem perturbar a massa de animais no fundo do tubo.
- Para reduzir residual Triton X-100, lavar os animais usando M9 buffer, spin, e remover o sobrenadante. Repita este passo uma vez.
- Adicionar 400 mL de solução de trabalho DII em M9 para o tubo e agitar brevemente em vórtice para ressuspender animais na solução.
- Agite tubo a 20 ° C na horizontal durante 3 horas a 350 rpm em um ambiente de luz protegida. Se desejado, os animais podem ser incubadas até 16 horas para a coloração.
- Para reduzir a quantidade de tintura não acoplado, girar os animais a 2000 rpm por 20 seg. Remova e descarte o máximo possível sobrenadante sem perturbar a massa de animais.
- Animais ressuspender em 400 mL de buffer M9 e derramar líquido sobre uma parte livre de bactérias de uma placa de agar NGM semeados com OP50 E. coli. Permitir que os animais para recuperar pelo menos 30 minutos. Durante o tempo de recuperação dos animais deve arrastar para longe o líquido coloração DII e para a comida. Este passoreduz a fluorescência de fundo de DII livre.
3. Montagem e observação de espécimes
- Melt agar 4% em água usando um autoclave ou forno de microondas.
- Criar espaçadores reutilizáveis, que podem ser usados para garantir a espessura uniforme da almofada agar, por camadas dois pedaços de fita laboratório em uma lâmina de vidro. Faça dois slides espaçador total.
- Organizar uma lâmina de vidro limpa entre dois slides espaçador. Pipetar cerca de 150 mL (quatro gotas) de 4% agar derretido para o centro da lâmina de vidro limpa. Rapidamente cobrir o ágar fundido usando um slide adicional para formar um bloco de agar. Remova cuidadosamente a cobertura deslizante, mantendo o bloco centrado na parte superior do slide de montagem.
- Pipetar cerca de 5 mL de nematóide anestésico (100 M - 1 levamisole mM, por exemplo) sobre a almofada.
- Monte 8-12 animais no anestésico e cobrir com uma lamela de microscópio.
- Observe os animais utilizando um microscópio composto ou confocal equipados com pelo menos uma objetividade 40x ve e um DSRed / TRITC (ou outro compatível) do filtro. O máximo de excitação de fluorescência de DII é 549 nm e sua emissão máxima é 565 nm para corante ligado (Biotium, Inc., Hayward, CA).
4. Resultados representante
Manchas DII cutícula do C. do tipo selvagem e mutante elegans. A superfície cuticular contém anéis separados por sulcos circunferenciais e, em alguns estágios, sulcos longitudinais chamado asa. Cada estágio de desenvolvimento tem estruturas cuticulares com composições distintas 2. Sulcos ou sulcos de ambos asa e anéis fluorescente mancha, dependendo da composição da superfície, ao longo de fases de larva e adulto e permanecem visíveis até um dia após a recuperação usando esse método. Manchas fundo fluorescente são por vezes observados (Figuras 2F, G), mas não rotineiramente (Figura 1, Figura 2A-E, H, I). Todas as imagens foram tiradas com disco girando confocal ou, quando indicado, campo amplo de microscopia composto (wf).
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Figura 1. Manchas DII cutícula e neurônios expostos ambientalmente. L2 animais palco. Ampliação de 630x. Partes da imagem em mosaico foram capturados usando-iVision Mac software (BioVision Technologies, Exton, PA). As imagens foram unidas com Adobe Photoshop CS3 (Adobe Systems, Inc., San Jose, CA). Barra de escala = 10 mM. DII também fluorescente manchas amphid e phasmid neurônios sensoriais na cabeça e cauda, respectivamente (setas marcar alguns).
Figura 2. DII fluorescente manchas C. elegans cutícula em todas as fases de desenvolvimento pós-embrionário. Ampliação de 630x. Barra de escala = 10 mM. De coloração de tipo selvagem animais em A L1); B) L2; C) Dauer; D) L3; E) L4, e F) Ciclo de adultos. As cristas asa e anular são manchadas fluorescente nos animais L1 e Dauer (A, C). Manchas DII cristas anelares em animais L2(B). Sulcos anulares mancha em L3 e L4 animais (D, E). Os sulcos da asa e anéis estão manchadas em animais adultos (FH). Asa são compostas de dois, cinco, ou três cumes (em L1, Dauer, ou animais adultos, respectivamente) que correm o comprimento do animal (setas) 16. Anéis criar sulcos circunferenciais ao redor do animal (setas F e J). A cutícula de adultos animais mutantes mostrar moderada defeitos organização cuticular (GH). G) Cumes da asa são descontínuos (wf). H) cumes alae supranumerários são fundidos e ramificada ou bifurcada (wf). Mutantes do gene colágeno exibem asa e defeitos organização anular (IJ). I) Em animais transgênicos com superexpressão pRF4 (rol-6 (su1006)), cumes de mentira asa em um ângulo para o comprimento do animal. J) anéis em animais transgênicos com superexpressão pRF4 (rol-6 (su1006)) apresentam um padrão irregular.
Figura 3. Externestruturas morfológicas al são iluminados por coloração DII. ampliação 630x. Barra de escala = 10 mM. DII também destaca outras características exteriores, incluindo A) adulto hermafrodita vulva, B) adulto raios da cauda dos machos e fã, e C) hermafrodita cauda pico (bifurcada neste contexto mutante).
Cutícula Figura 4. Demora mais tempo a mancha com DII do que neurônios expostos ambientalmente. Ampliação de 630x. Barra de escala = 10 mM. Após duas horas de coloração, amphid (não mostrado) e phasmid neurônios sensoriais (setas) são suficientemente manchada. Em contraste, a cutícula dos animais mais jovens é apenas parcialmente corados em patches (seta).
| Lavar | Solução mancha (+ DII) | Tempo de incubação | Cutícula manchada |
| M9 + Tr 0,5%iton X-100 | M9 + 0,5% Triton X-100 | 2 hrs | não |
| M9 + 0,5% Triton X-100 | M9 + 0,5% Triton X-100 | 3 hrs | não |
| M9 + 0,5% Triton X-100 | M9 | 2 hrs | parcial |
| M9 + 0,5% Triton X-100 | M9 | 3 hrs | sim |
| M9 + 0,5% Triton X-100 | H 2 0 | 2 hrs | parcial |
| M9 + 0,5% Triton X-100 | H 2 0 | 3 hrs | sim |
Tabela 1. Coloração cuticulares em diferentes condições. Vários soluções de incubação e os tempos foram testados para otimizar a coloração cuticular em animais. H 2 0, água destilada estéril. Coloração parcial indica coloração irregular da cutícula larval (Figura 4), embora as manchas cutícula adulto consistently.
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Discussion
O método de coloração DII aqui apresentado permite uma forma relativamente rápida e conveniente de visualizar a cutícula em C. elegans. Pela redefinição e otimização de um método comumente usado para a imagem ambientalmente expostos neurônios sensoriais 15,17, DII pode ser usado para fluorescente mancha tanto asa e estruturas anulares (Figuras 1 e 2), bem como a vulva, a cauda do sexo masculino e hermafrodita cauda pico (Figura 3). Descobrimos que a solução de incubação ea influência do tempo a capacidade de DII de forma consistente manchar a cutícula (Tabela 1, Figura 4). O método de coloração DII neurônios expostos ambientalmente usa um tempo de incubação de duas horas em M9 com Triton X-100 15. Uma lavagem inicial de M9 com o surfactante Triton X-100 ajuda a remover contaminação da superfície cuticular e impede os animais de se agruparem. No entanto, incubando a três animais horas em uma solução de coloração no mesmo tampão impede a tintura de coloração da cutícula (Tabela 1).Isso pode ser causado por lipídios na superfície do nematóide sendo arrancada pelo tratamento mais prolongado na solução detergente. Incubação de animais na água com manchas de DII a cutícula, o que indica que a solução de sal M9 não é necessário para DII coloração da cutícula. Apesar de um protocolo a base de água é recomendado para a coloração de DII neuronal 15, descobrimos que os animais tratados desta maneira aparecem frequentemente insalubres. Lavar animais brevemente em 0,5% Triton X-100 em M9, seguido de uma incubação de três horas em solução corante feito com M9, fornece coloração consistente de estruturas cuticulares e mantém o bem-estar dos animais.
Os animais podem ser resgatados após observação e mantida, permitindo análises diretas a jusante. Este método é uma ferramenta conveniente que pode ser usado em vários estudos, incluindo, mas não limitado a, a secreção cuticular e organização, o desenvolvimento das células epidérmicas, as vias gene heterochronic, e evolução de nematóide.
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Disclosures
Não temos nada a revelar.
Acknowledgments
Gostaríamos de agradecer a S. Taneja-Bageshwar, K. Beifuss, S. Kedroske, e HC. Hsiao para discussões úteis. Este trabalho foi financiado por fundos start-up do Departamento TAMHSC de Medicina Molecular e Celular. O escopo composto e disco giratório foram comprados com fundos fornecidos pelo departamento eo Escritório TAMHSC do Dean. Algumas cepas foram fornecidos pelo Centro de Genética Caenorhabditis, que é financiado pelo Centro Nacional de Pesquisa de Recursos. pRF4 (rol-6 (su1006)) foi um presente de Fogo A..
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DiI (1,1’-Dioctadecyl-3,3,3’,3’-tetramethylindocarbocyanine perchlorate) | Biotium, Inc. | 60010 | Stock dilution: 20 mg/mL in DMF working dilution: 30 mg/mL |
| DMF (Dimethylformamide) | Sigma-Aldrich | D4551 | |
| Triton X-100 (Octylphenoxypolyethoxyethanol) | VWR international | EM-9410 | |
| M9 (22mM KH2PO4, 42mM Na2HPO4, 86mM NaCl, 1mM MgSO4) | |||
| NGM (Nematode growth medium) | IPM Scientific, Inc. | 11006-501 | Can be prepared following NGM agar protocol18 |
| Agar-agar | EMD Millipore | 1.01614 | 4% in water |
| Levamisole (Levamisole hydrochloride) | Sigma-Aldrich | 31742 | 100 μM - 1 mM levamisole as required |
| Microscope slides | VWR international | 16005-106 | |
| Microscope cover glasses | VWR international | 16004-302 | |
| Compound scope | Carl Zeiss, Inc. | A1m | Use objectives to match the needs of the experiment |
| TRITC or other compatible filter | Chroma Technology Corp. | 49005 | ET - DSRed (TRITC/Cy3) sputtered filter set |
References
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