Summary
Tradizionale, bidimensionale tecniche di coltura cellulare spesso sfociano in caratteristiche alterate rispetto ai marcatori di differenziazione, citochine e fattori di crescita. Tridimensionale di coltura cellulare nel sistema delle cellule di rotazione cultura (CCR) ristabilisce l'espressione di molti di questi fattori, come illustrato qui con una linea di cellule extravilloso trofoblasto.
Abstract
Il campo di ricerca trofoblasto umano aiuta a comprendere il complesso ambiente stabilito durante placentazione. A causa della natura di questi studi, umano nella sperimentazione in vivo è impossibile. Una combinazione di colture primarie, culture espianto e linee cellulari trofoblasto 1 supporto la nostra comprensione di invasione della parete uterina 2 e rimodellamento delle arterie spirali uterine 3,4 da parte delle cellule del trofoblasto extravilloso (EVTS), che è richiesto per la costituzione di successo della gravidanza. Nonostante la ricchezza di conoscenze scaturite da tali modelli, si accetta che in modelli di coltura cellulare in vitro utilizzando EVT-come linee cellulari visualizzare alterato proprietà cellulari rispetto alle loro controparti in vivo 5,6. Cellule in coltura delle cellule nel sistema di rotazione cultura (CCR) visualizzare le proprietà morfologiche, fenotipiche e funzionali di EVT-come linee cellulari che più da vicino imitano differenziare in uEVTS Tero, con aumentata espressione di geni che mediano l'invasione (ad esempio metalloproteinasi della matrice (MMP)) e la differenziazione trofoblasto 7,8,9. Il Saint Georges Hospital cellula placentare Linea-4 (SGHPL-4) (gentilmente donato dal Dr. Guy Whitley e il dottor Judith Cartwright) è un EVT-come linea cellulare che è stato utilizzato per la sperimentazione in RCC.
Il progetto della nave cultura RCC si basa sul principio che organi e tessuti funzione in una tridimensionale (3-D) dell'ambiente. A causa delle condizioni di coltura dinamica della nave, comprese le condizioni di taglio fisiologicamente rilevanti, cellule cresciute in tre dimensioni, la forma aggregati sulla base di affinità naturale cellulare e di differenziarsi in tessuti come organotipica assemblee 10,11,12. Il mantenimento di un orbita fluido fornisce un basso taglio, a bassa turbolenza ambiente simile alle condizioni presenti in vivo. Sedimentazione delle cellule in coltura, si contrappone regolando la rotazionevelocità del RCC di assicurare una costante caduta libera delle cellule. Scambio dei gas avviene attraverso una membrana idrofobica permeabile trova sul retro del bioreattore. Come i loro genitori tessuti in vivo, RCC-grown cellule sono in grado di rispondere ad agenti chimici e pendenze molecolare in tre dimensioni (vale a dire la loro superficie apicale, basale e laterale) perché sono colto sulla superficie delle perline microcarrier porosa. Quando coltivate come bidimensionali monostrati su superfici impermeabili come plastica, le celle sono privati di questa importante comunicazione a loro superficie basale. Di conseguenza, i vincoli spaziali imposti dall'ambiente profondamente influenzano il modo in senso cellule e decodificare i segnali dal microambiente circostante, ciò implica un ruolo importante per l'ambiente 3-D 13.
Abbiamo usato il RCC di ingegnere biologicamente significativi modelli 3-D dei vari tessuti epiteliali 7,14,15,16. Infatti, molte relazioni precedenti demonstrated che le cellule coltivate in RCC può assumere fenotipi fisiologicamente rilevanti che non sono stati possibili con altri modelli 10,17-21. In sintesi, la cultura nel RCC rappresenta un modo semplice, riproducibile, high-throughput piattaforma che offre un gran numero di cellule differenziate che sono riconducibili a una serie di manipolazioni sperimentali. Nel seguente protocollo, utilizzando EVTS come esempio, si descrivono chiaramente i passaggi necessari per tridimensionalmente cellule aderenti cultura nel RCC.
Protocol
1. Collagene Bead Preparazione
- Prima di EVTS di carico per 3-D di coltura cellulare, si ha la necessità di preparare il Cytodex-3 perle microcarrier:
- Pesare la quantità appropriata di Cytodex-3 perline richieste per l'esperimento. Questo protocollo è stato adattato per la nave 10ml RCC, in cui 0.05g di perline sono necessari. Per una nave da 50 ml RCC, scala di conseguenza. In un tubo 50mL autoclavabile conica, miscelare 250 mg Cytodex-3 perle con fosfato 12mL soluzione tamponata Dulbecco (DPBS). Questa quantità è sufficiente per 5 vasi RCC.
- Garantire un adeguato volume è presente nel tubo conico, come il processo in autoclave si tradurrà in evaporazione. Liberamente tappo del tubo e autoclave per 10 min a 110 ° C.
- Rimuovere il tubo conico al completamento del ciclo di autoclave e permettere al Cytodex-3 tallone soluzione per il raffreddamento.
- Dopo che il tubo conico è raffreddata a temperatura ambiente, utilizzare una tecnica sterile per portare il volume complessivo a 12.5mL usando 1X DPBS.
- Cap e conservare il preparato Cytodex-3 perline a temperatura ambiente. Lasciare le perline pronti a gonfiarsi e raffreddare a temperatura ambiente prima dell'uso. La preparazione di sopra di Cytodex-3 perle fornirà per cinque vasi da 10 ml RCC. Abbiamo osservato che lo stoccaggio prolungato di Cytodex-3 perline a temperatura ambiente si tradurrà in un peggioramento delle prestazioni, come il collagene destabilizzerà dopo circa un mese. Cytodex-3 perle variano nel formato 133-215 micron.
2. Preparazione dei media
Preparare 1L di RCC ottimizzato GTSF-2 media (adattato da 22), che consiste di 40% MEM alfa, oltre a integratori e il 60% L-15 Leibovitz media (adattato da 22). In primo luogo, preparare 400mL nel volume totale di MEM alfa integrato con:
Bicarbonato di sodio 21.2mM
0,06% peptone
Fruttosio 0,7 mm
Galattosio 1,4 mm
Glucosio 5,6 mm
1% HEPES
1% di L-glutammina
0,5% ITS
10% FBS- Per preparare una soluzione madre di ITS, si sciolgono in 5 ml sterili acidificato H 2 O preparato con l'aggiunta di acido acetico glaciale (circa 0,05 ml). Swirl per sciogliere, seguire con 45ml di acqua sterile.
- Pesare abbastanza L-15 Leibovitz polvere per 600ml di media sciogliendo in tessuto-cultura di grado H 2 O.
- Portare il volume totale di terreno di coltura cellulare per 1L con L-15 di media Leibovitz. Filtro-sterilizzare e conservare a 4 ° C al buio. Aggiungere 1% penicillina-streptomicina singolarmente a ciascuna aliquota del supporto utilizzato.
- Molte formulazioni supporti diversi GTSF-2 media sono stati testati con successo nel RCC. I singoli laboratori devono decidere da soli quale mezzo è ottimale per l'esperimento in corso.
3. Cellule e incubazione Bead
- Propagare la EVTS al ~ 80% confluenza, trypsinize e contare utilizzando pratiche accettate colture cellulari.
- Sospendere 1x10 6 EVTS in 4 ml di caldoed i media.
- Mescolare delicatamente preparato Cytodex-3 perline. Usando tecniche sterili, rimuovere 2,5 ml di perline preparati con una punta larga, 10mL sierologici pipetta e trasferire ad un tubo di 15 ml conica inutilizzato. Si noti che ci può essere una piccola perdita di perle come essi attribuiscono alla pipetta.
- Lasciare che il Cytodex-3 perline a depositarsi sul fondo della provetta. Dopo la sedimentazione, utilizzare una pipetta per rimuovere lo strato superiore della DPBS senza disturbare il Cytodex-3 perline.
- Mescolare la 1x10 6 EVTS preparato in media con il preparato Cytodex-3 perline.
- Incubare le cellule tallone miscela a temperatura ambiente per 30 min. Periodicamente mescolare delicatamente. Incubare per altri 30 minuti a 37 ° C e 5% di CO 2. Periodicamente mescolare delicatamente.
4. Caricamento del RWV
- In una cappa a flusso laminare, rimuovere un RCC 10 ml dalla confezione e collocarlo in una sterile, 6-ben piastra di coltura per la stabilità. Fare riferimento alla Figura 1 per un diagramma etichetta della RCCS.
- Togliere il tappo di grandi dimensioni dal porto.
- Portare il volume totale del incubando cellule tallone miscela di 10 ml con i media riscaldato.
- Caricare il cellulare / tallone miscela nel RCC attraverso il grande porto. Il RCC dovrebbe essere inclinato a 45 ° (fino grande porto) durante il caricamento per favorire l'eliminazione delle bolle d'aria potenziale. Evitare l'accumulo di pressione positiva compilando la nave lentamente e costantemente.
- Sostituire il fermo nel porto di grandi dimensioni.
- Rimuovere i pistoni dal 3-ml siringhe e le siringhe vuoto sul piccoli porti. Aggiungere 1-3 ml di media per ogni siringa. Aprire lentamente le due valvole. Sostituire i pistoni siringa sul siringhe delicatamente. Aggiungere i media da una siringa fino a quando tutte le bolle vengono rimossi dalla camera interna.
- Sollevare il RCC e picchiettare delicatamente sul lato mentre ruotando di fronte a voi per verificare le bolle. Se ci sono delle bolle, è necessario uscire dalla camera, come bolle d'aria si interferisce con la formazione of aggregati cellulari e introdurre forze di taglio. Eliminare le bolle ruotando il RCC fino a quando le bolle sono sotto il piccolo porto. Quindi spingere delicatamente verso il basso la siringa sul lato opposto per costringere le bolle nella porta e fuori della camera.
- Chiudere una porta laterale. Premere delicatamente il pistone siringa altro di introdurre una piccola quantità di pressione positiva nel vaso, che impedisce la formazione di bolle. Chiudere la valvola secondo.
- Caricare il RCC sul rotore. Avviare la rotazione a 19rpm a 37 ° C CO 2 incubatore.
5. Modifica della media
- Cambiare il supporto a giorni alterni per i primi tre giorni, poi ogni giorno successivo.
- Spegnere il rotore e rimuovere il RCC. Tirare i pistoni fino a creare qualche aspirazione, rimuovere le siringhe da ogni piccolo porto e posizionare il RCC in un angolo in modo che le perline risolvere opposto del porto grande.
- Dopo le perle hanno risolta, aperta una delle valvole piccole epermettere ai media di flusso fuori del RCC e in un contenitore dei rifiuti. Rimuovere 2 / 3 dei media in questo modo. Essere sicuri di non disturbare le perline e scartare qualsiasi non aggregati.
- Chiudere la valvola di piccole e aprire la porta di grandi dimensioni. Aggiungi supporti indietro nel RCC attraverso il grande porto. Sostituire il fermo nel porto di grandi dimensioni.
- Ripetere i passaggi 4,6-4,9.
- Come gli aggregati aumento delle dimensioni, è necessario aumentare la velocità di rotazione per tenerli in sospensione in ogni momento, idealmente in un pattern circolatorio piccolo a velocità ottimale. In generale, aumentare la velocità tra 0,3-0,7 giri dopo ogni poppata, una volta aggregati iniziano a crescere visibilmente.
6. Raccolta di propagazione delle cellule
- Rimuovere il RCC dal rotore. Rimuovere le siringhe da ogni piccolo porto e posizionare il RCC in un angolo in modo che le perline può risolvere opposto del porto grande.
- Dopo le perle sono tutti sistemati, aprire una delle piccole valvole e consentire ai media di defluiredel RCC e in un contenitore dei rifiuti. Togliere 1 / 3 della media in questo modo.
- Chiudere la valvola di piccole e aprire la porta di grandi dimensioni. Agitare delicatamente la nave per disperdere gli aggregati riportare in soluzione. Vuoto miscela liquida in una sterile da 50ml tubo conico. Lasciare che il aggregati raccolti a stabilirsi nel tubo conica prima di utilizzare il surnatante per lavare a fondo la nave cultura a massimizzare il recupero degli inerti. Gli aggregati possono essere utilizzati per le analisi immediatamente a valle, come la citometria a flusso, saggi di invasione, immunofluorescenza e altri.
7. Rappresentante Risultati
Un esempio di come le cellule-EVT (SGHPL-4 linea cellulare trofoblasto) coltivate nella RCC di Cytodex-3 perline è mostrato in Figura 2. La EVT-come linea cellulare mostra le proiezioni si estende lontano dal cluster principale e allegando ai cluster vicini. Molte delle perle sono completamente coperte con le cellule di propagazione. Una volta tolto dal RCC e plaTed su una matrice extracellulare, la EVT-come le cellule coltivate in 3-D aggressivamente invadere e / o migrare (Figura 3). RT-PCR dati confermano l'aumentata espressione di MMP visto in 3-D aggregati al contrario di monostrati tradizionali colture cellulari (Figura 4). È interessante notare che i geni non sono associati con invasione anche sovraregolati in RCC (Tabella 1) e può aiutare a delineare aree come le interazioni con l'invasione delle cellule immunitarie trophoblasts.
Figura 1. Cartoon rappresentazione del Cell System Rotating Cultura (CCR).
Figura 2. Micrografia contrasto di fase di un aggregato rappresentante crescita dopo 5 giorni in un RCC. Le frecce indicano le cellule invadono e * denota la Cytodex-3 perline microcarrier.
Figura 4. Comparativa zymogram gelatina di monostrato e RCC propagato SGHPL EVT-4-come le cellule. Forme e pro-attiva di MMP-2 e MMP-9 sono stati secreti dalle cellule del trofoblasto cresciuto RCC (Adattato, con il permesso, dal rif. 7).
Tabella 1. Sintesi dei risultati da microarray SGHPL-4 cellule coltivate in RCC (Adattato, con il permesso, dal rif. 7).
- Indica geni che erano al di sotto del limite di rilevamento in monostrati.
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Discussion
La tecnica di cultura qui presentata fornisce investigatori altamente invasiva EVT-come le cellule. Ora è stato riconosciuto che una perdita di differenziazione avviene in monostrati a causa dell'inibizione della risposta cellulare ad agenti chimici e spunti molecolare in tre dimensioni (superficie delle cellule apicali, basali e laterali), 10,13. Questa tecnica riflette le caratteristiche indicate in utero a invadere le cellule EVT. Poiché la procedura imita convenzionale monostrato tessuto cinetica tempo la cultura, ma fornisce cellule con espressione differenziale, le analisi comparative possono essere impiegati. Gruppi di cellule possono essere raccolte per l'uso in esperimenti in qualsiasi momento. Possono essere utilizzati come gruppi o degradazione del collagene possono essere utilizzate per isolare le cellule di sospensione singola cella. I-3 Cytodex perline microcarrier può essere sostituito con supporti o perline microcarrier rivestiti con altre matrici extracellulari (ECM) che possono essere più favorevole agli interessi specifici singoli laboratori '. Alternataalizzati, ci sono molti altri in 3-D piattaforme di cultura che può essere più favorevole a condizioni specifiche delle cellule di tipo culturale, come inserti in colture cellulari e filatore fiaschi 10,23. Va notato che la cinetica della cultura potrebbe essere diverso in queste circostanze e deve essere stabilita individualmente. Cinetica la cultura può essere facilmente testati per rimuovendo campioni dal RCC a intervalli regolari e analisi per l'espressione di marcatori di differenziazione distintivo, la proliferazione e la vitalità 15. Proliferazione ottimali e cinetica differenziazione può essere accertata confrontando i risultati nel tempo e contro le tecniche convenzionali monostrato di coltura tissutale. Utilizzando il SGHPL-4 celle come esempio, aggregati sono stati rimossi giornalmente e colorati con Ki67 (per determinare la proliferazione) e della caspasi-3 (per determinare l'apoptosi), marcatori specifici per gli interessi dei singoli laboratori 'possono essere facilmente scambiati. La tecnica qui descritta può essere applicata allo studio delle arterie a spiraleristrutturazione, l'impianto poco profondo, e materna risposte immunitarie a invadere le cellule trofoblasti.
Come è stato pubblicato in precedenza, questo modello 3-D di coltura cellulare può essere utilizzato anche per una varietà di altre linee cellulari 17,14-21. In ogni caso, l'utilità del modello deve essere testato da una serie di marcatori di differenziazione conosciuto. Come ogni modello di coltura cellulare in vitro, in 3-D colture cellulari sono intrinsecamente riduzionista. Nessun modello culturale unico fornirà tutti i dettagli meccanicistica, ma se combinati con i risultati pubblicati da altri modelli, 3-D culture diventano un ulteriore modello valida alternativa per migliorare la nostra comprensione dei meccanismi correlati alla malattia, che può contenere un potenziale enorme per lo sviluppo di nuovi prodotti e le procedure per la diagnosi, la prevenzione e il trattamento delle malattie infettive.
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Disclosures
Non abbiamo nulla da rivelare.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato sostenuto dal National Institutes of Health statunitensi concedere NIH / NICHD # HD051998 (per CAM).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cytodex microcarrier beads | Sigma-Aldrich | C3275 | |
| Rotating Cell Culture System (RCCS) | Synthecon | RCCS-D | Includes rotor base, power supply, 4 disposable RCCS units |
| RCCS Disposable Units | Synthecon | Contact Synthecon | |
| 3ml Luer-Lock tip syringe | BD Biosciences | 309585 | |
| 10ml wide-tip serological pipette | BD Biosciences | 357504 | |
| MEM Alpha | Invitrogen | 12561-072 | |
| Leibovitz’s L-15 medium, powder | Invitrogen | 41300-039 | |
| H2O, Endotoxin free | Fisher Scientific | MT-25-055-CM | |
| Sodium Bicarbonate | Sigma-Aldrich | S-7795 | |
| Peptone | Fisher Scientific | BP1420-100 | |
| Fructose | Sigma-Aldrich | F3510-100 | |
| Galactose | Sigma-Aldrich | G5388-100 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G7528-250 | |
| HEPES | Invitrogen | 15630-080 | |
| L-Glutamine | Invitrogen | 25030 | |
| Insulin-Transferrin-Sodium Selenite (ITS) | Sigma-Aldrich | I1884 | |
| FBS | Invitrogen | 10437 | |
| Penicillin-Streptomycin | Invitrogen | 15140 |
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