Summary
हम tracers पहुंचाने के लिए एक व्यावहारिक मार्गदर्शन प्रदान
Abstract
तंत्रिका सर्किट कार्यात्मक स्थलाकृतिक नक्शे में आयोजित कर रहे हैं. आदेश में जटिल सर्किट वास्तुकला कल्पना करने के लिए हम एक दृष्टिकोण विकसित करने के लिए मज़बूती से एकाधिक स्थलाकृतिक अनुमानों की वैश्विक patterning लेबल. सेरिबैलम तंत्रिका सर्किट के अर्दली व्यवस्था का अध्ययन करने के लिए एक आदर्श मॉडल है. उदाहरण के लिए, spinocerebellar कोईदार फाइबर के पूरक संगठन कोईदार फाइबर patterning के अध्ययन के लिए एक अनिवार्य प्रणाली साबित हो गया है. हमने हाल ही में पता चला है कि गेहूं रोगाणु (WGA) agglutinin Alexa 555 और 488 को संयुग्मित विकासशील और वयस्क चूहे में spinocerebellar कोईदार फाइबर अनुमानों अनुरेखण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है कि (Reeber एट अल.) 2011. हम तीन प्रमुख गुण है कि तंत्रिका अनुमानों लेबलिंग के लिए WGA Alexa tracers वांछनीय उपकरण बनाने पाया. सबसे पहले, Alexa fluorophores तीव्र होते हैं और उनकी चमक अनुरेखण के बाद सीधे wholemount इमेजिंग के लिए अनुमति देता है. दूसरा, WGA Alexa tracers के विकास और वयस्क तंत्रिका projectio के पूरे प्रक्षेपवक्र लेबलएनएस. तीसरा, WGA - Alexa tracers तेजी से दोनों प्रतिगामी और अग्रगामी दिशाओं में ले जाया जाता है. यहाँ, हम विस्तार से वर्णन कैसे tracers और अन्य आवश्यक उपकरण, कैसे spinocerebellar अनुरेखण के लिए सर्जरी प्रदर्शन करने के लिए और तीन आयामों में छवि का पता लगाया अनुमानों के लिए सबसे अच्छा कैसे तैयार करने के लिए. संक्षेप में, हम एक कदम-by-कदम अनुरेखण प्रोटोकॉल है कि संगठन और सेरिबैलम में न केवल लेकिन प्रांतस्था, brainstem और रीढ़ की हड्डी में भी कार्यात्मक नक्शे के कनेक्टिविटी का गूढ़ रहस्य के लिए उपयोगी हो जाएगा प्रदान करते हैं.
Protocol
1. Vivo में tracers बाँझ सर्जरी का उपयोग कर वितरित (1.1-1.16 अनुभाग)
हम प्रक्रिया के दौरान सलाह है कि मानक बाँझ शल्य चिकित्सा तकनीक का इस्तेमाल किया जा. यह बाँझ दस्ताने, गाउन, और facemask का उपयोग शामिल है. उपकरण उपयोग करने से पहले या तो autoclaved जाना चाहिए या तो पानी और इथेनॉल के साथ अच्छी तरह से साफ. शल्य चिकित्सा के दौरान, और विशेष रूप से के बीच जानवरों, और उपकरणों के साथ एक गर्म मनका अजीवाणु बनानेवाला पदार्थ (steri 250 # बिल्ली 18000-45, ललित विज्ञान उपकरण) शुष्क बाँझ उपकरणों बंद स्वच्छ ऊतक टुकड़े. इसके अलावा, यह महत्वपूर्ण है कि आप अपने काम की जगह ऐसी है कि आप जानवरों की तैयारी (हजामत बनाने का काम आदि), सर्जरी, और एक वसूली क्षेत्र है जहां जानवर आसानी से हो सकता है, निगरानी कर सकते हैं गर्म, और दर्दनाशक दवाओं के रूप में की जरूरत के साथ की आपूर्ति के लिए नामित क्षेत्रों संगठित है. सफल अस्तित्व सर्जरी करने के लिए महत्वपूर्ण संक्रमण के जोखिम को कम करने और बनाए रखने के एक आक्रामक देखभाल पोस्ट ऑपरेटिव रणनीति है. कृपया टेबल जहाँ आप फिन कर सकते हैं देखेंघ सभी आवश्यक उपकरण और इस प्रोटोकॉल के लिए अभिकर्मकों.
- 0.2ml/10grams शरीर के वजन की एक खुराक के साथ एक intraperitoneal इंजेक्शन (आईपी) के माध्यम से, हौसले से तैयार AVERTIN (कैट T48402 # 2,2,2-Tribromoethanol सिग्मा, सेंट लुइस MO) के साथ वयस्क चूहों anesthetize. Isoflurane / या ketamine xylazine जैसे अन्य anesthetics समान रूप से प्रभावी हैं, लेकिन सुनिश्चित करें कि आपके प्रयोगशाला में प्रयोग करने से पहले आवश्यक संस्थागत और संघीय अनुमोदन किया है. यदि आप पिल्ले (P0 - P10) का उपयोग कर रहे हैं आप उन्हें 10-15 मिनट के लिए कुचल बर्फ पर anesthetize कर सकते हैं. सुनिश्चित करें कि प्रत्येक पिल्ला की त्वचा बर्फ है (उदाहरण के लिए, वनस्पतिक दूध दस्ताने की उंगलियों में उन्हें रखने के द्वारा) के साथ सीधे संपर्क में ठंडे पानी के रूप में जल्दी हाइपोथर्मिया का एक घातक स्तर प्रेरित नहीं है. पुष्टि करें कि जानवर जानवरों हिंद पंजे को संदंश या उंगलियों के साथ एक पैर के अंगूठे चुटकी प्रदर्शन से संज्ञाहरण के एक स्वीकार्य मैदान के अधीन है. यदि वहाँ एक पेडल पलटा हुआ है, रुको जब तक कि जानवर एक गहरी के एक संकेत के रूप में इस उत्तेजना को अनुत्तरदायी हैसंज्ञाहरण के सादे.
- एक बार जानवर पूरी तरह से anesthetized है इसकी पृष्ठीय पक्ष के साथ उसके सिर तुम और अपने आप की ओर का सामना करना पड़ पूंछ से दूर का सामना करना पड़ के साथ एक बाँझ धुंध पैड पर रखना. बाल कतरनी के साथ फर दाढ़ी के क्रम में अपने आप को एक स्पष्ट शल्य चिकित्सा क्षेत्र है कि काफी विस्तृत केंद्रीय तंत्रिका तंत्र के लिए पहुँच प्राप्त है दे. शराब पोंछे के दो सेट है, तो 70% शराब / betadine के साथ मुंडा क्षेत्र पोछो, और फिर शराब पोंछे के साथ एक बार और साफ. बाहर परिपत्र पैटर्न के लिए एक अंदर का प्रयोग करें जब शल्य चिकित्सा के क्षेत्र की सफाई. आप स्पष्ट रूप से एक बाँझ धुंध पैड में एक छोटे से छेद में कटौती और अपने मुंडा और साफ शल्य साइट पर खोलने रखने के द्वारा अपने शल्य चिकित्सा क्षेत्र हदबंदी करना चुन सकते हैं. हालांकि बाँझ शल्य चिकित्सा क्षेत्र को बनाए रखने मुश्किल हो सकता है जब छोटे जानवरों पर परिचालन, ऐसा करने से संक्रमण के जोखिम को कम करने में मदद करेगा कर सकते हैं.
- संदंश का उपयोग त्वचा को लिफ्ट और कम वक्ष ऊपरी काठ आर सीधे ऊपर midline पर कैंची के साथ एक चीरा बनानेegion. कम वक्ष क्षेत्र ऊपरी काठ का क्षेत्र कशेरुकाओं के साथ अपनी उंगली चलाने कशेरुका स्तंभ (छवि 1) में एक कूबड़ के लिए लग रहा है द्वारा पहचाना जा सकता है.
- प्रावरणी और सतही रीढ़ की मांसपेशियों को काटें. यदि आवश्यक हो, रक्त वाहिकाओं (; बिल्ली 18000-00 # ललित विज्ञान उपकरण, फोस्टर शहर, सीए) cauterizing द्वारा किसी भी खून बह रहा बंद करो. पिल्ले में, कपास swabs के साथ चीरा चारों ओर कोमल दबाव लागू करने के रक्तस्राव को रोकने के के लिए पर्याप्त है.
- वक्ष कम एक या दो क्षेत्रों के spinous प्रक्रियाओं को हटाने के द्वारा एक पृष्ठीय laminectomy प्रदर्शन - ऊपरी काठ का रीढ़ की हड्डी के बाद जोड़ प्रक्रिया और पृष्ठीय spinous प्रक्रिया के बीच कशेरुका स्तंभ से रास्ते के मध्य में, दोनों पक्षों पर लामिना काटने (2 छवि) . अपनी कैंची के साथ रीढ़ की हड्डी को नुकसान नहीं है और हमेशा छोटी हड्डी के टुकड़े दूर के रूप में वे रीढ़ की हड्डी की चीर - फाड़ करना सकता है सावधान रहो. नोट करें कि जल्दी प्रसव के बाद पिल्ले में कशेरुका स्तंभ पूरी तरह से ossified नहीं है, जिसका अर्थ है कि हड्डियों बहुत हैंमुलायम और बहुत आसानी से काटा जा सकता है है. इसलिए, के लिए कटौती नहीं भी गहरी के रूप में आप रीढ़ की हड्डी को नुकसान हो सकता है सावधान रहना.
- यदि आप के लिए वयस्क चूहों में एक पृष्ठीय laminectomy प्रदर्शन नहीं पसंद करते हैं, हमने पाया है कि आप कशेरुका क्षेत्रों के बीच कोमल ऊतक में कटौती के लिए किसी भी हड्डी को काटने के बिना रीढ़ की हड्डी के एक छोटे से क्षेत्र को बेनकाब कर सकते हैं. हालांकि दोनों तरीकों रीढ़ की हड्डी में प्रवेश के प्रभावी रास्ते हैं, एक पृष्ठीय laminectomy से बचने सुनिश्चित कर सकते हैं कि रीढ़ की हड्डी undamaged रहता.
- Gilmont उपकरण बिल्ली, एक micrometer सिरिंज का उपयोग ट्रेसर (0.2mL के साथ एक खींच लिया ग्लास इलेक्ट्रोड (दोहरी चरण Narishige मॉडल से 001 पीसी 10 ग्लास micropipette डांड़ी; # बिल्ली 300056, हार्वर्ड उपकरण, Holliston, एमए. Borosilicate कांच capillaries) भरें #) GS-1100 या एक बराबर वितरण तंत्र.
- जगह में micromanipulator पर कांच microelectrode और कस कम वक्ष रीढ़ की हड्डी के ऊपरी काठ का क्षेत्र में मध्य आधे रास्ते के बीच 0.1-0.5mm इलेक्ट्रोड डालनेलाइन और रीढ़ की हड्डी का पार्श्व किनारे. पशु इंजेक्शन loci की सटीक पहचान के लिए एक stereotaxic तंत्र और पशु (लघु पशु Stereotaxic साधन मॉडल 940 एक और इलेक्ट्रोड Kopf इंस्ट्रूमेंटेशन से मैनिप्युलेटर 960 मॉडल) को स्थिर करने के लिए आयोजित किया जा सकता है. वैकल्पिक रूप से, यदि आपके संवेदनाहारी शासन महत्वपूर्ण गहरी साँस लेने की वजह से आंदोलनों के बिना एक स्थिर विमान प्राप्त करने के लिए, धीरे जानवर नीचे टेप के अनुरूप किया जा सकता है है पर्याप्त होगा.
- , WGA Alexa 555; 3-5 मिनट 488 WGA Alexa (# बिल्ली W11261, Invitrogen, Carlsbad, CA के गेहूं रोगाणु agglutinin, Alexa 488 संयुग्म Fluor) के 2% समाधान के लगभग 0.5μl पर रीढ़ की हड्डी में सुई दबाव (गेहूं रोगाणु agglutinin, Alexa Fluor 555 संयुग्म, बिल्ली W32464 # Invitrogen, Carlsbad, CA के), 350 WGA - Alexa (गेहूं रोगाणु agglutinin, Alexa Fluor 350 संयुग्म, बिल्ली W11263 # Invitrogen, Carlsbad, CA के), WGA - एचआरपी (गेहूं रोगाणु agglutinin हॉर्सरैडिश peroxidase, सिग्मा, सेंट लुइस, MO बिल्ली L7017 #) या 0.5μl 10% कीBDA (dextran amine biotinylated, बिल्ली D1956 #, Invitrogen, Carlsbad, CA) फॉस्फेट में खारा (, सिग्मा, सेंट लुइस, MO, बिल्ली P4417 # पीबीएस) buffered. फाइबर की एक बड़ी संख्या लेबलिंग में tracers परिणामों के इन संस्करणों के इंजेक्शन. छोटे संस्करणों के लिए छोटे नाभिक (या व्यक्तिगत नाभिक के उप क्षेत्रों) और प्रत्येक अन्वेषक empirically देने के लिए आदर्श मात्रा का निर्धारण करना चाहिए लक्ष्यीकरण के लिए इंजेक्शन की आवश्यकता होगी. योणोगिनेसिस सटीक इंजेक्शन के लिए सटीक nanoliter प्रसव के लिए विचार किया जाना चाहिए. हम आम तौर पर 0.5% फास्ट ग्रीन (सिग्मा, सेंट लुइस, MO, F7252 # कैट) के साथ सभी ट्रेसर समाधान के पूरक करने के लिए सर्जरी के दौरान इंजेक्शन हाजिर कल्पना.
- BDA समाधान के हर 10μl खींच pipettes की दीवारों से चिपके से मिश्रण को रोकने के इंजेक्शन लगाने से पहले, हम मकई तेल की 1μl (C8267 # बिल्ली सिग्मा, सेंट लुइस, MO) जोड़ने के. यदि आप बाहर खदेड़ना पिपेट की मुसीबत ट्रेसर बाहर है, धीरे धीरे वापस लेना ऊतक में एक छोटी सी जेब तो टिप बनाने के फिर से इंजेक्शन की कोशिश.यह microelectrode टिप करने के लिए रोकना के लिए असामान्य नहीं है. ज्यादातर मामलों में जेब भी मदद करता है एक जलाशय से जो आसपास न्यूरॉन्स ट्रेसर को अवशोषित कर सकते हैं बनाने के. हमेशा ट्रेसर बेदखल करना धीरे धीरे अपने सुई के आसपास के क्षेत्र में बड़े पैमाने पर ऊतकों को नुकसान से बचने के लिए याद रखें.
- घाव क्लिप और ऊतक गोंद के साथ धीरे त्वचा बंद. वैकल्पिक रूप से, आप sutures का उपयोग करने के लिए घाव को बंद कर सकते हैं.
- नोट करें कि शल्य प्रक्रिया के अभ्यास के साथ, कम से कम इस बिंदु तक, कम से कम 20 मिनट में पूरा किया जा सकता है.
- वसूली (Vetcare कक्ष मॉडल 9.16.0 बिल्ली # हार्वर्ड उपकरण से 340,508) चैम्बर एक हीटिंग पैड (ताप पैड बिल्ली # 341241 हार्वर्ड उपकरण से.) हाइपोथर्मिया और वसूली के ऊपर गति से बचने पर जानवर रखें. वैकल्पिक रूप से, आप एक हीटिंग कक्षों के कई बनाता है और मॉडल के उपयोग कर सकते हैं. साँस लेने की दर को मॉनिटर और संकेत हैं कि जानवर को स्थानांतरित करने का प्रयास कर रहा है के लिए जाँच करें. अधिकांश जानवरों को आमतौर पर 10-15 मिनट के बाद सर्जरी के भीतर उत्तरदायी हैं.
- 555 WGA Alexa, 488 WGA - Alexa, और WGA एचआरपी तेजी से न्यूरॉन्स में ले जाया जाता है और हम है कि दोनों जल्दी प्रसव के बाद और वयस्क चूहे में Alexa संयुग्म tracers मजबूती के साथ 24 घंटे के भीतर लेबल लंबे फाइबर इलाकों (Reeber एट अल. २०११) मिल गया है . WGA 350 - Alexa भी तेजी है, हालांकि अन्य Alexa रंगों की तुलना में उसकी दृश्यता उच्च गुणवत्ता और फिल्टर सेट की संवेदनशीलता पर निर्भर है पहुँचाया (नहीं दिखाया डेटा; Reeber एट अल 2011.) BDA आम तौर पर अब उत्तरजीविता बार पूरी तरह से तंत्रिका spinocerebellar अनुमानों पशुओं के लिए लगभग 11 दिनों के बाद बलिदान की आवश्यकता होगी का पूरा मानचित्रण के लिए और अनुमानों इसलिए पता लगाने के लिए की आवश्यकता है.
2. Anterogradely पता लगाया कोईदार फाइबर की जांच
- संबंधित अस्तित्व अवधि के बाद AVERTIN (या अपने पसंदीदा संवेदनाहारी) के साथ चूहों anesthetize.
- एक बार वहाँ कोई सजगता रक्त 0.1M पीबीएस (pH7.2) के साथ perfusing दिल के माध्यम से प्लावित किया जाना चाहिए रहे हैं. फिर, पीबीएस में 4% paraformaldehyde (पीएफए) के साथ पशु perfusing द्वारा ऊतकों को ठीक. क्षेत्रों आप का विश्लेषण करेगा के अलावा, यह हमेशा कैसे बड़े इंजेक्शन था पूर्वव्यापी विश्लेषण, ऊतक इलेक्ट्रोड की वजह से नुकसान की हद तक का एक संकेत के लिए इंजेक्शन साइट से ऊतक अधिग्रहण के लिए आवश्यक है, और फाइबर में संभव लेबलिंग की पहचान करने के लिए बीतने (; Mesulam, 1982, 2011 Reeber एट अल छवि 3).
- पोस्टफिक्स br4% पीएफए में 24-48 घंटे के लिए perfused चूहों से ains और फिर उन्हें बफर sucrose पीबीएस (~ 2 घंटे के लिए या कंटेनर के नीचे ऊतक डूब और फिर रात भर 30% तक या जब तक 15% में पतला समाधान में cryoprotect डूब ऊतक). ऊतक तो sucrose से निकाल दिया जाता है, धीरे से कागज तौलिए से सूखा dabbed और फिर एक ऊतक अक्टूबर युक्त मोल्ड में डूबे (इष्टतम काटना तापमान, Sakura Finetech संयुक्त राज्य अमेरिका इंक, CA). ऊतक तो एक -80 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर का उपयोग कर जमे हुए है और उसी के तापमान पर संग्रहीत तक इसके लिए तैयार काटा जा.
- एलेक्सा fluorophores लेबलिंग के बाद सीधे दिखाई दे रहे हैं और अतिरिक्त धुंधला की आवश्यकता नहीं है. इसलिए, छिड़काव के बाद WGA - Alexa पता लगाया ऊतक और कटौती किया जा सकता इमेजिंग के लिए मुहिम शुरू की है या सीधे एक wholemount तैयारी के रूप में 4% पीएफए में imaged. हम 4% में ऊतक पीएफए wholemounts में पता लगाया अनुमानों की स्थलाकृति इमेजिंग के लिए सबसे अच्छा अपवर्तक सूचकांक दिया कि इमेजिंग पाया. वर्गों के लिए, धारावाहिक 40μm मोटी coron में कटौतीcryostat पर अल वर्गों और उन्हें पीबीएस में मुक्त अस्थायी वर्गों के रूप में इकट्ठा. पीएफए की विषाक्तता को देखते सुनिश्चित करने के लिए, कि एक उचित facemask छिड़काव और इमेजिंग के दौरान पहना जाता है, अच्छी तरह हवादार इलाके रखने के लिए, और जब उपयोग में नहीं तुरंत सील कंटेनरों के लिए किसी भी पीएफए या पीएफए तय ऊतक लौटने. यह आदर्श है अगर आपके खुर्दबीन एक उपयुक्त धूआं हुड में स्थित है.
- WGA - एचआरपी लेबल फाइबर एक वर्णकोत्पादक tetramethylbenzidine (TMB) का उपयोग कर के रूप में प्रगट किया जा सकता है. हम एचआरपी धुंधला प्रोटोकॉल यहाँ वर्णन नहीं है क्योंकि यह पहले विस्तार में किया गया है (Vogel और 1994 Prittie. Sillitoe एट अल, 2010) में वर्णित
- BDA के लिए लेबल फाइबर मुक्त अस्थायी streptavidin-Cy3 में 2 घंटे के लिए ऊतक वर्गों (# +४३४३१५ Cat., Invitrogen, Carlsbad, CA के) या streptavidin-Alexa 488 या 555 (Cat. # 488 और बिल्ली के लिए S11223 Fluor सेते # S21381 के लिए. 555, Invitrogen, Carlsbad, CA), Pbs में धोने और फिर Fluoro - जेल के साथ माउंट. थपका के लिए, सेते ऊतक एबीसी प्रतिक्रिया बफर में रात में (वर्गों Cat. पी-4000, वी #ector प्रयोगशालाओं, Inc Burlingame, CA), पीबीएस में 3 बार कुल्ला और फिर थपका में 5-10 मिनट के लिए प्रतिक्रिया (0.5mg/ml, वेक्टर लेबोरेटरीज इंक Burlingame, CA) 10μl 30 एच 2 हे 2% के साथ पूरक हर 50ml थपका समाधान के लिए.
3. Immunohistochemistry
- Immunohistochemistry बाहर किया गया था के रूप में पहले वर्णित (Sillitoe एट अल 2008). , 0.1 बीच 20% और कमरे के तापमान पर 16-18 घंटे के लिए प्राथमिक एंटीबॉडी (नीचे देखें), संक्षेप में, 10% (सिग्मा, सेंट लुइस MO NGS) NGS युक्त 0.1M पीबीएस में ऊतक वर्गों सेते हैं. ऊतक वर्गों पीबीएस में तीन बार धो और फिर उन्हें माध्यमिक एंटीबॉडी में 2 घंटे की एक अधिकतम के लिए कमरे के तापमान पर (नीचे देखें) सेते हैं. ऊतक फिर से कुल्ला और immunoreactivity प्रकट रूप में नीचे वर्णित है.
- Purkinje कोशिकाओं और काई से भरा फाइबर हम मुक्त अस्थायी ऊतक डबल धुंधला के पारंपरिक तरीकों का उपयोग कर वर्गों सह लेबल के बीच संबंधों को निर्धारित करने के लिए. हम WGA Alexa 555 का इस्तेमाल कियाअनुरेखण और alexa 488 संयुग्मित विरोधी माउस गधा माध्यमिक एंटीबॉडी (Invitrogen / आण्विक जांच इंक, Carlsbad, CA) के लिए ZebrinII (डॉ. रिचर्ड Hawkes, कैलगरी, कैलगरी, कनाडा विश्वविद्यालय से तरह उपहार 1:250) का पता लगाने के लिए. ZebrinII एक माउस मोनोक्लोनल एंटीबॉडी है और खर्च हाइब्रिडोमा संस्कृति के माध्यम से सीधे इस्तेमाल किया किया था. fluorophore संयुग्मित माध्यमिक एंटीबॉडी 1:1500 की एक कमजोर पड़ने पर इस्तेमाल किया गया. धुंधला के बाद ऊतक वर्गों चार्ज गिलास स्लाइड पर घुड़सवार थे और तब Tris बफर (इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी विज्ञान, Hatfield, फिलीस्तीनी अथॉरिटी) में Fluoro जेल के साथ या Vectashield hardset के साथ coverslipped (DAPI के साथ मध्यम बढ़ते Cat. एच 1200 #, वेक्टर प्रयोगशालाओं, Burlingame ) सीए ट्रिपल रंग प्रतिदीप्ति इमेजिंग के लिए.
- हम प्राथमिक एंटीबॉडी के अभाव में ऊतक वर्गों प्रसंस्करण द्वारा माध्यमिक एंटीबॉडी की विशिष्टता का परीक्षण किया. कोई संकेत इस तरह के नियंत्रण प्रयोगों में पता चला था, यह दर्शाता है कि हम मनाया धुंधला वें से nonspecific संकेतों की वजह से नहीं थाई Alexa संयुग्मित एंटीबॉडी (नहीं दिखाया डेटा है).
4. माइक्रोस्कोपी और डेटा विश्लेषण
- हम Leica DFC360 (प्रतिदीप्ति) FX और DFC490 (थपका और TMB ऊतक वर्गों प्रतिक्रिया व्यक्त) एक Leica DM5500 खुर्दबीन पर घुड़सवार कैमरे का उपयोग ऊतक वर्गों के photomicrographs कब्जा.
- हम अधिग्रहण और ऊतक Leica अनुप्रयोग सूट और Leica अनुप्रयोग सूट FX सॉफ्टवेयर संकुल का उपयोग करने वर्गों की छवियों का विश्लेषण.
- Wholemounts के Photomicrographs Leica DFC3000 FX Leica MZ16 एफए stereomicroscope Leica अनुप्रयोग सूट FX सॉफ्टवेयर चल रहा है पर घुड़सवार कैमरे का उपयोग कर कब्जा कर रहे हैं.
- हमारे सूक्ष्मदर्शी के दोनों Leica Cy3 (मॉडल 11,600,231 #) और FITC (# मॉडल 11,513,880) फिल्टर, और एक अतिरिक्त A4 / DAPI यूवी फिल्टर (मॉडल १,१५,०४,१६२ #) के साथ DM5500 के साथ सुसज्जित हैं.
- छवियाँ / के तहत अधिक जोखिम के लिए अनुकूलन के रूप Leica सॉफ्टवेयर का उपयोग करके निर्धारित करने के बाद अधिग्रहीत कर रहे हैं. हम Adobe Photoshop CS4 में है और अगर आवश्यक w के सभी कच्चे डेटा आयातकुशाग्रता, चमक, इसके विपरीत, या केवल स्तर के लिए प्रत्येक छवि के पूरे क्षेत्र सही. अन्य फोटो संपादन सॉफ्टवेयर पसंदीदा के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है.
- यहाँ प्रस्तुत schematics Adobe Illustrator CS4 में तैयार किया गया.
- एलेक्सा 555 और Cy3 दाग न्यूरॉन्स, जो लाल रंग के रूप में पता चला रहे हैं हमारे फिल्टर का उपयोग पांडुलिपि भर प्रस्तुत छवियों में छद्म रंग मैजंटा थे.
पशु
सभी जानवरों के अध्ययन के बाहर एक अनुमोदित IACUC पशु प्रोटोकॉल के तहत मेडिसिन के अल्बर्ट आइंस्टीन कॉलेज में संस्थागत दिशा निर्देशों के अनुसार किए गए. नर और मादा outbred स्विस वेबस्टर (Taconic, Albany, NY) या जन्मजात C57BL6J (JAX, बार हार्बर, ME) चूहों हमारी कॉलोनी में बनाए रखा गया और सभी के अध्ययन के लिए इस्तेमाल किया. दिन एक योनि प्लग का पता चला गया था पर दोपहर को भ्रूण दिन 0.5 माना जाता था.
5. प्रतिनिधि परिणाम:
Spinocerebellar afferents parasagi में समाप्तसेरिबैलम में ttal बैंड (3 छवि; Voogd एट अल 1969; Grishkat और Eisenman 1995, Vogel और Prittie 1994, विग एट अल 2005; Apps और 2009 Hawkes; Sillitoe एट अल 2010;. Reeber एट अल 2011). हम WGA - Alexa tracers कम वक्ष ऊपरी काठ का रीढ़ की हड्डी में प्रदर्शित करने के लिए की हड्डी में इंजेक्शन: 1) कि इन tracers लगातार टर्मिनलों के सेरिबैलम में विशिष्ट सबसेट (3 छवि लेबल किया जा सकता है; Reeber एट अल 2011), 2). कि WGA - Alexa tracers तीव्रता उज्ज्वल है और पूरे मस्तिष्क् का पोंस तथा ऑब्लांगाटा के पीछे स्थित एवं इनसे जु्ड़ा भाग, जिसमें बीच का एक भाग् वर्मिस तथा दो पार्श्वीय खण्ड (गोलार्द्ध) होते है में कोईदार फाइबर स्थलाकृति के समग्र पैटर्न (छवि 3.; Reeber एट अल 2011) कल्पना करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है 3) है कि WGA - Alexa 488 और 555 संयोजन में इस्तेमाल किया जा सकता है एक ही जानवर (4 छवि), और 4) है कि WGA - Alexa tracers immunohistochemical धुंधला (छवि 5) के साथ संगत कर रहे हैं में कई इलाकों अनुरेखण के लिए. हम काम में हाल ही में पता चला है कि रीढ़ की हड्डी में ट्रेसर देने के बाद 6 घंटे के रूप में जल्दी के रूप में सेरिबैलम में WGA Alexa tracers लेबल टर्मिनलों और architectur अनुरेखण के लिए एक उत्कृष्ट पसंद कर रहे हैंविकासशील रास्ते (Reeber एट अल., 2011) के ए.
चित्रा 1 उपकरणों के vivo में ए. Tracers पहुंचाने हमारे शल्य चिकित्सा क्षेत्र की एक छवि बी कम वक्ष ऊपरी काठ का क्षेत्र कशेरुकाओं के साथ अपनी उंगलियों को चलाने के लिए कशेरुका स्तंभ में एक कूबड़ के लिए महसूस द्वारा पहचाना जा सकता है है के लिए सेटअप. पृष्ठीय laminectomy "कूबड़", जो पीले तीर द्वारा संकेत दिया है के बीच में मोटे तौर पर किया जाना है.
चित्रा 2 - एक कम वक्ष का चित्रण. ऊपरी लम्बर कशेरुका कम वक्ष माउस कशेरुका स्तंभ की ऊपरी लकड़ी क्षेत्र से एक अक्षुण्ण वर्टिब्रल खंड के पहले और बाद पृष्ठीय laminectomy ए योजनाबद्ध खंड एक dorsa बीएल laminectomy लामिना जोड़ प्रक्रिया और पृष्ठीय spinous प्रक्रिया के बीच रास्ते के मध्य में काटने के बाद एक या दो क्षेत्रों के कशेरुका spinous प्रक्रियाओं को हटाने के द्वारा किया जाता है.
चित्रा 3. WGA Alexa tracers तीव्रता उज्ज्वल है और उच्च संकल्प पर अभिवाही प्रक्षेपण स्थलाकृति कल्पना करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. ए योजनाबद्ध मूल और WGA Alexa की समाप्ति 555 लेबल spinocerebellar न्यूरॉन्स कम वक्ष वयस्क रीढ़ की हड्डी के ऊपरी काठ का क्षेत्र में WGA 555 - Alexa देने के बाद एक इंजेक्शन साइट बी छवि दिखाता है. सी. के Wholemount छवि पूर्वकाल कम वक्ष रीढ़ की हड्डी के ऊपरी काठ का क्षेत्र में WGA - Alexa 555 का एक इंजेक्शन निम्नलिखित lobules. डी. WGA Alexa 555 spinocerebellar पथ की अनुरेखण अग्रगामी कोईदार फाइबर के बैंड से पता चलता है के रूप में एक सह पर देखाronal ऊतक अनुभाग. lobules midline (सभी छवियों के लिए लागू होता है) के दोनों तरफ रोमन अंकों संख्या लेबल कोईदार फाइबर बैंड द्वारा परिभाषित कर रहे हैं. सलाखों के स्केल: बी, 500 सुक्ष्ममापी सी, 500 डी सुक्ष्ममापी, 200 सुक्ष्ममापी.
चित्रा 4. WGA Alexa tracers एक ही पशुओं में कई तंत्रिका रास्ते की लेबलिंग के लिए कुशल हैं. ए माउस spinocerebellar कोईदार फाइबर बैंड के समग्र पैटर्न सारांश सेरिबैलम के Wholemount योजनाबद्ध. WGA - Alexa 555 बाईं ओर एक ही खंड में काठ का रीढ़ की हड्डी और WGA-488 एलेक्सा के सही पक्ष में इंजेक्ट किया गया था बी के रूप में राज्याभिषेक ऊतक पीछे lobules के माध्यम से काट खंड पर देखा, दोनों WGA Alexa tracers सेरिबैलम ले जाया गया और सफलतापूर्वक टर्मिनल के विशिष्ट सबसेट (भी Reeber एट अल 2011.) लेबल. लघुरूप: तिलcular परत (एमएल); Purkinje सेल परत (PCL), ग्रेन्युल सेल परत (GCL), सफेद पदार्थ (WM). स्केल सलाखों: बी, 100 सुक्ष्ममापी.
चित्रा 5. WGA Alexa tracers immunohistochemistry और न्यूरॉन्स और अनुमानों के ट्रिपल लेबलिंग के लिए ऊतक विज्ञान के साथ संयोजन में इस्तेमाल किया जा सकता है. ए WGA Alexa 555 छोटि लो III में कोईदार फाइबर टर्मिनलों में जमा है बी ZebrinII धुंधला छोटि लो III में Purkinje सेल धारियों की एक सरणी का पता चलता है. सी. neuronal और glial नाभिक के DAPI धुंधला हो जाना. डी. ए, बी पैनल की छवि विलय और अभिवाही बैंड, Purkinje सेल पट्टियों, और सामान्य cytoarchitecture ट्रिपल लेबलिंग दिखा सी एह. बॉक्सिंग पैनल ई. में दिखाया क्षेत्रों के उच्च बढ़ाई छवियाँ. Purkinje सेल धारियों के रूप में पहले से वर्णित गिने जा रहे हैं (समीक्षा(Apps और Hawkes 2009)). लघुरूप, Purkinje सेल परत (PCL), ग्रेन्युल सेल परत (GCL) आणविक परत (एमएल):. सलाखों के स्केल: डी, 500 सुक्ष्ममापी (एसी के लिए), एच, 500 सुक्ष्ममापी (जैसे) के लिए .
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Discussion
हम शल्य चिकित्सा और तकनीकी सफल axonal और dendrite तेजी से विकास और वयस्क चूहे में तंत्रिका अनुमानों लेबलिंग के लिए एक उपन्यास फ्लोरोसेंट आधारित दृष्टिकोण का उपयोग कर अनुरेखण के लिए आवश्यक विवरण में वर्णित है. हम WGA - Alexa का उपयोग बताते हैं कि कैसे tracers और मार्करों के उच्च संकल्प नमूनों सर्किट स्थलाकृति का विश्लेषण करने के लिए और तीन आयामों में इस्तेमाल किया जा सकता है.
कई tracers हैजा विष सबयूनिट बी, Biocytin, Neurobiotin, बाकला leucoagglutinin (PHAL), fluororuby, fluoremerald और fluorogold सहित neuronal सर्किट अनुरेखण के लिए उपलब्ध हैं. इसके अलावा, हाल ही में आनुवंशिक और वायरल आधारित tracers दिखा दिया है कि molecularly अलग neuronal सबसेट भौगोलिक विवरण के अनुसार महान परिशुद्धता के साथ अपने लक्ष्य से जुड़े हैं. नोट करें कि हालांकि कुछ तंत्रिका tracers मुख्य रूप से या तो अग्रगामी है या प्रतिगामी दिशा (जैसे BDA 10,000 मेगावाट 3000 मेगावाट बनाम) में ले जाया जाता है, ट्रेसर अणुओं अक्सर दोनों में ले जाया जाता हैदिशाओं. हमारे अध्ययन में, हम स्थलाकृतिक प्रक्षेपण पैटर्न के विश्लेषण के लिए विश्वसनीय neuroanatomical उपकरण के रूप में WGA - Alexa आधारित tracers परिचय. हम बताते हैं कि WGA - Alexa चमकीले fluoresces है, तेजी से पहुँचाया है, और काफी बहुमुखी अनुमस्तिष्क बाण के समान डिब्बों (छवि 3) के लिए उन सहित immunohistochemical मार्कर के साथ बनती जा.
हम अन्य उपलब्ध neuroanatomical tracers की तुलना में WGA - Alexa का उपयोग करने के कई सीमाओं पाया है. BDA (1999 वू एट अल.) के विपरीत, हमें पहले पता चला है कि WGA Alexa (और WGA एचआरपी) जटिल टर्मिनल अंत (Reeber एट अल. +२०११) के पूरे आकारिकी खुलासा नहीं करता है. हालांकि, हम में सुधार संरचनात्मक जानकारी के मूल्य vesicular ग्लूटामेट ट्रांसपोर्टर 2 (VGLUT2) और कोकीन और एम्फ़ैटेमिन विनियमित प्रतिलेख (कार्ट) पेप्टाइड immunohistochemistry (Reeber एट अल 2011 के लिए immunohistochemical धुंधला के साथ अनुरेखण WGA - Alexa बाँधना द्वारा पता लगाया टर्मिनल से प्राप्त;. Reeber और Sillitoe, 2011). एकWGA Alexa की अन्य कमी यह है कि संकेत ऊतक वर्गों पर अपेक्षाकृत जल्दी मीडिया है कि फ्लोरोसेंट संकेत की रक्षा में रखा जा रहा है के बावजूद, degrades. इसलिए, हम आम तौर पर काटने के बाद तुरंत ऊतक छवि है, हालांकि काटने के 2 दिनों के भीतर इमेजिंग अभी भी अनुमति देता है लेबल फाइबर और टर्मिनलों सफलतापूर्वक हो imaged. ऊतक वर्गों के immunostaining दौरान तीव्रता खो WGA Alexa संकेत के लिए एक प्रवृत्ति है. धुंधला के दौरान कम और कम washes का उपयोग इस समस्या को कम कर सकते हैं. दूसरी सिफारिश हमेशा माउंट और छवि एक संदर्भ के लिए आसन्न वर्गों है कि immunohistochemistry के लिए कार्रवाई की जाएगी के साथ तुलना करने के लिए सेट काटने के दिन पर पता लगाया ऊतक वर्गों का एक सेट है. हमारे हाथ में अक्टूबर (ऊतक - टेक, Sakura Finetek, Torrance, CA) ऊतक ब्लॉक -80 पर रखा एम्बेडेड डिग्री सेल्सियस के बाद छिड़काव और cryoprotection ट्रेसर तीव्रता के किसी भी हानि के बिना समय की विस्तारित अवधि के लिए भंडारित किया जा सकता है है.
हमारे approaअनुरेखण फाइबर की चर्चा आसानी cortical, brainstem और रीढ़ की रास्ते में तंत्रिका नक्शे अनुरेखण के लिए अनुकूलित किया जा सकता है. हम वर्तमान में vivo इमेजिंग में आनुवंशिक रूप से संशोधित पशुओं में और चयनात्मक पथ घावों और औषधीय जोड़तोड़ के बाद सर्किट गठन की गतिशीलता के अध्ययन के लिए सर्किट गठन के लिए WGA Alexa tracers का उपयोग करने की संभावना तलाश रहे हैं. WGA Alexa tracers का तेजी से परिवहन के बाद से लघु अवधि के विश्लेषण के लिए अनुमति देता है हमारे दृष्टिकोण गतिशील परिवर्तन है कि स्थलाकृतिक सर्किट के संरचनात्मक plasticity के दौरान होने का खुलासा करने के लिए क्षमता है.
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Disclosures
ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.
Acknowledgments
यह काम Yeshiva विश्वविद्यालय के मेडिसिन के अल्बर्ट आइंस्टीन कॉलेज से शुरू - धन नए RVS के लिए अन्वेषक द्वारा समर्थित किया गया था.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bead sterilizer | Fine Science Tools | Model Steri 250 Cat. # 18000-45 | |
| Cauterizer | Fine Science Tools | Cat. # 18000-00 | |
| Borosilicate glass capillaries | Harvard Apparatus | Cat. # 300056 | |
| Dual stage Glass Micropipette Puller | Narishige International | Model 001-PC-10 | |
| Micrometer syringe | Gilmont Instruments | Cat. # GS-1100 | |
| Small Animal Stereotaxic Instrument | Kopf Instruments | Model 940-A | |
| Electrode Manipulator | Kopf Instruments | Model 960 | |
| Vetcare chamber | Harvard Apparatus | Cat. # 340508 | |
| Heating Pad | Harvard Apparatus | Cat. # 341241 | |
| Leica DFC360 FX camera | Leica Microsystems | DFC360 FX | |
| Leica DFC490 camera | Leica Microsystems | DFC490 | |
| Leica DM5500 microscope | Leica Microsystems | DM5500 | |
| Leica DFC3000 FX camera | Leica Microsystems | DFC3000 FX | |
| Leica MZ16 FA microscope | Leica Microsystems | MZ16 FA | |
| CY3 Filter | Leica Microsystems | Model # 11600231 | |
| FITC Filter | Leica Microsystems | Model # 11513880 | |
| A4 DAPI/UV filter | Leica Microsystems | Model # 11504162 | |
| Wheat germ agglutinin, Alexa Fluor 488 conjugate | Invitrogen | Cat. #W11261 | |
| Wheat germ agglutinin, Alexa Fluor 555 conjugate | Invitrogen | Cat. #W32464 |
References
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