Summary
En ny og svært effektiv totrinns affinitet kromatografi protokoll er utviklet og er beskrevet i detalj. Metoden er basert på en liten rensing tag med to iboende slektskap og gjelder for et bredt spekter av target proteiner med ulike egenskaper.
Abstract
På grunn av de høye kostnadene forbundet med rensing av rekombinante proteiner protokollene må rasjonaliseres. For high-throughput innsats det er behov for generelle metoder som ikke krever target protein spesifikke optimalisering 1. For å oppnå dette, er rensing koder som genetisk kan være smeltet sammen til genet av interesse brukte to. Den mest brukte slektskap håndtaket er det Hexa-histidin tag, som er egnet for rensing under både innfødte og denaturering forhold 3. Den metabolske byrde for å produsere den koden er lav, men det gir ikke like høy spesifisitet som konkurrerende affinitet kromatografi baserte strategier 1,2.
Her en bispecific rensing tag med to forskjellige bindingssteder på en 46 aminosyre, har lite protein domenenavn blitt utviklet. Den albumin-bindende domenet er avledet fra streptokokker protein G og har en sterk iboende affinitet til human serum albumin(HSA). Elleve overflate-eksponerte aminosyrer, ikke involvert i albumin-bindende 4, var genetisk randomisert til å produsere en kombinatorisk bibliotek. Proteinet bibliotek med romanen tilfeldig arrangert binding overflate (figur 1) ble uttrykt på phage partikler å forenkle valg av bindemidler ved phage skjermteknologi. Gjennom flere runder med biopanning mot en dimeric Z-domene avledet fra stafylokokk protein A 5, en liten, bispecific molekyl med affinitet for både HSA og romanen målet ble identifisert seks.
Romanen protein domene, referert til som ABDz1, ble vurdert som en renselse tag for et utvalg av target proteiner med forskjellig molekylvekt, løselighet og isoelektrisk punkt. Tre target proteiner ble uttrykt i Escherishia coli med romanen tag smeltet sammen til deres N-Termini og deretter affinitet renset. Initial rensing på enten en kolonne med immobilisert HSA eller Z-domene resulterte i relativtvely rene produkter. To-trinns affinitet rensing med bispecific tag resulterte i betydelig forbedring av protein renhet. Kromatografiske media med Z-domenet immobilisert, for eksempel MabSelect Jada, er lett tilgjengelig for rensing av antistoffer og HSA kan enkelt kjemisk koblet til media for å gi den andre matrisen.
Denne metoden er spesielt fordelaktig når det er høy etterspørsel på renhet av innhentede mål protein. Den bifunctionality av merket lar to forskjellige kromatografiske trinn som skal brukes mens den metabolske byrden på uttrykket verten er begrenset på grunn av den lille størrelsen på koden. Det gir et konkurransedyktig alternativ til såkalte kombinatoriske tagging der flere koder brukes i kombinasjon 1,7.
Protocol
1. Kloning av målet gene/ABDz1-tagged fusjon konstruere
- Forbered PCR fragmenter av ABDz1 genet flankert av egnet begrensning områder for N-terminal ligation av målet genet i uttrykket plasmidet (et plasmid som inneholder ABDz1 er fritt tilgjengelig gjennom et materiale transfer avtale).
- Cleave renset uttrykk vektor og PCR fragmenter med valgt restriksjon enzymer i en passende reaksjon buffer. Rense produktene før ligation.
- Ligate med begrenset ABDz1 fragment inn i uttrykket vektor som inneholder genet av interesse og forvandle ligation produktet til E. coli (i den opprinnelige metoden RR1ΔM15 belastningen ble brukt 8). Spre forvandlet celler på agar plater supplert med egnet antibiotika for valg.
- PCR skjermen noen kolonier og sekvens verifisere den resulterende uttrykket kassetten ved DNA-sekvensering.
- Forbered plasmid fra en overnatting kultur av en sekvens verifIED koloni og transformere til foretrukket uttrykket belastning (i den opprinnelige metoden E. coli Rosetta (DE3), hosting en pRARE plasmid for å forbedre produksjonen av proteiner kodet av menneskelige gener, ble brukt).
2. Protein uttrykk
- Inokulere en enkelt bakterie koloni i 10 ml tryptic soya sjy supplert med 5 g / l gjærekstrakt og riktig antibiotika. Inkuber ved 150 rpm ved 37 ° C over natten.
- Inokulere 1 ml av natten kultur i 100 ml friskt medium og indusere protein uttrykk (opprinnelig 1 mm isopropyl-β-D-thiogalactoside når en lac operon ble brukt) når cellene når den logaritmiske vekst fase.
- Inkuber ved 150 rpm ved 25 ° C over natten og høste celler ved sentrifugering.
3. Ortogonale affinitet rensing
- Resuspender pellet i 25 ml kjører buffer (25 mM Tris-HCl, 200 mM NaCl, 1 mM EDTA, 0,05% (w / v) 20 Tween, pH 8,0) og forstyrre the cellene ved sonikator på 60% amplitude og 1.0/1.0 pulser for 3 min. Sentrifuger prøven og filter målet protein inneholder supernatanten (0,45 mikrometer) før videre rensing.
- Stabilisere seg enten 1 ml HSA Sepharose kolonne eller en NHS-aktivert kolonnen, tidligere kombinert med HSA henhold til leverandørens anbefalinger, med 10 kolonne volumer (CV) til å kjøre buffer på 1 ml / min på et egnet protein rensing system. Legg bakteriell lysate på 0,5 ml / min og deretter tilbakestille strømningshastighet til 1 ml / min.
- Vask kolonnen med 5 CV å kjøre buffer etterfulgt av 5 CV av å vaske buffer (5 mM NH 4 Ac, 5.5 pH).
- Eluer prøven med elueringsmiddel buffer (0,5 M HAC, 2,5 pH) på 1 ml / min og samle fraksjoner, overvåke absorpsjon ved 280 nm for å velge fraksjoner fra elueres topp for ytterligere rensing.
- Pool av fraksjonene med høyest protein konsentrasjon fortynnes to ganger i Jada kjører buffer (20 mM fosfat, 150 mM NaCl, 7,2 pH) ogsørge for at pH er rundt nøytral. Tilsett 1 M Tris-HCl pH 8 for å øke pH hvis nødvendig.
- Load prøven på 0,5 ml / min på en 1 ml HiTrap MabSelect Jada kolonne som har vært likevekt med 10 CV av Jada kjøre buffer på 1 ml / min. Reset strømningshastigheten til 1 ml / min etter lasting.
- Vask kolonnen med 5 CV av Jada kjører buffer (trinn 5) og Eluer proteiner med 0,2 M HAC, 2,7 pH. For sensitive target proteiner eluatet kan nøytraliseres direkte på samling ved tilsetting av Tris-HCl.
Hvis kromatografiske trinnene er reversert eluatet fra MabSelect Jada kolonnen kan fortynnes i rennende buffer (trinn 3.1) og pH økt til rundt 8 med tillegg av 1 M Tris-HCl. Generelt er smalere topper observert da den sikre matrisen er ansatt i andre trinn.
Fire. Evaluering av renhet ved natrium dodecyl sulfat polyakrylamid gel elektroforese (SDS-PAGE)
- Legg rensede fraksjoner på enredusere SDS-PAGE og, hvis ønskelig, analysere den molekylære vekten av renset produktet ved massespektrometri. Det er viktig å fullt redusere prøven siden en gratis cystein i ABDz1 kan føre dimerization av produktet under ikke-reduserende forhold.
5. Representant Resultater:
Som et bevis på prinsipp, ble ortogonale affinitet rensing tilrettelagt av ABDz1 tag evaluert i tre human target proteiner som representerer forskjellige løselighet klasser, molekylvekt og isoelektrisk punkt (Tabell 1). Den ABDz1 genet var genetisk smeltet til målet gener og konstruerer ble uttrykt i E. coli, viser figur 2 et flytskjema for alle trinn i metoden fortløpende. Etter rensing av ortogonale protokollen, ble prøver samlet inn på ulike punkter analyseres ved SDS-PAGE (figur 3). Resultatene viser tydelig nytten av en dobbel tag og to svært spesifikke rensing trinn. Selv om rimelig renhet er achieved etter den første rensingen sett fra gels, gir de påfølgende trinnet et svært rent produkt godt egnet for svært krevende applikasjoner.
Figur 1. Utforming av kombinatoriske bibliotek som brukes for valg av bispecific ABDz1 tag.
De 46 aminosyre albumin-bindende domene folder til en stabil tre helix bundle og den inneholder en forpliktende nettsted for human serum albumin i hovedsak lokalisert til andre helix. Ved genetisk randomisering elleve overflate utsatt aminosyrer plassert i første og tredje helix, var en roman bindende overflate konstruert. De elleve stillingene er angitt i figuren og nummerert i henhold til Kraulis et al. 9. Etter biopanning mot en dimer av Z-domene av stafylokokk protein A med kombinatoriske bibliotek uttrykt på phage ble bispecific ABDz1 molekylet identifisert.
Figur 2. En forenklet flytskjema for ortogonale affinitet rensing protokollen.
En PCR-fragment som inneholder ABDz1 sekvensen er ligated (N-terminalt) med et gen av interesse i en passende uttrykk vektor. Den ligation Produktet er forvandlet til E. coli for sekvens verifikasjon og plasmid forberedelse. Etter transformasjon til et uttrykk vert, er en storstilt kultur for rekombinant protein uttrykk satt opp fra en første natten kultur. Bakterier høstes ved sentrifugering og lyseres av sonikator å produsere bakteriell lysate inneholder målet protein. Etter en filtrering skritt for å fjerne rester av partikler, er lysate utsatt for ortogonale affinitet rensing på et flytende håndteringssystem av gjennomgår to rensing trinn på rad. Elueres topper fra begge rensing trinnene er prøvetatt og nærmere evaluert av SDS-PAGE for å vurdere renhet og i forhold til than lysate før rensing.
Figur 3. SDS-PAGE analyse av target proteiner uttrykt og renset i fusjon med ABDz1.
Prøver tatt fra bakteriell lysate av tre proteiner uttrykt i fusjon til ABDz1, som representerer forskjellige egenskaper, og ABDz1 tag selve ble samlet sammen med prøver fra tilsvarende toppene fra rensing på en HSA-kolonnen, etterfulgt av en MabSelect sikker-kolonnen (A) . Lanes 1-4 representerer prøver fra lysates før rensing, baner 5-8 fra HSA-rensing (første trinn) og stier 9-12 fra MabSelect Jada renselse (andre trinn). Prøver er lagt i følgende rekkefølge: ABDz1-141377, ABDz1-HT875, ABDz1-HT2375 og ABDz1. I tillegg ble prøvene kjøpt fra samme lysates renset i motsatt rekkefølge på samme kolonnene analysert (B). Lanes 1-3 representerer prøver fra lysates før rensing, baner 4-6 from MabSelect sikker rensing (første trinn) og stier 7-9 fra HSA-rensing (andre trinn). Prøvene ble lagt i samme rekkefølge som i (A), men koden i seg selv er ikke inkludert. Fra disse resultatene er det klart at denne to-trinns metode gir høyt rensede proteiner uavhengig av i hvilken rekkefølge trinnene er anvendt.
| Navn b | Target protein Uniprot c | Molecular vekt (kDa) | Løselighet Klasse D | Molekylvekt av fusjon produkt (kDa) | Isoelektrisk punkt av fusjon produktet |
| 141377 | B7Z315 | 17,4 | 4 | 23,7 | 8.5 |
| HT875 | P01040 | 10,8 | 3 | 17,1 | 4.9 |
| HT2375 | P00740 | 8.9 | 5 | 15,2 | 6.8 |
- Molekylvekt ABDz1 tag alene er 6.3 kDa, isoelektrisk punkt 6.7.
- Target protein representerer en del av Uniprot protein.
- http://www.uniprot.org .
- Løselighet klasse av protein fragment med N-terminal Hans seks ABP 10.
Tabell 1. Target proteiner og fusion produkter med ABDz1 tag en evaluert i et bevis på prinsipp studien.
Tre unike menneskelige proteiner med forskjellig molekylvekt, løselighet og isoelektrisk punkt ble valgt for uttrykk og rensing av ortogonale affinitet tilnærming.
Discussion
Den ortogonale affinitet rensing protokoll som presenteres her muliggjør effektiv rensing av et bredt spekter av target proteiner. Ved å kombinere den iboende binding stedet av albumin-bindende domene med en roman bindende overflate, var en liten bispecific protein tag utviklet. Det er veldig enkelt å benytte koden siden det kan rett og slett være klones og uttrykkes i fusjon til ethvert protein av interesse i en foretrukket uttrykk vektor. Standard utstyr tilgjengelig i de fleste laboratorier kan være ansatt for to-trinns protein rensing. Siden funksjonen til ABDz1 tag avhenger riktig folding av domenet effektivt eksponere sine to bindende flater, er metoden begrenset til proteiner uttrykt i løselig form og ikke egnet for renselser henhold denaturing forhold. Redusere midler bør også unngås fordi de forstyrre bindingen av ABDz1 til Z-domenet på MabSelect Jada matrisen.
Ortogonale affinitet purificasjon gir et nyttig alternativ til tradisjonelle metoder for å tilfredsstille kravene i svært renset proteiner i mange krevende applikasjoner. Samtidig, eliminerer denne metoden behovet for kombinatorisk tagging når ulike rensing strategier benyttes på rad. For applikasjoner som krever en innfødt mål protein, kan en protease cleavage området være innført for å gjøre enzymatisk fjerning av ABDz1 tag mulig 11. Videre er ABDz1 tag første bispecific små og foldet protein domenenavn beskrevet hittil. Det er unikt fordi det gir en renselse strategi som avhenger av to målrette bestemte affinitet interaksjoner. I fremtiden ville det være interessant å utvide dette konseptet ved å utvikle nye bispecific koder som bærer nye forpliktende overflater som er kompatible med lett tilgjengelig og billig kromatografisk harpiks. For eksempel, ved å erstatte aminosyrer involvert i albumin binding med grunnleggende rester, en tag kompatibel med ipå utveksling kromatografi kan være oppnåelig. Et lignende konsept har vist seg effektiv ved belaste prosjektering av Z-domene til å generere kodene kjent som Z syre 12 og Z grunnleggende 13 kompatibel med anion-og kationebytter, henholdsvis.
Disclosures
Ingen interessekonflikter erklært.
Acknowledgments
Dette prosjektet ble finansiert av Knut og Alice Wallenberg Foundation og det svenske Forskningsrådet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| E. coli RR1ΔM15 | American Type Culture Collection | 35102 | |
| E. coli Rosetta (DE3) | Novagen, EMD Millipore | 70954 | |
| Tryptic soy broth | Difco Laboratories | 211822 | |
| Yeast extract | Difco Laboratories | 212720 | |
| Vibra cell sonicator | Sonics and Materials, Inc. | - | |
| HSA Sepharose | Pharmacia Corporation (Pfizer) | Former product | |
| HiTrap MabSelect SuRe | GE Healthcare | 11-0034-93 | |
| HiTrap NHS-activated HP column | GE Healthcare | 17-0716-01 |
References
- Waugh, D. S. Making the most of affinity tags. Trends Biotechnol. 23, 316-320 (2005).
- Hedhammar, M. Protein engineering strategies for selective protein purification. CET. 28, 1315-1325 (2005).
- Porath, J. Metal chelate affinity chromatography, a new approach to protein fractionation. Nature. 258, 206-213 (1975).
- Linhult, M. Mutational analysis of the interaction between albumin-binding domain from streptococcal protein G and human serum albumin. Protein Sci. 11, 206-213 (2002).
- Nilsson, B. A synthetic IgG-binding domain based on staphylococcal protein. A. Protein Eng. 1, 107-113 (1987).
- Alm, T. A small bispecific protein selected for orthogonal affinity purification. Biotechnol. J. 5, 605-617 (2010).
- Nilsson, J. Multiple affinity domains for the detection, purification and immobilization of recombinant proteins. J. Mol. Recognit. 9, 585-594 (1996).
- Rüther, U. pUR 250 allows rapid chemical sequencing of both DNA strands of its inserts. Nucleic Acids Res. 10, 5765-5772 (1982).
- Kraulis, P. J. The serum albumin-binding domain of streptococcal protein G is a three-helical bundle: a heteronuclear NMR study. FEBS Lett. 378, 190-194 (1996).
- Hedhammar, M. Novel flow cytometry-based method for analysis of expression levels in E coli giving information about precipitated and soluble protein. J. Biotechnol. 119, 133-146 (2005).
- Carter, P. Site-specific proteolysis of fusion proteins. ACS Sympos. Ser. 427, 181-193 (1990).
- Hedhammar, M. Negatively charged purification tags for selective anion-exchange recovery. PEDS. 17, 779-786 (2004).
- Gräslund, T. Charge engineering of a protein domain to allow efficient ion-exchange recovery. Protein Eng. 13, 703-709 (2000).
