Summary
Traditionel, todimensionale cellekultur teknikker ofte resultere i ændrede egenskaber med hensyn til differentiering markører, cytokiner og vækstfaktorer. Tre-dimensionel cellekultur i den roterende cellekultur-system (RCCS) genopretter udtryk for mange af disse faktorer, som vist her med en extravillous trofoblasten cellelinje.
Abstract
Feltet af menneskelige trofoblasten forskning aids i at forstå den komplekse miljø etableret i løbet placentation. På grund af arten af disse undersøgelser, humane in vivo eksperimenter er umuligt. En kombination af primære kulturer, eksplantation kulturer og trofoblasten cellelinier 1 Støtte vores forståelse af invasion af livmodervæggen 2 og ombygning af uterin spiral arterier 3,4 af extravillous trofoblasten celler (EVTs), som er nødvendig for en vellykket etablering af graviditeten. På trods af den rigdom af viden hentet fra sådanne modeller, er det accepteret, at in vitro-cellekultur modeller ved hjælp af EVT-lignende celle linjers display ændrede cellulære egenskaber i forhold til deres in vivo modstykker 5,6. Cellerne dyrkes i den roterende cellekultur-system (RCCS) display morfologiske, fænotypisk, og funktionelle egenskaber af EVT-lignende celle linjer, der i højere grad efterligner differentiere i uTero EVTs, med øget ekspression af gener medierende invasion (f.eks matrixmetalloproteinaser (MMPs)) og trofoblasten differentiering 7,8,9. Saint Georges Hospital Placental cellelinie-4 (SGHPL-4) (venligst doneret af Dr. Guy Whitley og Dr. Judith Cartwright) er en EVT-lignende cellelinie, der blev brugt til test i RCCS.
Udformningen af RCCS kultur skib er baseret på princippet om, at organer og væv fungerer i en tre-dimensionel (3-D) miljø. På grund af de dynamiske dyrkningsbetingelser i skibet, herunder betingelser for fysiologisk relevante shear, celler dyrket i tre dimensioner danner aggregater baseret på naturlige cellulære tilhørsforhold og differentiere sig til organotypiske væv-agtige forsamlinger 10,11,12. Opretholdelse af en væske bane giver en lav-forskydning, lav turbulens miljø, der svarer til tilstande, der findes in vivo. Sedimentation af dyrkede celler er imødegås ved at justere rotationenhastighed RCCS at sikre en konstant frit fald af celler. Gasbørs sker gennem et permeabelt hydrofob membran placeret på bagsiden af bioreaktor. Ligesom deres forældre væv in vivo, er RCCS-dyrket celler i stand til at reagere på kemiske og molekylær gradienter i tre dimensioner (dvs. på deres apikale, basale og laterale overflader), fordi de dyrkes på overfladen af porøse microcarrier perler. Når der dyrkes som to-dimensionelle monolag på befæstede arealer som plastik, er cellerne berøvet denne vigtige kommunikation på deres basale overflade. Derfor, den rumlige begrænsninger, som miljøet dybt indflydelse på, hvordan celler fornuft og afkode signaler fra det omgivende mikromiljø, hvilket antyder en vigtig rolle for de 3-D miljø 13.
Vi har brugt RCCS til ingeniør biologisk meningsfuld 3-D modeller af forskellige menneskelige epitelvæv 7,14,15,16. Mange tidligere rapporter har DEMonstrated at cellerne dyrkes i RCCS kan påtage sig fysiologisk relevante fænotyper, der ikke har været muligt med andre modeller 10,17-21. Sammenfattende repræsenterer kulturen i RCCS en nem, reproducerbar, high-throughput platform, der giver et stort antal af differentierede celler, der gøres til genstand for en bred vifte af eksperimentelle manipulationer. I det følgende protokol, ved hjælp EVTs som et eksempel vi klart beskrive de nødvendige skridt til tre-dimensionelt kultur klæbende celler i RCCS.
Protocol
1. Kollagen Bead Forberedelse
- Før læsning EVTs for 3-D-cellekultur, skal en til at forberede Cytodex-3 microcarrier perler:
- Afvejes en passende mængde Cytodex-3 perler kræves til eksperimentet. Denne protokol er tilpasset til de 10ml RCCS fartøj, hvor 0.05g af perler er nødvendige. For en 50ml RCCS fartøj, skala i overensstemmelse hermed. I en 50mL autoklaverbar konisk rør, 250 mg Cytodex-3 perler blandes med 12ml Dulbecco fosfatbuffer opløsning (DPBS). Dette beløb er tilstrækkeligt til 5 RCCS fartøjer.
- Sørg for tilstrækkelig volumen er til stede i den koniske rør, som autoklaven processen vil resultere i fordampning. Løst cap røret og autoklaver i 10 min ved 110 ° C.
- Fjern den koniske rør ved afslutningen af autoklaven cyklus og tillade Cytodex-3 perle løsning til afkøling.
- Efter den koniske rør er afkølet til stuetemperatur, brug steril teknik til at bringe det samlede volumen til 12.5mL hjælp 1X DPBS.
- Cap og gem den tilberedte Cytodex-3 perler ved stuetemperatur. Lad den forberedte perler til at svulme op og afkøles til stuetemperatur før brug. Ovenstående forberedelse af Cytodex-3 perler vil give fem 10mL RCCS fartøjer. Vi har observeret, at forlænget opbevaring af Cytodex-3 perler ved stuetemperatur vil resultere i mindsket ydelse, som kollagen vil destabilisere efter ca en måned. Cytodex-3 perler varierer i størrelse fra 133 til 215 μm.
2. Medier Forberedelse
Forbered 1L af RCCS optimeret GTSF-2 medier (tilpasset fra 22), som består af 40% MEM alpha, plus tillæg og 60% L-15 Leibovitz medier (tilpasset fra 22). Først forberede 400ml i total volumen på MEM alpha suppleret med:
21.2mM natriumbicarbonat
0,06% pepton
0,7 mm Fruktose
1.4mm Galactose
5.6mm Glucose
1% HEPES
1% L-glutamin
0,5% DETS
10% FBS- For at forberede en stamopløsning af ITS, opløses i 5 ml sterilt syrnede H 2 O udarbejdet af tilsætning af iseddike (ca. 0.05mL). Swirl til at opløse, følge med 45mL sterilt vand.
- Afvejes nok, L-15 Leibovitz er pulver til 600ml af medium ved at opløse i cellekultur klasse H 2 O.
- Bring den samlede mængde af cellekulturmedium til 1L med L-15 Leibovitz er medium. Filter-steriliseres og opbevares ved 4 ° C i mørke. Tilsæt 1% Penicillin-Streptomycin individuelt til hver anvendt alikvot af medium.
- Mange medier formuleringer andre end GTSF-2 medier har været afprøvet med succes i RCCS. Individuelle laboratorier skal selv afgøre, hvilke medium er optimal for eksperimentet udføres.
3. Celler og Bead inkubation
- Udbrede EVTs til ~ 80% confluency, trypsinize og tælle med accepteret cellekultur praksis.
- Suspendér 1x10 6 EVTs i 4ml af varmted medier.
- Bland forsigtigt forberedt Cytodex-3 perler. Ved hjælp af sterile teknikker, 2,5 ml af tilberedte perler ved hjælp af en bred spids, 10 ml serologisk pipette og overføres til en ubrugt 15ml konisk rør fjerne. Bemærk, at der kan være et lille tab af perler, som de tillægger pipette.
- Lad Cytodex-3 perler at slå sig ned på bunden af røret. Efter sedimentering, så brug en pipette til at fjerne det øverste lag af DPBS uden at forstyrre Cytodex-3 perler.
- Bland 1x10 6 forberedt EVTs i medierne med den klargjorte Cytodex-3 perler.
- Inkubér celle-perlen blanding ved stuetemperatur i 30 min. Periodisk bland forsigtigt. Inkuber i yderligere 30 min ved 37 ° C og 5% CO 2. Periodisk bland forsigtigt.
4. Ilægning af RWV
- I et lagdelt stinkskab, fjerne en 10mL RCCS fra emballagen og læg den i et sterilt, 6-såvel kultur plade for stabilitet. Se figur 1 for en mærket diagram af RCCS.
- Fjern den store proppen fra havnen.
- Bring det samlede volumen af de inkubere celle-perle blandingen til 10 ml med opvarmet medier.
- Load cellen / perle-blandingen ind i RCCS gennem den store port. Den RCCS skal vippes i en 45 ° vinkel (store port op), når du lægger til hjælp ved fjernelse af potentielle luftbobler. Undgå opbygning af positivt tryk ved at udfylde det fartøj langsomt og støt.
- Sæt proppen i den store havn.
- Fjern stemplerne fra 3-mL sprøjter og placere den tomme sprøjter på små havne. Tilsæt 1-3 ml af medier til hver sprøjte. Langsomt åbner de to ventiler. Sæt sprøjten stemplerne på sprøjter forsigtigt. Tilføj medier fra en sprøjte, indtil alle bobler er fjernet fra kammerets indvendige.
- Løft RCCS og forsigtigt trykke på side, mens dreje den foran dig for at kontrollere, om bobler. Hvis der er bobler, skal du få dem ud af kammeret, da luftbobler vil forstyrre dannelsen of celle-aggregater og indføre shear kræfter. Fjern bobler ved at dreje RCCS indtil boblerne er under den lille havn. Derefter forsigtigt trykke ned på sprøjten på den modsatte side at tvinge boblerne i porten og ud af kammeret.
- Luk den ene side port. Tryk forsigtigt ned på den anden sprøjten stemplet til at indføre en lille mængde af positivt tryk i fartøjet, som forhindrer bobler fra formning. Tæt andenplads ventil.
- Læg RCCS på rotoren. Start rotation på 19rpm i en 37 ° C CO 2 inkubator.
5. Ændring af Media
- Skift medierne hver anden dag i de første tre dage, derefter hver dag derefter.
- Sluk rotoren og fjern RCCS. Træk stemplerne op til skabe nogle sug, skal du fjerne sprøjter fra hver lille havn og placere RCCS på en vinkel, så perlerne afregne modsatte af den store havn.
- Efter perlerne alle har slået sig ned, åbne en af de små ventiler oggøre det muligt for medierne at flyde ud af RCCS og ind i en affaldsbeholder. Tag 2 / 3 af medierne på denne måde. Vær sikker på ikke at forstyrre perler og ikke kassere nogen aggregater.
- Luk den lille ventil og åbne den store port. Tilføj medie tilbage i RCCS gennem den store port. Sæt proppen i den store havn.
- Gentag trin fra 4,6 til 4,9.
- Som aggregater vokse i størrelse, er du nødt til at øge omdrejningstallet at holde dem i affjedring på alle tidspunkter, helst i en lille kredsløbssygdomme mønster med optimal hastighed. Generelt øge hastigheden mellem 0,3-0,7 rpm efter hver fodring, når de aggregater begynder at vokse synligt.
6. Indsamling opformeret celler
- Fjern RCCS fra rotoren. Fjern sprøjter fra hver lille havn og placere RCCS på en vinkel, så perlerne kan bilægge modsatte af den store havn.
- Efter perlerne alle har slået sig ned, åbne en af de små ventiler og gøre det muligt for medierne at flyde udaf RCCS og ind i en affaldsbeholder. Tag 1 / 3 af medierne på denne måde.
- Luk den lille ventil og åbne den store port. Vend forsigtigt skibet at sprede aggregater tilbage til opløsning. Tomme flydende blanding i en steril 50 ml konisk rør. Lad de indsamlede aggregater at bosætte sig i den koniske rør, før du bruger supernatant til grundigt at vaske den kultur skibet at maksimere genvinding af aggregater. Aggregaterne kan anvendes til downstream-analyser med det samme, så som flowcytometri, invasion assays, immunofluorescens og andre.
7. Repræsentative resultater
Et eksempel på EVT-lignende celler (SGHPL-4 trofoblasten cellelinje) dyrkes i RCCS på Cytodex-3 perler er vist i figur 2. Den EVT-lignende celle linie viser fremskrivninger forlænge væk fra de største klynge og er knyttet til nabolandet klynger. Mange af perlerne er helt dækket med formerings celler. Når fjernet fra RCCS og PLATED på en ekstracellulær matrix, EVT-lignende 3-D dyrkede celler aggressivt invadere og / eller migrere (Figur 3). RT-PCR data bekræfter den øgede udtryk for MMPs ses i 3-D aggregater i modsætning til traditionelle cellekultur monolag (Figur 4). Interessant nok er gener ikke forbundet med invasionen også opreguleres i RCCS (tabel 1) og kan hjælpe til at afgrænse områder som immun interaktioner med invaderende trophoblasts celler.
Figur 1. Cartoon skildring af den roterende Cell Culture System (RCCS).
Figur 2. Fasekontrast mikrograf af et repræsentativt aggregat efter 5 dage vækst i et RCCS. Pile angiver invaderende celler og * betegner Cytodex-3 microcarrier perler.
Figur 4. Sammenlignende gelatine zymogram af éncellelag og RCCS opformeret SGHPL-4 EVT-lignende celler. Pro-og aktive former af MMP-2 og MMP-9 blev der udskilles af RCCS vokset trofoblasten celler (Tilpasset med tilladelse fra ref. 7).
Tabel 1. Sammenfatning af microarray resultater fra SGHPL-4 celler dyrket i en RCCS (Tilpasset med tilladelse fra ref. 7).
- Indikerer gener, der lå under grænsen for detektion i monolag.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Kulturen Teknikken præsenteres her giver efterforskerne med yderst invasive EVT-lignende celler. Det er nu blevet anerkendt, at et tab af differentiering forekommer i monolag på grund af hæmning af cellulære reaktioner på kemiske og molekylære signaler i tre dimensioner (apikale, basale og lateral celleoverfladerne) 10,13. Denne teknik afspejler karakteristika bemærket i livmoderen på invaderende EVT celler. Da proceduren efterligner konventionelle éncellelag vævskultur tid kinetik, men giver celler med differentieret ekspression, kan komparative analyser være ansat. Cell klynger kan høstes til brug i forsøg på noget tidspunkt. De kan bruges som klynger eller collagen nedbrydning kan anvendes til at isolere celler som enkelt celle suspension. Den Cytodex-3 microcarrier perler kan erstattes med scaffolds eller microcarrier perler belagt med andre ekstracellulære matricer (ECMS), der kan være mere befordrende for enkelte laboratorier specifikke interesser. Skifsatsen af henholdsvis fysisk, er der mange andre 3-D kultur, platforme, der kan være mere befordrende for specifikke celletype dyrkningsbetingelser, som cellekultur indsætter og spinner kolber 10,23. Det skal bemærkes, at kulturen kinetik kunne være anderledes under disse omstændigheder og bør etableres individuelt. Kultur kinetik kan let testes for ved at tage prøver fra RCCS med jævne mellemrum og analysere for udtryk for markante differentiering markører, spredning og levedygtighed 15. Optimal spredning og differentiering kinetik kan konstateres ved at sammenligne resultater over tid og mod konventionelle éncellelag vævskultur teknikker. Brug af SGHPL-4-celler som et eksempel, var aggregater fjernes dagligt og farves med Ki67 (til at bestemme spredning) og caspase-3 (til at bestemme apoptose), Markers specifikke for de enkelte laboratorier interesser kan let udveksles. Teknikken er beskrevet heri kan anvendes til studiet af spiral arterieremodeling, lavvandede implantation, og moderens immunrespons til at invadere trophoblasts celler.
Som det er blevet offentliggjort tidligere, kan denne 3-D cellekultur modellen også bruges til en række andre cellelinjer 17,14-21. I hvert tilfælde har nytte af modellen, der skal testes af en række kendte differentiering markører. Som enhver in vitro-cellekultur-model, er 3-D cellekulturer sagens natur reduktionistisk. Ingen enkelt kultur model vil give alle de mekanistiske detaljer, men når de kombineres med offentliggjorte resultater fra andre modeller, 3-D kulturer bliver en ekstra værdifuldt alternativ model til at forbedre vores forståelse af sygdomsrelaterede mekanismer, som kan holde et enormt potentiale for udvikling af nye produkter og procedurer i diagnose, forebyggelse og behandling af infektionssygdomme.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Vi har intet at afsløre.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af det amerikanske National Institutes of Health tilskud NIH / NICHD # HD051998 (til CAM).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cytodex microcarrier beads | Sigma-Aldrich | C3275 | |
| Rotating Cell Culture System (RCCS) | Synthecon | RCCS-D | Includes rotor base, power supply, 4 disposable RCCS units |
| RCCS Disposable Units | Synthecon | Contact Synthecon | |
| 3ml Luer-Lock tip syringe | BD Biosciences | 309585 | |
| 10ml wide-tip serological pipette | BD Biosciences | 357504 | |
| MEM Alpha | Invitrogen | 12561-072 | |
| Leibovitz’s L-15 medium, powder | Invitrogen | 41300-039 | |
| H2O, Endotoxin free | Fisher Scientific | MT-25-055-CM | |
| Sodium Bicarbonate | Sigma-Aldrich | S-7795 | |
| Peptone | Fisher Scientific | BP1420-100 | |
| Fructose | Sigma-Aldrich | F3510-100 | |
| Galactose | Sigma-Aldrich | G5388-100 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G7528-250 | |
| HEPES | Invitrogen | 15630-080 | |
| L-Glutamine | Invitrogen | 25030 | |
| Insulin-Transferrin-Sodium Selenite (ITS) | Sigma-Aldrich | I1884 | |
| FBS | Invitrogen | 10437 | |
| Penicillin-Streptomycin | Invitrogen | 15140 |
References
- Knofler, M. Critical growth factors and signalling pathways controlling human trophoblast invasion. Int. J. Dev. Biol. 54, 269-269 (2010).
- Cartwright, J. E. Remodelling at the maternal-fetal interface: relevance to human pregnancy disorders. Reproduction. 140, 803-803 (2010).
- Harris, L. K. IFPA Gabor Than Award lecture: Transformation of the spiral arteries in human pregnancy: key events in the remodelling timeline. Placenta. 32, Suppl 2. S154-S154 (2011).
- Whitley, G. S., Cartwright, J. E. Trophoblast-mediated spiral artery remodelling: a role for apoptosis. J. Anat. 215, 21-21 (2009).
- Apps, R. Genome-wide expression profile of first trimester villous and extravillous human trophoblast cells. Placenta. 32, 33-33 (2011).
- Bilban, M. Trophoblast invasion: assessment of cellular models using gene expression signatures. Placenta. 31, 989-989 (2010).
- LaMarca, H. L. Three-dimensional growth of extravillous cytotrophoblasts promotes differentiation and invasion. Placenta. 26, 709-709 (2005).
- Jovanovic, M., Stefanoska, I., Radojcic, L., Vicovac, L. Interleukin-8 (CXCL8) stimulates trophoblast cell migration and invasion by increasing levels of matrix metalloproteinase (MMP)2 and MMP9 and integrins alpha5 and beta1. Reproduction. 139, 789-789 (2010).
- Husslein, H. Expression, regulation and functional characterization of matrix metalloproteinase-3 of human trophoblast. Placenta. 30, 284-284 (2009).
- Barrila, J. Organotypic 3D cell culture models: using the rotating wall vessel to study host-pathogen interactions. Nat. Rev. Microbiol. 8, 791-791 (2010).
- Hammond, T. G., Hammond, J. M. Optimized suspension culture: the rotating-wall vessel. Am. J. Physiol. Renal. Physiol. 281, 12-12 (2001).
- Unsworth, B. R., Lelkes, P. I. Growing tissues in microgravity. Nat. Med. 4, 901-901 (1998).
- Schmeichel, K. L., Bissell, M. J. Modeling tissue-specific signaling and organ function in three dimensions. J. Cell. Sci. 116, 2377-2377 (2003).
- Bentrup, H. önerzu, K, Three-dimensional organotypic models of human colonic epithelium to study the early stages of enteric salmonellosis. Microbes. Infect. 8, 1813-1813 (2006).
- Carterson, A. J. A549 lung epithelial cells grown as three-dimensional aggregates: alternative tissue culture model for Pseudomonas aeruginosa pathogenesis. Infect. Immun. 73, 1129-1129 (2005).
- Myers, T. A. Closing the phenotypic gap between transformed neuronal cell lines in culture and untransformed neurons. J. Neurosci. Methods. 174, 31-31 (2008).
- Hjelm, B. E. Development and characterization of a three-dimensional organotypic human vaginal epithelial cell model. Biol. Reprod. 82, 617-617 (2010).
- Straub, T. M. In vitro cell culture infectivity assay for human noroviruses. Emerg. Infect. Dis. 13, 396-396 (2007).
- Nickerson, C. A. Three-dimensional tissue assemblies: novel models for the study of Salmonella enterica serovar Typhimurium pathogenesis. Infect. Immun. 69, 7106-7106 (2001).
- Carvalho, H. M., Teel, L. D., Goping, G., O'Brien, A. D. A three-dimensional tissue culture model for the study of attach and efface lesion formation by enteropathogenic and enterohaemorrhagic Escherichia coli. Cell. Microbiol. 7, 1771-1771 (2005).
- Sainz, B., TenCate, V., Uprichard, S. L. Three-dimensional Huh7 cell culture system for the study of Hepatitis C virus infection. Virol. J. 6, 103-103 (2009).
- Lelkes, P. I., Ramos, E., Nikolaychik, V. V., Wankowski, D. M., Unsworth, B. R., Goodwin, T. J. GTSF-2: a new, versatile cell culture medium for diverse normal and transformed mammalian cells. In Vitro Cell. Dev. Biol. Anim. 33, 344-344 (1997).
- Lelkes, P. I., Ramos, E., Nikolaychik, V. V., Wankowski, D. M., Unsworth, B. R., Goodwin, T. J. GTSF-2: a new, versatile cell culture medium for diverse normal and transformed mammalian cells. In Vitro Cell. Dev. Biol. Anim. 33, 344-344 (1997).
- GE Healthcare. Microcarrier Cell Culture - Principles and Methods. Handbooks. , Available from: http://www.gelifesciences.com/aptrix/upp01077.nsf/Content/service_and_support~documents_and_downloads~handbooks (2005).
