Summary
Traditionnel, en deux dimensions techniques de culture cellulaire entraînent souvent des caractéristiques modifiées par rapport aux marqueurs de différenciation, de cytokines et de facteurs de croissance. Culture cellulaire en trois dimensions dans le système de culture cellulaire en rotation (CRCT) rétablit l'expression de plusieurs de ces facteurs comme montré ici avec une lignée de cellules trophoblastiques extravilleux.
Abstract
Le domaine de la recherche trophoblaste humain aide à comprendre l'environnement complexe créé pendant la placentation. En raison de la nature de ces études, l'expérimentation in vivo humaine est impossible. Une combinaison de cultures primaires, des cultures d'explants et des lignées cellulaires trophoblastiques une aide notre compréhension de l'invasion de la paroi utérine 2 et le remodelage des artères utérines 3,4 spirale par les cellules trophoblastiques extravilleux (TTE), qui est nécessaire à l'établissement réussi de la grossesse. Malgré la richesse des connaissances glanées ces modèles, il est admis que dans les modèles de culture cellulaire in vitro utilisant des lignées cellulaires EVT-comme l'affichage altéré les propriétés cellulaires par rapport à leurs homologues de 5,6 vivo. Les cellules cultivées dans le système de culture cellulaire en rotation (CRCT) afficher les propriétés morphologiques, phénotypiques et fonctionnelles des lignées cellulaires EVT-like qui imitent plus étroitement de différenciation dans uTTE tero, avec une expression accrue des gènes de l'invasion de médiation (par exemple, les métalloprotéases matricielles (MMP)) et 7,8,9 de différenciation du trophoblaste. L'Hôpital Saint-Georges de cellules placentaires Ligne-4 (SGHPL-4) (fournie gracieusement par le Dr Guy Whitley et la Dre Judith Cartwright) est une lignée cellulaire EVT-like qui a été utilisé pour les essais dans le CRCT.
La conception du récipient de culture CRCT est basé sur le principe que les organes et tissus de fonction dans une des trois dimensions (3-D) environnement. En raison des conditions de culture dynamique dans le navire, y compris des conditions de cisaillement physiologiquement pertinents, les cellules cultivées en trois dimensions forment des agrégats basés sur les affinités naturelles cellulaire et se différencier en tissus organotypiques-like assemblées 10,11,12. Le maintien d'une orbite de liquide fournit une faible cisaillement, faible turbulence environnement similaire aux conditions rencontrées in vivo. Sédimentation des cellules cultivées est contré par l'ajustement de la rotationvitesse de la CRCT pour assurer une constante chute libre des cellules. Les échanges gazeux se produit à travers une membrane hydrophobe perméable située à l'arrière du bioréacteur. Comme leurs parents tissus in vivo, CRCT cellules cultivées sont capables de répondre aux gradients chimiques et moléculaires en trois dimensions (c'est à dire à leurs surfaces apicale, basale et latérale), parce qu'ils sont cultivés sur la surface de billes de microsupport poreux. Lorsqu'il est cultivé comme deux dimensions monocouches sur des surfaces imperméables comme le plastique, les cellules sont privés de cette communication importante à leur surface basale. Par conséquent, les contraintes spatiales imposées par l'environnement affectent profondément la manière dont le sens et les signaux des cellules du microenvironnement décoder environnantes, ce qui implique un rôle important pour le milieu en 3-D 13.
Nous avons utilisé le CRCT à l'ingénieur biologiquement significative modèles 3-D des différents tissus épithéliaux humains 7,14,15,16. En effet, de nombreux rapports précédents ont demonstrated que les cellules cultivées dans le CRCT peut supposer phénotypes physiologiquement pertinents qui n'ont pas été possibles avec d'autres modèles 10,17-21. En résumé, la culture dans le CRCT représente un moyen facile, reproductibles, à haut débit plateforme qui fournit un grand nombre de cellules différenciées qui se prêtent à une variété de manipulations expérimentales. Dans le protocole suivant, en utilisant TTE comme un exemple, nous décrivent clairement les étapes nécessaires à la culture de cellules en trois dimensions adhérente à la CRCT.
Protocol
1. Collagène talon Préparation
- Avant de TTE chargement pour 3-D de culture cellulaire, on a besoin pour préparer les perles microporteur Cytodex-3:
- Peser la quantité appropriée de Cytodex-3 perles nécessaires pour l'expérience. Ce protocole est adapté pour le navire 10ml CRCT, dans lequel 0.05g de perles sont nécessaires. Pour un navire de 50ml CRCT, l'échelle en conséquence. Dans un tube conique de 50 ml autoclavable, mélanger 250 mg Cytodex-3 perles avec 12 mL de tampon phosphate de Dulbecco solution (DPBS). Ce montant est suffisant pour les navires CRCT 5.
- Assurer un volume suffisant est présent dans le tube conique, comme le procédé autoclave se traduira par évaporation. Librement bouchon du tube et autoclaver pendant 10 min à 110 ° C.
- Retirez le tube conique à l'achèvement du cycle de l'autoclave et laisser la solution Cytodex-3 billes pour refroidir.
- Après le tube conique a refroidi à température ambiante, utilisez une technique stérile pour porter le volume total à 12,5 ml en utilisant 1X DPBS.
- Cap et de stocker les prêts Cytodex-3 perles à température ambiante. Autoriser les billes préparées à gonfler et refroidir à température ambiante avant utilisation. La préparation ci-dessus de Cytodex-3 perles fournira pendant cinq vaisseaux CRCT 10mL. Nous avons observé que le stockage prolongé des Cytodex-3 perles à la température ambiante se traduira par des performances diminuées, comme le collagène va déstabiliser après environ un mois. Cytodex-3 perles varient en taille de 133 à 215 um.
2. Préparation des médias
Préparer 1L de CRCT optimisé GTSF-2 supports (adapté de 22), qui se compose de 40% MEM alpha, plus les suppléments et 60% de L-15 des médias Leibovitz (adapté de 22). D'abord, préparer 400 ml de volume total de MEM alpha complété par:
Bicarbonate de sodium 21.2mM
Peptonée 0,06%
Le fructose 0,7 mm
Galactose 1.4mm
Glucose 5.6mm
HEPES 1%
1% de L-glutamine
0,5% DE SON
F 10%BS- Pour préparer une solution stock de SES, se dissoudre dans 5 ml stériles acidifiés H 2 O préparé par addition d'acide acétique glacial (environ 0,05 ml). Swirl de dissoudre, suivent avec 45 ml d'eau stérile.
- Peser assez de L-15 de poudre Leibovitz pour 600ml de milieu par dissolution dans la culture de tissus de qualité H 2 O.
- Porter le volume total de milieu de culture cellulaire à 1L avec milieu L-15 Leibovitz. Filtre-stériliser et conserver à 4 ° C dans l'obscurité. Ajouter 1% de pénicilline-streptomycine individuellement à chaque aliquote de support utilisé.
- Beaucoup de formulations de milieux autres que GTSF-2 médias ont été testés avec succès dans le CRCT. Les laboratoires doivent décider eux-mêmes moyennes est optimal pour l'expérience étant réalisée.
3. Les cellules et incubation de billes
- Propager les TTE à ~ 80% de confluence, trypsiniser et compter suivant des pratiques de culture cellulaire.
- Suspendre 1x10 6 TTE dans 4 ml d'eau tièdeed médias.
- Mélanger délicatement préparés Cytodex-3 perles. En utilisant des techniques stériles, retirer 2,5 ml de billes préparées en utilisant une pointe de large, 10 ml pipette sérologique et le transfert à un tube conique de 15 ml inutilisées. Notez qu'il peut y avoir une petite perte de perles qu'ils attachent à la pipette.
- Laisser le Cytodex-3 perles de s'installer sur le fond du tube. Après la sédimentation, l'utilisation d'une pipette pour enlever la couche supérieure de DPBS sans déranger les perles Cytodex-3.
- Mélanger les 6 1x10 TTE préparés dans les médias avec le prêt Cytodex-3 perles.
- Incuber le mélange de cellules-perles à température ambiante pendant 30 min. Périodiquement mélanger doucement. Incuber pendant 30 min supplémentaires à 37 ° C et 5% de CO 2. Périodiquement mélanger doucement.
4. Chargement de la RWV
- Dans une hotte à flux laminaire, supprimer un CRCT 10mL de l'emballage et le placer dans une solution stérile, plaque de culture à 6 puits pour la stabilité. Reportez-vous à la Figure 1 pour un diagramme étiqueté de la RCCS.
- Retirez le bouchon grands du port.
- Porter le volume total de l'incubation de cellules-perles mélange à 10 ml avec les médias réchauffé.
- Chargez la cellule / perle-mélange dans le CRCT à travers le grand port. Le CRCT devrait être incliné à un angle de 45 ° (jusqu'à grand port) lors du chargement d'aide à l'élimination des bulles d'air éventuelles. Empêcher l'accumulation de pression positive en remplissant la cuve lentement et régulièrement.
- Remplacer le bouchon dans le grand port.
- Retirez les pistons des seringues de 3 ml et les seringues vides sur les petits ports. Ajouter 3 ml de 1-médias pour chaque seringue. Ouvrez lentement les deux valves. Remplacer les pistons des seringues sur les seringues doucement. Ajouter le média d'une seringue jusqu'à ce que toutes les bulles sont retirés de la chambre à l'intérieur.
- Ramassez le CRCT et tapotez délicatement le côté tout en le tournant en face de vous pour vérifier bulles. S'il ya des bulles, vous devez les faire sortir de la chambre, comme les bulles d'air vont interférer avec la formation of agrégats de cellules et d'introduire des forces de cisaillement. Retirer les bulles en tournant le CRCT jusqu'à ce que les bulles sont sous le petit port. Puis poussez doucement la seringue sur le côté opposé à la force des bulles dans le port et hors de la chambre.
- Fermer un port côté. Appuyez doucement sur le piston de la seringue d'autres d'introduire une petite quantité de pression positive dans la cuve, ce qui empêche la formation de bulles. Fermer le robinet secondes.
- Chargez le CRCT sur le rotor. Démarrer la rotation à 19rpm dans un 37 ° C incubateur à CO 2.
5. Changer les médias
- Changer les médias chaque jour pendant les trois premiers jours, puis tous les jours par la suite.
- Eteignez le rotor et enlevez le CRCT. Tirez sur le piston pour créer une certaine aspiration, enlever les seringues de chaque petit port et la place du CRCT sur un angle de telle sorte que les billes de s'installer en face du grand port.
- Après les perles ont tous installés, ouvrez l'une des valves petites etpermettre aux médias de s'écouler hors du CRCT et dans un conteneur à déchets. Retirer les 2 / 3 de la presse de cette manière. Soyez sûr de ne pas perturber les perles et de ne pas jeter tout agrégats.
- Fermez le robinet et ouvrir la petite grand port. Ajouter le média de nouveau dans le CRCT à travers le grand port. Remplacer le bouchon dans le grand port.
- Répétez les étapes 4.6 à 4.9.
- Comme l'augmentation de la taille des agrégats, dont vous avez besoin pour augmenter la vitesse de rotation pour les maintenir en suspension, en tout temps, idéalement dans un schéma de circulation petite vitesse optimale. En règle générale, augmenter la vitesse de 0.3 à 0,7 entre les tours après chaque tétée une fois les agrégats commencent à croître visiblement.
6. Collecte Propagé Cellules
- Retirez le CRCT par le rotor. Retirer les seringues de chaque petit port et la place du CRCT sur un angle de telle sorte que les billes peuvent s'installer en face du grand port.
- Après les perles ont tous installés, ouvrez l'une des valves petites et permettre aux médias de coulerde l'CRCT et dans un conteneur à déchets. Retirer 1 / 3 de la presse de cette manière.
- Fermez le robinet et ouvrir la petite grand port. Agiter doucement la cuve pour disperser les agrégats dans la solution. Videz le mélange liquide dans un tube conique 50ml stériles. Autoriser les agrégats recueillis à s'installer dans le tube conique avant d'utiliser le surnageant de laver à fond du récipient de culture pour optimiser la récupération des agrégats. Les agrégats peuvent être utilisés pour les essais en aval immédiatement, comme la cytométrie de flux, des dosages d'invasion, d'immunofluorescence et d'autres.
7. Les résultats représentatifs
Un exemple de EVT-comme des cellules (SGHPL-4 lignée cellulaire trophoblastique) cultivés dans le CRCT sur Cytodex-3 perles est montré dans la figure 2. La lignée cellulaire EVT-like affiche projections s'étendant loin de l'amas principal et attachant aux clusters voisins. Beaucoup de perles sont entièrement recouvertes de cellules multiplication. Une fois sorti du CRCT et PLATed sur une matrice extracellulaire, l'EVT-like 3-D des cellules cultivées envahissent agressivement et / ou migrer (figure 3). RT-PCR données confirment l'augmentation de l'expression de MMP vu en 3-D par opposition aux agrégats traditionnels monocouches de culture cellulaire (figure 4). Fait intéressant, les gènes ne pas associée à l'invasion sont également surexprimés dans le CRCT (tableau 1) et peut aider à délimiter des domaines tels que les interactions immunitaires avec l'invasion des cellules trophoblastes.
Figure 1. Portrait caricatural du système de culture cellulaire de rotation (CRCT).
Figure 2. Micrographie par contraste de phase d'un agrégat représentant après une croissance de 5 jours dans un CRCT. Les flèches indiquent les cellules envahissant et * indique les perles microporteur Cytodex-3.
Figure 4. Comparative zymogramme gélatine de monocouche et CRCT propagé SGHPL-4 EVT-comme les cellules. Pro-formes et active de la MMP-2 et MMP-9 ont été sécrétés par des cellules CRCT le trophoblaste grandi (Adapté, avec permission, de Réf. 7).
Tableau 1. Sommaire des résultats de puces à ADN SGHPL-4 des cellules cultivées dans un CRCT (Adapté, avec permission, de Réf. 7).
- Indique les gènes qui ont été en dessous de la limite de détection dans les monocouches.
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Discussion
La technique de la culture présentées ici fournit aux enquêteurs hautement invasive EVT-comme les cellules. Il a maintenant été reconnu que la perte de la différenciation se produit dans les monocouches due à l'inhibition des réponses cellulaires aux signaux chimiques et moléculaires dans les trois dimensions (surface des cellules apicales, basales et latérales) 10,13. Cette technique reflète les caractéristiques noté in utero sur l'invasion des cellules TEV. Comme la procédure conventionnelle imite monocouche cinétiques de culture de tissu du temps, mais fournit des cellules avec une expression différentielle, essais comparatifs peuvent être employées. Des amas de cellules peuvent être récoltées pour être utilisées dans des expériences à tout moment. Ils peuvent être utilisés comme des grappes ou de la dégradation du collagène peut être utilisé pour isoler les cellules que la suspension cellulaire unique. Les perles Cytodex-3 microporteur peuvent être remplacés par des échafaudages ou des perles microporteur revêtu d'autres matrices extracellulaires (ECM) qui peuvent être plus favorable aux intérêts des laboratoires individuels spécifiques. Alternattivement, il ya beaucoup d'autres plates-formes de la culture 3-D qui peut être plus propice à des conditions spécifiques de cellules de type de culture, comme inserts de culture cellulaire et de spinner flacons 10,23. Il est à noter que la cinétique de la culture pourrait être différente dans ces circonstances, et devrait être établie individuellement. Cinétique de la culture peut facilement être testé pour en prélevant des échantillons de la CRCT à intervalles réguliers et d'analyse de l'expression des marqueurs de différenciation distinctifs, la prolifération et la viabilité 15. La prolifération et la cinétique de différenciation optimale peut être déterminée en comparant les résultats avec le temps et contre les techniques conventionnelles monocouche culture de tissus. Utilisation de la 4-cellules SGHPL titre d'exemple, les agrégats ont été enlevés quotidienne et colorées avec Ki67 (pour déterminer la prolifération) et de la caspase-3 (pour déterminer l'apoptose), marqueurs spécifiques aux intérêts de chacun des laboratoires »peuvent être facilement échangés. La technique décrite ici peut être appliquée à l'étude de l'artère en spiraleremodelage, l'implantation peu profonde, et la mère les réponses immunitaires à envahir les cellules trophoblastes.
Comme cela a déjà été publiées, ce modèle 3-D de culture cellulaire peut également être utilisé pour une variété d'autres lignées cellulaires 17,14-21. Dans tous les cas, l'utilité du modèle doit être testé par une variété de marqueurs de différenciation connue. Comme tout modèle in vitro de culture cellulaire, en 3-D des cultures de cellules sont intrinsèquement réductionniste. Aucun modèle de culture unique fournira tous les détails mécanistiques, mais lorsqu'ils sont combinés avec les résultats publiés par d'autres modèles, en 3-D cultures deviennent un modèle alternatif supplémentaires utiles pour améliorer notre compréhension des maladies liées à des mécanismes, qui peut tenir un énorme potentiel pour le développement de nouveaux produits et des procédures dans le diagnostic, la prévention et le traitement des maladies infectieuses.
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Disclosures
Nous n'avons rien à révéler.
Acknowledgments
Ce travail a été soutenu par les Instituts nationaux américains de la Santé subvention du NIH / NICHD # HD051998 (au CAM).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cytodex microcarrier beads | Sigma-Aldrich | C3275 | |
| Rotating Cell Culture System (RCCS) | Synthecon | RCCS-D | Includes rotor base, power supply, 4 disposable RCCS units |
| RCCS Disposable Units | Synthecon | Contact Synthecon | |
| 3ml Luer-Lock tip syringe | BD Biosciences | 309585 | |
| 10ml wide-tip serological pipette | BD Biosciences | 357504 | |
| MEM Alpha | Invitrogen | 12561-072 | |
| Leibovitz’s L-15 medium, powder | Invitrogen | 41300-039 | |
| H2O, Endotoxin free | Fisher Scientific | MT-25-055-CM | |
| Sodium Bicarbonate | Sigma-Aldrich | S-7795 | |
| Peptone | Fisher Scientific | BP1420-100 | |
| Fructose | Sigma-Aldrich | F3510-100 | |
| Galactose | Sigma-Aldrich | G5388-100 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G7528-250 | |
| HEPES | Invitrogen | 15630-080 | |
| L-Glutamine | Invitrogen | 25030 | |
| Insulin-Transferrin-Sodium Selenite (ITS) | Sigma-Aldrich | I1884 | |
| FBS | Invitrogen | 10437 | |
| Penicillin-Streptomycin | Invitrogen | 15140 |
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