Summary
Роман и высокоэффективной двухступенчатой аффинной хроматографии протокол был разработан и описан в деталях. Метод основан на небольшом теги очистки с двумя присущими сходства и применима к широкому спектру целевых белков с различными свойствами.
Abstract
Из-за высоких затрат, связанных с очисткой рекомбинантных белков протоколов должна стать рациональной. Для высокой пропускной усилий есть спрос на общие методы, которые не требуют целевого белка конкретных оптимизации 1. Чтобы достичь этого, очистка тегов, которые генетически могут быть приварены к интересующего гена обычно используются 2. Наиболее широко используется сходство ручка гекса-гистидин тег, который подходит для очистки под своей страны и денатурирующих условиях 3. Метаболических бременем для производства тег низкий, но он не обеспечивает как высокую специфичность как конкурирующие аффинной хроматографии основан 1,2 стратегий.
Здесь биспецифичные теги очистки с двумя различными сайтами связывания на 46 аминокислот, белков малой области была разработана. Альбумин-связывающий домен происходит от стрептококковых G белка и имеет сильное сродство к присущей сывороточного альбумина человека(HSA). Одиннадцать поверхности, подвергшихся воздействию аминокислот, не участвующих в альбуминсвязывающего 4, были генетически рандомизированных для получения комбинаторных библиотек. Белка библиотека с новым хаотически расположенных обязательными поверхности (рис. 1) была выражена фаговых частиц для облегчения выбора связующих по технологии отображения фага. Через несколько раундов против biopanning димерных Z-домен, полученный по Стафилококковый белок 5, маленький, биспецифичные молекулы с сродством к ЧСА как и роман цель была определена 6.
Домена новый белок, называемый ABDz1, была оценена как очистка тегов для выбора целевых белков с различными молекулярными массами, растворимость и изоэлектрической точке. Три белки мишени, выраженная в кишечной Escherishia с романом теги слит с их N-концы, а затем аффинной очисткой. Первоначальные очистки на любой колонке с иммобилизованными HSA или Z-домен в результате отношений ТипыВели чистые продукты. Двухступенчатая аффинной очистки с биспецифичные теги привели к существенному улучшению белка чистоты. Хроматографические сред с Z-домен иммобилизованные, например MabSelect Конечно, легко доступны для очистки антител и HSA может легко быть химически связаны с СМИ, чтобы обеспечить второй матрицы.
Этот метод особенно выгодно, когда есть высокий спрос на чистоту восстановленного белка-мишени. Bifunctionality из тегов позволяет два различных хроматографических стадий, которые будут использоваться в то время как метаболическая нагрузка на хост выражение ограничено из-за небольшого размера тега. Она обеспечивает конкурентоспособную альтернативу так называемой комбинаторной пометки, где несколько тегов используются в сочетании 1,7.
Protocol
1. Клонирование целевой gene/ABDz1-tagged слияние построить
- Подготовка ПЦР фрагментов гена ABDz1 окружении подходящие сайты рестрикции для N-терминал лигирования гена-мишени в выражении плазмиды (плазмиды, содержащей ABDz1 находится в свободном доступе через соглашения о передаче материала).
- Клив очищенной вектор экспрессии и ПЦР-фрагменты с выбрана ферментов рестрикции в подходящем буфере реакции. Purify продукты перед перевязкой.
- Лигировать ограничено ABDz1 фрагмента в вектор экспрессии, содержащего ген интереса и трансформировать перевязка продукта Е. палочка (в оригинальный метод RR1ΔM15 штамм был использован 8). Распространение трансформированных клеток на агар пластин дополнена подходящими антибиотиками для выбора.
- ПЦР экране несколько колоний и последовательность проверки полученного выражения кассеты секвенирования ДНК.
- Подготовка плазмиды из ночной культуры последовательности verifСВУ колонии и перейдем к предпочтительным штамм выражение (в оригинальный метод кишечная палочка Rosetta (DE3), хостинг pRARE плазмиды для улучшения производства белков, кодируемых генами человека, были использованы).
2. Экспрессии белка
- Привить одну бактериальную колонию в 10 мл бульона триптического соевого с добавлением 5 г / л дрожжевого экстракта и соответствующих антибиотиков. Инкубируйте при 150 оборотов в минуту при температуре 37 ° С в течение ночи.
- Привить 1 мл ночной культуры в 100 мл свежей среды и вызывают экспрессию белка (первоначально 1 мМ изопропил-β-D-thiogalactoside когда лак оперона была использована), когда клетки достигают логарифмической фазе роста.
- Инкубируйте при 150 оборотов в минуту при 25 ° С в течение ночи и уборки клетки центрифугированием.
3. Ортогональные очистки сродством
- Ресуспендируют гранул в 25 мл работает буфера (25 мМ Трис-HCl, 200 мМ NaCl, 1 мМ ЭДТА, 0,05% (вес / объем) Твин-20, рН 8,0) и разрушают йэлектронной клетки ультразвуком при 60% амплитуды и 1.0/1.0 импульсов в течение 3 мин. Центрифуга образца и фильтр целевой белок, содержащий супернатант (0,45 мкм) перед дальнейшей очистки.
- Уравновешиваться либо 1 мл HSA Sepharose колонки или NHS-активированной колонки, ранее в сочетании с ЧСА в соответствии с рекомендациями поставщика, по 10 столбцов объема (CV) ведения буфером на 1 мл / мин на подходящей системы очистки белков. Нагрузка бактериальный лизат на 0,5 мл / мин, а затем сбросить скорость потока до 1 мл / мин.
- Вымойте колонки с 5 CV ведения буфера затем 5 CV стиральных буфера (5 мМ NH 4 Ac, рН 5,5).
- Элюирования образца с элюции буфера (0,5 М НАс, рН 2,5) на 1 мл / мин и собирают фракции, контролировать поглощения при 280 нм, чтобы выбрать из фракции элюировали пик для дальнейшей очистки.
- Бассейн фракций с высокой концентрацией белка, развести два раза Конечно работает буфера (20 мМ фосфата, 150 мМ NaCl, рН 7,2) иубедитесь, что рН составляет около нейтральной. Добавьте 1 М Трис-HCl рН от 8 до увеличения рН, если необходимо.
- Нагрузка образца при 0,5 мл / мин на 1 мл HiTrap MabSelect Конечно столбец, который был уравновешенную 10 CV верных работает буфер в 1 мл / мин. Сброс скорости потока до 1 мл / мин после загрузки.
- Вымойте колонки с 5 CV верных буфер работает (шаг 5) и элюируются белков с 0,2 М НАс, рН 2,7. Для чувствительных белков целевой элюата может быть нейтрализована непосредственно на коллекции путем добавления Трис-HCl.
Если хроматографических стадий поменялись местами элюата из MabSelect Конечно, колонка может быть разведен в управлении буфер (шаг 3,1) и рН увеличилось примерно до 8 добавлением 1 М Трис-HCl. В целом, более узкие пики наблюдаются при Конечно матрица используется на втором этапе.
4. Оценка чистоты додецилсульфата натрия полиакриламидном геле (SDS-PAGE)
- Нагрузка на очищенные фракциисокращение SDS-PAGE и, при желании, анализировать молекулярный вес очищенный продукт масс-спектрометрии. Важно в полной мере уменьшить образца с свободных цистеина в ABDz1 может привести к димеризации продукт, не связанных с восстановительными условиями.
5. Представитель Результаты:
Как доказательство принципа, ортогональные очистки близость способствует теги ABDz1 была оценена на три человеческие белки цель, представляющих различные классы разрешимости, молекулярный вес и изоэлектрической точки (табл. 1). Ген ABDz1 был слит с генетически генов-мишеней и конструкции были выражены в E.coli, Рисунок 2 показывает схему для всех шагов в методе последовательно. После очистки ортогональных протокол, взятых в различных точках были проанализированы SDS-PAGE (рис. 3). Результаты ясно показывают, полезность двойную метку и две очень конкретные шаги очистки. Хотя разумные чистоты переменного токаhieved после начальной стадии очистки, как видно из гелей, последующий шаг дает очень чистый продукт хорошо подходит для очень требовательных приложений.
Рисунок 1. Дизайн комбинаторная библиотека, используемая для выбора биспецифичные ABDz1 тега.
46 аминокислот белка-связывающий домен складки в стабильной три спирали пучок и она содержит сайт связывания сывороточного альбумина человека в основном расположены на второй спирали. По генетически случайной одиннадцать поверхность подвергается аминокислот находится в первой и третьей спирали, роман обязательными поверхность была спроектирована. Одиннадцать Должности указаны на рисунке и пронумерованы в соответствии с Kraulis и соавт. 9. После biopanning против димера Z-область Стафилококковый белка с комбинаторной библиотеки, выраженные на фаг, биспецифичные ABDz1 молекулы выявлено не было.
ПЦР-фрагмент, содержащий последовательность ABDz1 лигируют (N-конца) с интересующего гена в подходящий вектор экспрессии. Перевязка продукта трансформируется в E. палочка для проверки последовательности и плазмидной ДНК. После перехода к выражению хозяина, крупномасштабные культуры рекомбинантного белка выражение установлена в пределах от начальной ночной культуры. Бактерии собирают центрифугированием и лизировали с помощью ультразвука для получения бактериального лизата содержащие целевого белка. После фильтрации шаг для удаления остатков твердых частиц, лизат подвергается очистке ортогональных близости от системы жидкостного обработки, подвергаясь две стадии очистки подряд. Элюировали пики с обеих стадий очистки отбираются и оцениваются SDS-PAGE для оценки чистоты и по сравнению с тон лизат перед очисткой.
Рисунок 3. SDS-PAGE анализа белков-мишеней выражается и очищается в слиянии с ABDz1.
Образцы, взятые от бактериальных лизат из трех белков выражается в слиянии с ABDz1, представляющих различные свойства и ABDz1 сам тег были собраны вместе с образцами из соответствующих пиков от очистки на HSA-столбца, после которого MabSelect Sure-столбец () . Дорожки 1-4 представляют собой образцы из лизатов до очистки, полосы 5-8 из HSA-очистки (первая ступень) и переулков 9-12 из MabSelect Конечно очистки (вторая ступень). Образцы загружаются в следующем порядке: ABDz1-141377, ABDz1-HT875, ABDz1-HT2375 и ABDz1. Кроме того, образцы, приобретенные у же лизатов очищенных в обратном порядке на том же колонны были проанализированы (B). Дорожки 1-3 представляют собой образцы из лизатов до очистки, переулков 4-6 ером MabSelect Конечно очистки (первая ступень) и переулков 7-9 из HSA-очистки (вторая ступень). Образцы были загружены в том же порядке, как в (), но сам тег не входит. Из этих результатов ясно, что этот двухступенчатый метод дает высокоочищенные белки, независимо от порядка, в котором шаги применяются.
| Имя б | Белка-мишени Uniprot с | Молекулярный вес (кДа) | Растворимость Класс D | Молекулярный вес плавления продукта (кДа) | Изоэлектрическая точка плавления продукта |
| 141377 | B7Z315 | 17,4 | 4 | 23,7 | 8,5 |
| HT875 | P01040 | 10,8 | 3 | 17,1 | 4,9 |
| HT2375 | P00740 | 8,9 | 5 | 15,2 | 6,8 |
- Молекулярный вес ABDz1 теги только на 6,3 кДа, изоэлектрической точке 6.7.
- Целевой белок представляет собой часть белка Uniprot.
- http://www.uniprot.org .
- Растворимость класс белков фрагмента с N-терминал Его 6 ABP 10.
Таблица 1. Целевая белков и продуктов синтеза с ABDz1 теги оценивается в доказательство принципа исследования.
Три уникальных белков человека с различной молекулярной массы, растворимость и изоэлектрической точки были выбраны для выражения и очистки ортогональных подход близости.
Discussion
Ортогональных протокол очистки близость, представленные здесь позволяет эффективно очистки широкого спектра белков-мишеней. Сочетая присущие сайт связывания альбумин-связывающий домен с новым обязательным поверхности, небольшие биспецифичные теги белков была разработана. Это очень просто использовать тег, поскольку она может быть просто клонировали и выражается в слиянии с какой-либо белок в любой предпочтительный вектор экспрессии. Стандартное оборудование, имеющееся в большинстве лабораторий могут быть использованы для двухступенчатой очистки белков. С функцией теги ABDz1 зависит от правильного сворачивания домена эффективно разоблачать его двумя обязательными поверхностей, метод ограничен с белками выражено в растворимой форме и не подходят для очищения в денатурирующих условиях. Восстановители также следует избегать, так как они мешают связывание ABDz1 к Z-область на MabSelect Конечно матрицы.
Ортогональные близость очисткойТион обеспечивает полезная альтернатива традиционным методам для того, чтобы удовлетворять требованиям высокой степени очистки белков во многих требовательных приложений. В то же время, этот метод устраняет необходимость в комбинаторной пометки, когда различные стратегии очистки используются по очереди. Для применений, требующих родной белка-мишени, сайт протеазы расщепления могут быть введены для визуализации ферментативного удаления ABDz1 теги возможных 11. Кроме того, теги ABDz1 является первым биспецифичные малого и сложенными белка домена описанных на сегодняшний день. Она уникальна, поскольку она обеспечивает очистку стратегию, которая зависит от двух целевых специфических взаимодействий близости. В будущем было бы интересно расширить эту концепцию разработки новых биспецифичные теги, которые несут новую привязку поверхности, которые совместимы с доступными и недорогими хроматографических смол. Например, путем замены аминокислот, участвующих в связывании с альбумином основных остатков, теги совместимы с япо обменной хроматографии может быть достижимо. Аналогичная концепция была доказана эффективность заряда техники Z-домен для создания тегов известная как Z кислоты 12 и Z 13 основных совместимы с анион-и катион обмена, соответственно.
Disclosures
Нет конфликта интересов объявлены.
Acknowledgments
Этот проект был профинансирован Кнут и Алиса Валленберга фонда и Шведского исследовательского совета.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| E. coli RR1ΔM15 | American Type Culture Collection | 35102 | |
| E. coli Rosetta (DE3) | Novagen, EMD Millipore | 70954 | |
| Tryptic soy broth | Difco Laboratories | 211822 | |
| Yeast extract | Difco Laboratories | 212720 | |
| Vibra cell sonicator | Sonics and Materials, Inc. | - | |
| HSA Sepharose | Pharmacia Corporation (Pfizer) | Former product | |
| HiTrap MabSelect SuRe | GE Healthcare | 11-0034-93 | |
| HiTrap NHS-activated HP column | GE Healthcare | 17-0716-01 |
References
- Waugh, D. S. Making the most of affinity tags. Trends Biotechnol. 23, 316-320 (2005).
- Hedhammar, M. Protein engineering strategies for selective protein purification. CET. 28, 1315-1325 (2005).
- Porath, J. Metal chelate affinity chromatography, a new approach to protein fractionation. Nature. 258, 206-213 (1975).
- Linhult, M. Mutational analysis of the interaction between albumin-binding domain from streptococcal protein G and human serum albumin. Protein Sci. 11, 206-213 (2002).
- Nilsson, B. A synthetic IgG-binding domain based on staphylococcal protein. A. Protein Eng. 1, 107-113 (1987).
- Alm, T. A small bispecific protein selected for orthogonal affinity purification. Biotechnol. J. 5, 605-617 (2010).
- Nilsson, J. Multiple affinity domains for the detection, purification and immobilization of recombinant proteins. J. Mol. Recognit. 9, 585-594 (1996).
- Rüther, U. pUR 250 allows rapid chemical sequencing of both DNA strands of its inserts. Nucleic Acids Res. 10, 5765-5772 (1982).
- Kraulis, P. J. The serum albumin-binding domain of streptococcal protein G is a three-helical bundle: a heteronuclear NMR study. FEBS Lett. 378, 190-194 (1996).
- Hedhammar, M. Novel flow cytometry-based method for analysis of expression levels in E coli giving information about precipitated and soluble protein. J. Biotechnol. 119, 133-146 (2005).
- Carter, P. Site-specific proteolysis of fusion proteins. ACS Sympos. Ser. 427, 181-193 (1990).
- Hedhammar, M. Negatively charged purification tags for selective anion-exchange recovery. PEDS. 17, 779-786 (2004).
- Gräslund, T. Charge engineering of a protein domain to allow efficient ion-exchange recovery. Protein Eng. 13, 703-709 (2000).
