Summary
पारंपरिक, दो आयामी सेल संस्कृति तकनीक अक्सर भेदभाव मार्करों, साइटोकिन्स और वृद्धि कारकों के लिए सम्मान के साथ बदल विशेषताओं में परिणाम. तीन आयामी घूर्णन सेल संस्कृति प्रणाली में सेल संस्कृति (आरसीसी) इन कारकों में से कई की अभिव्यक्ति reestablishes के रूप में एक extravillous ट्रोफोब्लास्ट सेल लाइन के साथ यहाँ दिखाया.
Protocol
1. कोलेजन मनका तैयारी
- पहले 3-D सेल संस्कृति के लिए लोड हो रहा है EVTs Cytodex-3 microcarrier माला तैयार करने की जरूरत है:
- Cytodex-3 प्रयोग के लिए आवश्यक मोतियों की उचित मात्रा में वजन. इस प्रोटोकॉल 10ml आरसीसी पोत के लिए अनुकूलित है, जिसमें मोतियों की 0.05g की जरूरत है. एक 50ml आरसीसी पोत के लिए, तदनुसार पैमाने. एक 50ml Autoclavable शंक्वाकार ट्यूब में 12mL Dulbecco फॉस्फेट के साथ 250 मिलीग्राम Cytodex-3 मोती मिश्रण समाधान (DPBS) buffered. यह राशि 5 आरसीसी वाहिकाओं के लिए पर्याप्त है.
- सुनिश्चित करें कि पर्याप्त मात्रा शंक्वाकार ट्यूब में मौजूद है, के रूप में आटोक्लेव प्रक्रिया वाष्पीकरण में परिणाम होगा. शिथिल 110 ट्यूब और 10 मिनट के लिए आटोक्लेव टोपी डिग्री सेल्सियस
- आटोक्लेव चक्र के पूरा होने पर शंक्वाकार ट्यूब निकालें और Cytodex-3 मनका समाधान शांत करने की अनुमति.
- शंक्वाकार ट्यूब के बाद कमरे के तापमान पर ठंडा है, बाँझ तकनीक का उपयोग करने के लिए कुल मात्रा लाने 12.5mL 1X डीपी का उपयोगबी एस.
- कैप और कमरे के तापमान पर तैयार Cytodex-3 मोतियों की दुकान. प्रफुल्लित तैयार मोती और कमरे के तापमान पर पहले शांत करने के लिए उपयोग की अनुमति दें. Cytodex-3 मोती के ऊपर तैयारी पाँच 10ml आरसीसी वाहिकाओं के लिए प्रदान करेगा. हमने देखा है कि कमरे के तापमान पर Cytodex-3 मोतियों की विस्तारित भंडारण कम प्रदर्शन में परिणाम के रूप में लगभग एक महीने के बाद कोलेजन अस्थिर जाएगा. 133-215 सुक्ष्ममापी से Cytodex-3 मोती आकार में सीमा.
2. मीडिया तैयारी
आरसीसी की 1L अनुकूलित GTSF दो मीडिया (22 से अनुकूलित), जो 40% के सदस्य अल्फा के होते हैं अधिक खुराक और 60% एल 15 लेबोविट्ज़ मीडिया (22 से अनुकूलित), तैयार करें. सबसे पहले, सदस्य अल्फा के साथ पूरक की कुल मात्रा में 400ml तैयार:
21.2mM सोडियम बिकारबोनिट
0.06% Peptone
0.7mm Fructose
1.4mm galactose
5.6mm ग्लूकोज
1% HEPES
1 एल glutamine%
0.5 इसके%
10% एफबीएस- के अपने एक शेयर समाधान तैयार करने के लिए, 5ml बाँझ acidified एच 2 हे हिमनदों एसिटिक एसिड (0.05mL लगभग) के अलावा द्वारा तैयार में भंग. भंवर को भंग करने के लिए, 45mL बाँझ पानी के साथ पालन करें.
- L-15 लेबोविट्ज़ पाउडर पर्याप्त ऊतक संस्कृति ग्रेड एच 2 ओ में भंग करके मध्यम के 600ml के लिए वजन
- सेल संस्कृति माध्यम के कुल एल 15-लेबोविट्ज़ के माध्यम साथ 1L मात्रा लाओ. फ़िल्टर - बाँझ और 4 बजे दुकान ° C अंधेरे में. 1% पेनिसिलिन - स्ट्रेप्टोमाइसिन व्यक्तिगत जोड़ें माध्यम से प्रत्येक के विभाज्य इस्तेमाल किया.
- कई मीडिया GTSF 2-मीडिया की तुलना में अन्य योगों सफलतापूर्वक किया गया है आरसीसी में परीक्षण किया गया. व्यक्तिगत प्रयोगशालाओं माध्यम है जिसके लिए इष्टतम है प्रयोग किया जा रहा है खुद के लिए तय करना होगा.
3. कक्ष और मनका ऊष्मायन
- ~ 80% confluency EVTs प्रोपेगेट trypsinize, और स्वीकार किए जाते हैं सेल संस्कृति प्रथाओं का उपयोग गिनती.
- 4mL गर्म 1x10 6 EVTs निलंबितएड मीडिया.
- धीरे से तैयार Cytodex-3 मोती मिश्रण. बाँझ तकनीकों का प्रयोग, तैयार मोतियों की एक विस्तृत टिप, 10ml सीरम वैज्ञानिक विंदुक और एक अप्रयुक्त 15ml शंक्वाकार ट्यूब स्थानांतरण का उपयोग कर 2.5ml को हटा दें. ध्यान दें कि वहाँ मोतियों के एक छोटे से नुकसान हो सकता है के रूप में वे विंदुक के लिए संलग्न कर सकते हैं.
- Cytodex 3 - मोती ट्यूब के तल पर व्यवस्थित करने के लिए अनुमति दें. अवसादन के बाद, pipettor उपयोग Cytodex-3 मोती परेशान बिना DPBS के ऊपर परत को हटा दें.
- मीडिया में 1x10 6 तैयार EVTs तैयार Cytodex-3 मोतियों के साथ मिक्स.
- कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए सेल - मनका मिश्रण सेते हैं. समय - समय पर धीरे मिश्रण. 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ 2 में एक और 30 मिनट के लिए सेते हैं . समय - समय पर धीरे मिश्रण.
4. RWV लोड हो रहा है
- एक लामिना का प्रवाह कैबिनेट में, पैकेजिंग से एक 10ml आरसीसी को हटाने और यह एक बाँझ, 6 अच्छी तरह से स्थिरता के लिए संस्कृति की थाली में जगह है. आर सी के एक लेबल आरेख के लिए चित्रा 1 देखेंसीएस.
- बंदरगाह से बड़ी डाट निकालें.
- गरम मीडिया के साथ 10ml incubating सेल मनका मिश्रण की कुल मात्रा लाओ.
- आरसीसी में बड़े बंदरगाह के माध्यम से सेल / मनका - मिश्रण लोड. आरसीसी पर झुका होना चाहिए 45 ° (बड़े बंदरगाह तक) कोण जब संभावित हवाई बुलबुले को हटाने में सहायता करने के लिए लोड हो रहा है. पोत धीरे धीरे और तेजी से भरने के द्वारा सकारात्मक दबाव के निर्माण रोकें.
- बड़े बंदरगाह में डाट बदलें.
- 3 एमएल सीरिंज से पिस्टन निकालें और छोटे बंदरगाहों पर सीरिंज खाली जगह. प्रत्येक सिरिंज के लिए मीडिया के एक 3ml जोड़ें. धीरे धीरे दो वाल्व खुला. धीरे सीरिंज पर पिस्टन सिरिंज बदलें. एक सिरिंज से मीडिया जोड़ें जब तक सभी बुलबुले के अंदर कक्ष से हटा रहे हैं.
- आरसीसी उठाओ और धीरे पक्ष नल जबकि यह आप के सामने में rotating के बुलबुले की जांच करने के लिए. अगर वहाँ कोई बुलबुले हैं, तो आप उन्हें पाने के चैम्बर के बाहर करना चाहिए, के रूप में हवा बुलबुले के गठन ओ के साथ हस्तक्षेप करेगाच सेल समुच्चय और कतरनी बलों का परिचय. आरसीसी घूर्णन जब तक बुलबुले छोटे बंदरगाह के तहत कर रहे हैं बुलबुले निकालें. फिर धीरे नीचे सिरिंज पर विपरीत पक्ष पर बंदरगाह और चैम्बर के बाहर में बुलबुले बल धक्का.
- एक तरफ बंदरगाह बंद. धीरे अन्य सिरिंज पिस्टन पर नीचे पुश करने के लिए पोत है जो बनाने से बुलबुले रोकता है में सकारात्मक दबाव की एक छोटी राशि परिचय. दूसरा वाल्व बंद करें.
- रोटर पर आरसीसी लोड. 19rpm पर एक 37 डिग्री सेल्सियस सीओ 2 इनक्यूबेटर में रोटेशन शुरू करो.
5. मीडिया बदलना
- मीडिया हर दूसरे दिन के पहले तीन दिनों के लिए, बदलें तो हर दिन उसके बाद.
- बंद रोटर मुड़ें और आरसीसी को हटायें. पिस्टन ऊपर खींचो कुछ चूषण बनाने के लिए, प्रत्येक छोटे बंदरगाह से सीरिंज को हटाने और एक कोण ताकि मोती बड़े बंदरगाह के विपरीत बसा पर आरसीसी की जगह.
- के बाद मोती सब तय हो चुका है, एक छोटे वाल्व खुला औरमीडिया आरसीसी और बर्बादी कंटेनर में प्रवाह करने की अनुमति देते हैं. इस तरीके में / 2 मीडिया के 3 निकालें. परेशान नहीं है और मोतियों के लिए किसी भी समुच्चय त्यागें नहीं यकीन है.
- छोटे वाल्व बंद और बड़े बंदरगाह खुला. बड़े बंदरगाह के माध्यम से आरसीसी में वापस मीडिया जोड़ें. बड़े बंदरगाह में डाट बदलें.
- 4,9 - 4,6 कदम दोहराएँ.
- के रूप में समुच्चय के आकार में वृद्धि, आप रोटेशन की गति बढ़ाने के उन्हें निलंबन में हर समय रखने के लिए, आदर्श अधिकतम गति पर एक छोटे से संचार पैटर्न में की जरूरत है. आम तौर पर, प्रत्येक भोजन के बाद 0.3-0.7 rpm के बीच गति में वृद्धि एक बार समुच्चय दिख बढ़ रही शुरू.
6. संग्रह कक्ष प्रचार
- रोटर से आरसीसी निकालें. प्रत्येक छोटे बंदरगाह से सीरिंज निकालें और एक कोण पर आरसीसी की जगह इतना है कि मोती बड़े बंदरगाह के विपरीत व्यवस्थित सकता है.
- के बाद मोती सब तय हो चुका है, एक छोटे वाल्व खुला और मीडिया बाहर प्रवाह करने के लिए अनुमति देते हैंआरसीसी और बर्बादी कंटेनर में. इस तरीके में 1 / मीडिया के 3 निकालें.
- छोटे वाल्व बंद और बड़े बंदरगाह खुला. धीरे ज़ुल्फ़ पोत समुच्चय को फैलाने के लिए समाधान में वापस. खाली एक बाँझ 50ml शंक्वाकार ट्यूब में तरल मिश्रण. एकत्र समुच्चय शंक्वाकार ट्यूब में सतह पर तैरनेवाला का उपयोग अच्छी तरह से संस्कृति समुच्चय की वसूली को अधिकतम करने के पोत धोने से पहले व्यवस्थित करने के लिए अनुमति दें. समुच्चय बहाव assays के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है तुरंत, जैसे प्रवाह cytometry, आक्रमण assays, immunofluorescence और दूसरों.
7. प्रतिनिधि परिणाम
EVT की तरह कोशिकाओं (SGHPL-4 ट्रोफोब्लास्ट सेल लाइन) Cytodex-3 मोती पर आरसीसी में उगाई का एक उदाहरण चित्रा 2 में दिखाया गया है. EVT की तरह सेल लाइन मुख्य क्लस्टर से दूर देने और पड़ोसी समूहों के लिए संलग्न के अनुमानों को प्रदर्शित करता है. मोतियों के कई पूरी तरह से प्रचार कोशिकाओं के साथ कवर कर रहे हैं. एक बार आरसीसी और पीएलए से हटाटेड एक बाह्य मैट्रिक्स पर, 3 - डी EVT तरह विकसित कोशिकाओं आक्रामक और / या विस्थापित (चित्रा 3) आक्रमण. RT-पीसीआर डेटा 3 डी समुच्चय में देखा पारंपरिक सेल संस्कृति monolayers (चित्रा 4) के लिए विरोध के रूप में एम एम पी की वृद्धि की अभिव्यक्ति की पुष्टि करता है. दिलचस्प है, आक्रमण के साथ नहीं जुड़े जीन भी आरसीसी में upregulated हैं (तालिका 1) और trophoblasts कोशिकाओं पर हमले के साथ प्रतिरक्षा बातचीत के रूप में ऐसे क्षेत्रों delineating में सहायता कर सकते हैं.
चित्रा 1 घूर्णन सेल संस्कृति प्रणाली (आरसीसी) के कार्टून चित्रण.
चित्रा 2. चरण एक आरसीसी में 5 दिनों के विकास के बाद एक प्रतिनिधि कुल विपरीत माइक्रोग्राफ. तीर हमलावर कोशिकाओं से संकेत मिलता है और * Cytodex-3 microcarrier मोती अर्थ.
चित्रा 4 monolayer और आरसीसी की तुलनात्मक जिलेटिन zymogram SGHPL-4 EVT कोशिकाओं की तरह प्रचारित किया . एमएमपी-2 और एमएमपी-9 के समर्थक और सक्रिय रूपों आरसीसी बड़े हो ट्रोफोब्लास्ट कोशिकाओं (अनुमति के साथ रूपांतरित, रेफरी. 7 से) द्वारा secreted थे.
तालिका 1 SGHPL 4-आरसीसी में विकसित कोशिकाओं (अनुमति के साथ रूपांतरित, रेफरी. 7 से) से माइक्रोएरे परिणामों का सारांश.
- जीन है कि monolayers में पता लगाने की सीमा से नीचे थे इंगित करता है.
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Discussion
यहाँ प्रस्तुत संस्कृति तकनीक अत्यधिक आक्रामक EVT की तरह कोशिकाओं के साथ जांचकर्ताओं प्रदान करता है. अब यह मान्यता प्राप्त किया गया है कि भेदभाव का एक नुकसान रासायनिक और आणविक cues के लिए सेलुलर प्रतिक्रियाओं के तीन आयाम (शिखर, बेसल, और पार्श्व सेल सतहों) 10,13 में निषेध के कारण monolayers में होता है. इस तकनीक EVT कोशिकाओं हमलावर पर utero में विख्यात विशेषताओं को दर्शाता है. के रूप में प्रक्रिया पारंपरिक monolayer टिशू कल्चर समय कैनेटीक्स mimics, लेकिन अंतर अभिव्यक्ति के साथ कोशिकाओं प्रदान करता है, तुलनात्मक assays के नियोजित किया जा सकता है. सेल समूहों किसी भी समय पर प्रयोगों में इस्तेमाल के लिए काटा जा सकता है. वे समूहों या कोलेजन गिरावट के रूप में एकल कक्ष निलंबन के रूप में कोशिकाओं को अलग करने के लिए नियोजित किया जा सकता है इस्तेमाल किया जा सकता है. Cytodex 3 microcarrier मोती scaffolds या microcarrier मोतियों अन्य कोशिकी (ECMS) matrices है कि अधिक व्यक्तिगत प्रयोगशालाओं विशिष्ट हितों के अनुकूल हो सकता है के साथ लेपित के साथ प्रतिस्थापित किया जा सकता है. Alternatively, वहाँ कई अन्य 3 - डी संस्कृति प्लेटफॉर्म है कि अधिक विशिष्ट सेल संस्कृति आवेषण और स्पिनर 10,23 बोतल की तरह कोशिका प्रकार संस्कृति की स्थिति, के लिए अनुकूल हो सकता है . यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि संस्कृति कैनेटीक्स इन परिस्थितियों में अलग हो और व्यक्तिगत रूप से स्थापित किया जाना चाहिए सकता है चाहिए. संस्कृति कैनेटीक्स आसानी से नियमित अंतराल पर आरसीसी से नमूनों को हटाने और विशिष्ट भेदभाव मार्करों, प्रसार, और 15 व्यवहार्यता की अभिव्यक्ति के लिए विश्लेषण किया जा सकता है के लिए परीक्षण किया. इष्टतम प्रसार और भेदभाव कैनेटीक्स समय पर और पारंपरिक monolayer टिशू कल्चर तकनीकों के खिलाफ परिणाम की तुलना द्वारा पता लगाया जा सकता है. एक उदाहरण के रूप में SGHPL 4 कोशिकाओं का प्रयोग, समुच्चय दैनिक हटा दिया गया और Ki67 (प्रसार का निर्धारण करने के लिए) और कस्पासे 3 (apoptosis निर्धारित) के साथ दाग, व्यक्तिगत प्रयोगशालाओं के हितों के लिए विशिष्ट मार्करों आसानी से विमर्श किया जा सकता है. इस के साथ साथ तकनीक वर्णित सर्पिल धमनी के अध्ययन के लिए लागू किया जा सकता हैremodeling, उथले आरोपण, और हमलावर trophoblasts कोशिकाओं को मातृ प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया.
जैसा कि पहले प्रकाशित किया गया है, इस 3 - डी सेल संस्कृति मॉडल भी अन्य सेल लाइनों की एक किस्म 17,14-21 के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. हर मामले में, मॉडल की उपयोगिता ज्ञात भेदभाव मार्करों की एक किस्म के द्वारा परीक्षण किया जाना है. इन विट्रो सेल संस्कृति मॉडल में किसी भी तरह, 3-D सेल संस्कृतियों स्वाभाविक reductionistic हैं. कोई भी संस्कृति मॉडल यंत्रवादी विवरण के सभी प्रदान करते हैं, लेकिन जब अन्य मॉडल, 3 - डी संस्कृतियों रोग से संबंधित तंत्र की हमारी समझ में सुधार करने के लिए एक अतिरिक्त मूल्यवान वैकल्पिक मॉडल, जो विकास के लिए विशाल क्षमता को पकड़ सकता हो से प्रकाशित परिणाम के साथ संयुक्त निदान, रोकथाम, और संक्रामक रोगों के उपचार में उपन्यास उत्पादों और प्रक्रियाओं की.
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Disclosures
हम खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.
Acknowledgments
यह काम अमेरिकी स्वास्थ्य अनुदान NIH / NICHD # HD051998 (सीएएम के लिए) के राष्ट्रीय संस्थानों द्वारा समर्थित किया गया.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cytodex microcarrier beads | Sigma-Aldrich | C3275 | |
| Rotating Cell Culture System (RCCS) | Synthecon | RCCS-D | Includes rotor base, power supply, 4 disposable RCCS units |
| RCCS Disposable Units | Synthecon | Contact Synthecon | |
| 3ml Luer-Lock tip syringe | BD Biosciences | 309585 | |
| 10ml wide-tip serological pipette | BD Biosciences | 357504 | |
| MEM Alpha | Invitrogen | 12561-072 | |
| Leibovitz’s L-15 medium, powder | Invitrogen | 41300-039 | |
| H2O, Endotoxin free | Fisher Scientific | MT-25-055-CM | |
| Sodium Bicarbonate | Sigma-Aldrich | S-7795 | |
| Peptone | Fisher Scientific | BP1420-100 | |
| Fructose | Sigma-Aldrich | F3510-100 | |
| Galactose | Sigma-Aldrich | G5388-100 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G7528-250 | |
| HEPES | Invitrogen | 15630-080 | |
| L-Glutamine | Invitrogen | 25030 | |
| Insulin-Transferrin-Sodium Selenite (ITS) | Sigma-Aldrich | I1884 | |
| FBS | Invitrogen | 10437 | |
| Penicillin-Streptomycin | Invitrogen | 15140 |
References
- Knofler, M. Critical growth factors and signalling pathways controlling human trophoblast invasion. Int. J. Dev. Biol. 54, 269-269 (2010).
- Cartwright, J. E. Remodelling at the maternal-fetal interface: relevance to human pregnancy disorders. Reproduction. 140, 803-803 (2010).
- Harris, L. K. IFPA Gabor Than Award lecture: Transformation of the spiral arteries in human pregnancy: key events in the remodelling timeline. Placenta. 32, Suppl 2. S154-S154 (2011).
- Whitley, G. S., Cartwright, J. E. Trophoblast-mediated spiral artery remodelling: a role for apoptosis. J. Anat. 215, 21-21 (2009).
- Apps, R. Genome-wide expression profile of first trimester villous and extravillous human trophoblast cells. Placenta. 32, 33-33 (2011).
- Bilban, M. Trophoblast invasion: assessment of cellular models using gene expression signatures. Placenta. 31, 989-989 (2010).
- LaMarca, H. L. Three-dimensional growth of extravillous cytotrophoblasts promotes differentiation and invasion. Placenta. 26, 709-709 (2005).
- Jovanovic, M., Stefanoska, I., Radojcic, L., Vicovac, L. Interleukin-8 (CXCL8) stimulates trophoblast cell migration and invasion by increasing levels of matrix metalloproteinase (MMP)2 and MMP9 and integrins alpha5 and beta1. Reproduction. 139, 789-789 (2010).
- Husslein, H. Expression, regulation and functional characterization of matrix metalloproteinase-3 of human trophoblast. Placenta. 30, 284-284 (2009).
- Barrila, J. Organotypic 3D cell culture models: using the rotating wall vessel to study host-pathogen interactions. Nat. Rev. Microbiol. 8, 791-791 (2010).
- Hammond, T. G., Hammond, J. M. Optimized suspension culture: the rotating-wall vessel. Am. J. Physiol. Renal. Physiol. 281, 12-12 (2001).
- Unsworth, B. R., Lelkes, P. I. Growing tissues in microgravity. Nat. Med. 4, 901-901 (1998).
- Schmeichel, K. L., Bissell, M. J. Modeling tissue-specific signaling and organ function in three dimensions. J. Cell. Sci. 116, 2377-2377 (2003).
- Bentrup, H. önerzu, K, Three-dimensional organotypic models of human colonic epithelium to study the early stages of enteric salmonellosis. Microbes. Infect. 8, 1813-1813 (2006).
- Carterson, A. J. A549 lung epithelial cells grown as three-dimensional aggregates: alternative tissue culture model for Pseudomonas aeruginosa pathogenesis. Infect. Immun. 73, 1129-1129 (2005).
- Myers, T. A. Closing the phenotypic gap between transformed neuronal cell lines in culture and untransformed neurons. J. Neurosci. Methods. 174, 31-31 (2008).
- Hjelm, B. E. Development and characterization of a three-dimensional organotypic human vaginal epithelial cell model. Biol. Reprod. 82, 617-617 (2010).
- Straub, T. M. In vitro cell culture infectivity assay for human noroviruses. Emerg. Infect. Dis. 13, 396-396 (2007).
- Nickerson, C. A. Three-dimensional tissue assemblies: novel models for the study of Salmonella enterica serovar Typhimurium pathogenesis. Infect. Immun. 69, 7106-7106 (2001).
- Carvalho, H. M., Teel, L. D., Goping, G., O'Brien, A. D. A three-dimensional tissue culture model for the study of attach and efface lesion formation by enteropathogenic and enterohaemorrhagic Escherichia coli. Cell. Microbiol. 7, 1771-1771 (2005).
- Sainz, B., TenCate, V., Uprichard, S. L. Three-dimensional Huh7 cell culture system for the study of Hepatitis C virus infection. Virol. J. 6, 103-103 (2009).
- Lelkes, P. I., Ramos, E., Nikolaychik, V. V., Wankowski, D. M., Unsworth, B. R., Goodwin, T. J. GTSF-2: a new, versatile cell culture medium for diverse normal and transformed mammalian cells. In Vitro Cell. Dev. Biol. Anim. 33, 344-344 (1997).
- Lelkes, P. I., Ramos, E., Nikolaychik, V. V., Wankowski, D. M., Unsworth, B. R., Goodwin, T. J. GTSF-2: a new, versatile cell culture medium for diverse normal and transformed mammalian cells. In Vitro Cell. Dev. Biol. Anim. 33, 344-344 (1997).
- GE Healthcare. Microcarrier Cell Culture - Principles and Methods. Handbooks. , Available from: http://www.gelifesciences.com/aptrix/upp01077.nsf/Content/service_and_support~documents_and_downloads~handbooks (2005).
