Summary
Biz teslim izleyiciler için pratik bir rehber
Abstract
Nöral devrelerin fonksiyonel topoğrafik haritalar halinde düzenlenmiştir. Karmaşık devre mimarisi görselleştirmek için, güvenilir bir şekilde birden fazla topografik projeksiyonlar küresel desenlendirme etiket bir yaklaşım geliştirdi. Beyincik nöral devrelerin düzenli düzenlemeyi incelemek için ideal bir model. Örneğin, spinoserebellar yosun tutmuş liflerinin bölmeli örgütü yosun tutmuş fiber desenlendirme eğitim için vazgeçilmez bir sistem olduğu kanıtlanmıştır. Yakın zamanda 555 ve 488 Alexa konjuge buğday tohumu agglutinin (WGA), gelişmekte olan ve erişkin farelerde spinoserebellar yosun tutmuş lif projeksiyonları izleme için kullanılabilir gösterdi (Reeber ark 2011). Biz sinir projeksiyonları etiketleme yapmak için WGA-Alexa tracerlerin arzu araçları üç ana özellikleri bulundu. İlk olarak, Alexa fluorophores yoğun ve parlaklık doğrudan izleme sonra wholemount görüntüleme için izin verir. İkincisi, WGA-Alexa tracerlerin geliştirilmesi ve yetişkin nöral projectio tüm yörünge etiketins. Üçüncüsü, WGA-Alexa izleyiciler, retrograd ve anterograd her iki yönde hızla taşınır. Burada, biz izleyiciler ve diğer gerekli araçlar, spinoserebellar izleme için ameliyat gerçekleştirmek için nasıl ve ne kadar iyi takip projeksiyonları üç boyutlu görüntü nasıl hazırlanacağını detaylı olarak açıklanmaktadır. Özet olarak, biz sadece beyincik değil, aynı zamanda, korteks, beyin sapı ve omurilik fonksiyonel haritaların kurum ve bağlantı deşifre için faydalı olacak bir adım-adım izleme protokolü sağlar.
Protocol
1. Steril cerrahi kullanarak in vivo izleyiciler teslimi (Bölümler 1,1-1,16)
Süreci boyunca standart, steril cerrahi teknikler kullanılması tavsiye ederiz. Bu steril eldiven, önlük, yüz maskesi kullanarak içerir. Araçları kullanmadan önce ya otoklava ya da su ve etanol ile iyice temizlenmelidir. Ameliyat sırasında ve özellikle arasında hayvanlar, sıcak bir boncuk sterilizatör (Steri 250 Kedi # 18.000-45, Güzel Bilim Araçları) araçları ve kuru sterilize aletler kapalı temiz doku parçaları. Buna ek olarak, hayvan hazırlama (tıraş vb), cerrahi ve hayvan kolayca izlenir ısındı, ve gerektiği kadar ağrı kesicilerle temin edilebilir bir kurtarma alanı için belirlenen alanlar olduğunu, çalışma alanı gibi organize kritik öneme sahiptir. Başarılı hayatta kalma ameliyatları, enfeksiyon riskini azaltmak ve saldırgan bir post-operatif bakım stratejisi korumak için. Lütfen size fin Tablod bu protokol için tüm gerekli ekipman ve reaktifler.
- 0.2ml/10grams vücut ağırlığının her bir doz ile bir intraperitoneal (ip) enjeksiyonu ile taze hazırlanmış Avertin (Cat # T48402 2,2,2-Tribromoethanol, Sigma, St Louis MO) ile yetişkin farelerin anestezisi. Diğer izofluran veya ksilizin / ketamin gibi anestezikler eşit derecede etkilidir ancak laboratuvar kullanımdan önce gerekli kurumsal ve federal onay olduğundan emin olun. Eğer yavrular (P0-P10) kullanıyor iseniz, 10-15 dakika boyunca ezilmiş buz üzerinde onları uyutmak. Soğuk su hızla ölümcül bir düzeyde hipotermi neden olarak, her yavru cilt buz ile doğrudan temas (örneğin, lateks eldiven parmakları yerleştirerek) olmadığından emin olun. Hayvan hayvanların arka pençeleri forseps veya parmak ile ayak tutam yaparak kabul edilebilir bir ova anestezi altında olduğunu onaylayın. Bir pedal refleks varsa hayvanın daha derin bir göstergesi olarak bu uyarana cevap gelene kadar bekleyinanestezi düz.
- Sonra hayvan tamamen uyuşturulduktan sonra steril bir gazlı bezle başını siz ve size doğru kuyruk gelen bakacak kadar dorsal tarafına yatıyordu. Tıraş kendinizi merkezi sinir sistemine erişmek için yeterince geniş bir açık cerrahi alanında vermek için saç kesme makineleri ile kürk. Alkollü mendil iki takım, daha sonra% 70 alkol / betadin traş bölgeyi silin ve sonra alkollü mendil ile bir kez daha temiz. Cerrahi alanın temizlenmesi dışında dairesel bir iç kullanın. Cerrahi alan steril bir gazlı bez içine küçük bir delik ve tıraşlı ve temiz cerrahi sitesi üzerinden açıklık açıkça ayırmak için seçebilirsiniz. Steril cerrahi alanında sürdürmek, bunu yaparken, küçük hayvanlar üzerinde faaliyet enfeksiyon riskini azaltmaya yardımcı olacaktır yanıltıcı olabilir rağmen.
- Forseps kullanarak cilt kaldırın ve makas ile doğrudan alt torakal-üst lomber r üzerinde orta hat kesiegion. Vertebral kolon (Şekil 1) bir kambur hissediyorum omurları boyunca parmağınızı çalıştırarak alt torakal bölge-üst lomber bölgede tespit edilebilir.
- Fasya ve yüzeyel spinal kasların kesin. Gerekirse, kan damarları (; Cat # 18.000-00 Güzel Bilim Araçlar, Foster City, CA) dağlama herhangi bir kanamayı durdurmak. Yavrularda, pamuklu insizyon etrafında nazik bir basınç uygulayarak kanamayı durdurmak için yeterli olacaktır.
- (Şekil 2), eklem ve sırt spinöz süreci arasında vertebral kolon, yarıda her iki tarafta lamina kestikten sonra, bir ya da iki üst lomber spinal kord torasik alt segmentlerinin spinöz süreçleri kaldırarak dorsal laminektomi gerçekleştirin . Makas ile omurilik hasarı ve omurilik delici olarak her zaman küçük kemik parçaları kaldırmak için dikkatli olun. Postnatal yavrular vertebral kolon tamamen kemikleşmiş olduğunu unutmayın, kemiklerin çok anlamına gelmektedirYumuşak ve çok kolay kesilebilir. Bu nedenle, omurilik zarar verebileceği gibi çok derin kesmek için değil dikkatli olun.
- Yetişkin farelerde dorsal laminektomi gerçekleştirmek istemiyorsanız, size küçük bir bölgenin herhangi bir kemik kesmeden omurilik maruz vertebra segmentleri arasındaki yumuşak doku kesebilir bulduk. Omurilik girdiği her iki yöntem de etkili yolları olmasına rağmen, spinal kord dorsal laminektomi kaçınarak hasarsız kalmasını sağlayabilirsiniz.
- Gilmont Instruments Cat; mikrometre şırınga kullanarak tracer (0.2mL çekilmiş bir cam elektrot doldurun (Çift sahne Cam Mikropipet Çektirme Narishige Model 001-PC-10; Cat # 300.056, Harvard Apparatus, Holliston, MA. Borosilikat cam kapilerleri) # GS-1100) veya eşdeğer bir teslimat aparat.
- Bir micromanipulator yerleştirin cam mikroelektrot sıkın ve yarım orta arasındaki omuriliğin alt torakal-üst lomber bölgede elektrot 0.1-0.5mm eklemekhattı ve omurilik lateral kenarı. Stereotaksik enjeksiyon lokusların doğru tanımlama için bir aparat hayvan ve hayvan (Küçük Hayvan Stereotaksik Enstrüman Modeli 940-A ve Kopf Enstrümantasyon Elektrot Manipulator Model 960) stabilize tutulabilir. Alternatif olarak, anestezi rejimi yavaşça aşağı hayvan bantlama, derin nefes alma nedeniyle önemli hareketleri olmaksızın sabit bir düzlem elde etmek için uygun olabilir eğer yeterli olacaktır.
- 3-5 dakika içinde yaklaşık% 2'lik bir çözüm WGA-Alexa, 555; WGA-Alexa 488 (Cat # W11261, Invitrogen, Carlsbad, CA buğday tohumu agglutinin, Alexa Fluor 488 konjuge) 0.5μl omurilik içine enjekte Basınç (buğday tohumu agglutinin, Alexa Fluor 555 konjuge; Kedi # W32464 Invitrogen, Carlsbad, CA), WGA-Alexa 350 (buğday tohumu agglutinin, Alexa Fluor 350 konjuge; Kedi # W11263 Invitrogen, Carlsbad, CA), WGA- HRP (buğday tohumu agglutinin horseradish peroksidaz; Sigma, St Louis, MO Kedi # L7017) veya% 10, 0.5μlBDA (dekstran amin biotinlenmiş; Kedi # D1956, Invitrogen, Carlsbad, CA) serum fizyolojik (Sigma, St Louis, MO, Cat # P4417 PBS) fosfat tamponlu. Lifleri, çok sayıda etiketleme tracerlerin sonuçları bu hacim enjekte. Daha küçük hacimli küçük bir çekirdek (veya bireysel çekirdeklerin alt bölgeleri) ve her araştırmacı ampirik olarak sunmak için ideal bir ses belirlemelidir hedeflemesi için enjekte edilmesi gerekecektir. İyontoforez hassas enjeksiyonları için doğru nanoliter teslimat için düşünülmelidir. Ameliyat sırasında enjeksiyon yerinde görselleştirmek için; Biz genellikle% 0.5 Hızlı Yeşil (Cat # F7252 Sigma, St Louis, MO) ile tüm tracer çözümleri tamamlamak.
- BDA çözüm her 10μl karışımı çekti pipetler duvarlarına yapışmasını önlemek için enjekte etmeden önce, biz mısır yağı 1μl (Cat # C8267 Sigma, St Louis, MO) ekleyin. Pipetin sorun çıkartma tracer varsa, sonra tekrar enjekte deneyin dokusunda küçük bir cep oluşturmak için ucu yavaş yavaş geri çekin.Yapışmasına neden mikroelektrot bahşiş için alışılmadık bir durum değildir. Çoğu durumda, cebine de bir rezervuar çevre nöronlar İzleyicinin emebilir oluşturmanıza yardımcı olur. Iğne çevresinde büyük doku hasarı önlemek için her zaman yavaş yavaş tracer çıkarmak için unutmayın.
- Yara klipleri ve doku yapıştırıcısı ile cildi nazikçe kapatın. Alternatif olarak, dikişlerle yara kapatmak için kullanabilirsiniz.
- Pratikte cerrahi işlem ile, en azından bu noktaya kadar, en az 20 dakika tamamlandı olabileceğini unutmayın.
- Hayvan kurtarma kadar hipotermi ve hız önlemek için ısıtma pedi (Isıtma Pedi Kedi # 341.241 Harvard Apparatus) (Harvard Apparatus Vetcare kamara modeli Cat 9.16.0. # 340.508) bir kurtarma odasına yerleştirin. Alternatif olarak, ısıtma odaları birçok marka ve model birini kullanabilirsiniz. Solunum hızı monitörü ve hayvan taşımak için çalışıyor işaretler kontrol edin. Çoğu hayvan ameliyat sonrası 10-15 dakika içinde genellikle duyarlı.
- WGA-Alexa 555, WGA-Alexa 488 ve WGA-HRP nöronlarda hızla taşınması ve hem de erken doğum sonrası ve yetişkin farelerde Alexa konjuge tracerlerin 24 saat içinde güçlü bir etiket uzun lif yolları (Reeber ve ark 2011) bulduk . WGA-Alexa 350 de görünürlüğünü filtre setleri kalite ve hassasiyet son derece bağımlı diğer Alexa boyalar karşılaştırıldığında rağmen hızla taşınması (veriler gösterilmemiştir. Reeber ve ark 2011) BDA genellikle daha uzun yaşam süreleri yaklaşık 11 gün sonra hayvanların kurban edilmesi gerekecektir spinoserebellar projeksiyonlar tam eşleme için sinir projeksiyonları ve bu nedenle tam olarak izlemek için gereklidir.
2. Anterogradely takip yosun tutmuş lifler Tespiti
- Ilgili sağkalım süreleri Avertin (ya da tercih edilen anestezi) ile fareler anestezi sonra.
- Bir kez kan 0.1M PBS (pH7.2) ile perfüze kalp ile yıkanmalıdır hiçbir refleksleri vardır. Sonra, PBS içinde% 4 paraformaldehid (PFA) ile hayvan perfüze doku düzeltin. Analiz bölgelere ek olarak, her zaman enjeksiyon ne kadar büyük retrospektif analizi, elektrodu ile doku hasarı derecesinin bir göstergesi enjeksiyon yerinde doku elde etmek için gerekli ve mümkün etiketleme lifleri tanımlamak için geçit (Mesulam, 1982; Reeber ve ark 2011 Şekil 3).
- Postfix BRsonra% 4 PFA 24-48 saat süreyle perfüze farelerden alınan ains PBS (~ 2 saat ya da daha sonra doku, kabın altına lavabo ve% 30 gecede kadar ya kadar% 15 oranında sulandırılmış tamponlanmış sakaroz çözümleri onları cryoprotect doku lavabo). Doku sakaroz sonra çıkarılır, hafifçe kağıt havlu ile kurulayın sildi ve daha sonra Ekim içeren bir doku kalıp içine (Optimum Kesme Sıcaklığı; Sakura FINEtech USA Inc, CA). Sonra doku ve hazır kesilecek kadar -80 ° C derin dondurucuda kullanarak dondurulmuş ve aynı sıcaklıkta depolanır.
- Alexa fluorophores doğrudan etiketleme sonra görülebilir ve ek boyama gerekmez. Bu nedenle, WGA-Alexa takip doku perfüzyon sonra kesilecek ve görüntüleme için monte edilmiş ya da doğrudan wholemount bir hazırlık olarak% 4 PFA görüntülenmiş. % 4 doku PFA wholemounts izlenen projeksiyonlar topografya görüntüleme için en iyi refraktif indeks verdi görüntüleme bulundu. Bölümler için, seri 40μm kalınlığında Coron kesmekPBS içinde serbest bölümleri olarak arkadaşları bir Kriyostat bölümleri ve onları toplamak. PFA toksisitesi göz önüne alındığında, uygun bir yüz maskesi, perfüzyon ve görüntüleme sırasında aşınmış olduğunu sağlamak için iyi havalandırılan bir alanda tutmak ve kullanılmadığı zaman hemen sızdırmaz kaplarda herhangi bir PFA veya PFA sabit doku dönmek. Mikroskop uygun bir davlumbaz yer alıyorsa idealdir.
- WGA-HRP etiketli liflerden kromojen olarak tetramethylbenzidine (TMB) ile ortaya çıkabilmektedir. (; Sillitoe ve ark 2010 Vogel ve Prittie 1994) ayrıntılı olarak tarif edilmiştir beri burada HRP boyama protokolü açıklamak olmaz
- BDA etiketli lifleri Streptavidin-CY3 2 saat serbest doku kesitlerinde (Kat. # 434.315, Invitrogen, Carlsbad, CA) veya Streptavidin-Alexa Fluor 488 veya 555 (Kat. 488 ve Cat # S11223 kuluçkaya yatmaktadır. # S21381 için 555, Invitrogen, Carlsbad, CA), floro-GEL ile monte sonra PBS içinde yıkayın ve. (ABC reaksiyon tamponu geceleme DAB, inkübasyon doku kesitlerinde Kat. # PK-4000, VEctor Laboratories, Inc Burlingame, CA), PBS içinde 3 kez yıkayın ve sonra 10μl 30% H 2 O 2 ile desteklenebilir (0.5mg/ml, Vector Laboratories Inc, Burlingame, CA) DAB 5-10 dakika için tepki Her 50ml DAB çözümü için.
3. İmmünohistokimya
- İmmünohistokimya (Sillitoe ve ark 2008), daha önce açıklandığı gibi yapılmıştır. ,% 0.1 Tween 20 ve oda sıcaklığında 16-18 saat süreyle birincil antikorlar (aşağıya bakınız); Kısaca, 0.1M PBS içinde% 10 NGS (Sigma, St Louis MO NGS) içeren doku kesitlerinde kuluçkaya yatmaktadır. Doku bölümleri PBS içinde üç kez yıkayın ve sonra oda sıcaklığında 2 saat maksimum sekonder antikor (aşağıya bakınız) onları kuluçkaya yatmaktadır. Doku tekrar durulayın ve aşağıda açıklandığı gibi immünoreaktivite ortaya.
- Çift boyama geleneksel yöntemler kullanılarak serbest dalgalı doku bölümleri etiketli Purkinje hücreleri ve yosun tutmuş lifleri arasındaki ilişkiyi belirlemek için. Biz WGA-Alexa kullanılan 555izleme ve Alexa 488 konjuge eşek anti-fare sekonder antikor (Invitrogen / Moleküler Probları Inc, Carlsbad, CA) (1:250) Dr Richard Hawkes, Calgary Üniversitesi, Calgary, Kanada Tür hediye ZebrinII algılamak için. ZebrinII bir fare monoklonal antikor ve harcanan hibridoma kültür ortamı doğrudan kullanıldı. 1:1500 bir seyreltme fluorofor konjuge sekonder antikorlar kullanıldı. Boyandıktan sonra doku kesitlerinde ücret cam slaytlar monte edildi ve sonra DAPI (orta montaj Tris tampon (Elektron Mikroskobu Bilimleri, Hatfield, PA) floro-GEL ile veya Vectashield hardset dakika muamele Kat. # H-1200, Vector Laboratories, Burlingame , CA) üçlü renk floresan görüntüleme.
- Biz birincil antikor yokluğunda doku kesitlerinde işleme sekonder antikor özgüllük test etti. Sinyal yok gözlenen boyama th nonspesifik sinyallere bağlı olmadığını belirterek, bu tür kontrol deneyleri tespit edildie-Alexa-konjuge antikorların (veriler gösterilmemiştir).
4. Mikroskobu ve veri analizi
- Biz Leica DFC360 FX (floresan) ve DFC490 (DAB ve TMB doku kesitlerinde tepki) Leica DM5500 mikroskop üzerine monte edilmiş kameralar kullanarak doku kesitlerinde fotomikrografı yakalamak.
- Biz Leica Application Suite ve Leica Application Suite FX yazılım paketleri kullanılarak doku kesitlerinde görüntü alma ve analiz.
- Wholemounts, fotomikrografı Leica Application Suite FX yazılımı çalıştıran bir Leica MZ16 FA stereomikroskopta üzerine monte edilmiş bir Leica DFC3000 FX kamera kullanılarak çekilen.
- Mikroskopların Her ikisi de Leica CY3 (model # 11.600.231) ve FITC (model # 11.513.880) filtreleri ve ek bir A4 DAPI / UV filtresi (modele # 11.504.162) ile DM5500 ile donatılmıştır.
- Görüntüler Leica yazılımı kullanılarak belirlenen altında / aşırı maruz kalma için optimize sonra elde edilir. Biz Adobe Photoshop CS4 içine ve, eğer gerekli w tüm ham veri almake, netlik, parlaklık, kontrast ya da seviyeleri sadece her resim için alanın tamamını düzeltin. Diğer fotoğraf düzenleme yazılımları tercih olarak kullanılabilir.
- Burada sunulan şemadaki Adobe Illustrator CS4 çizildi.
- Filtreleri kullanarak kırmızı olarak algılanır Alexa 555 ve CY3 lekeli nöronlar, yazının boyunca sunulan görüntüler sözde renkli kırmızı.
Hayvanlar
Tüm hayvan çalışmaları, Albert Einstein College of Medicine kurumsal kurallarına göre onaylanmış bir IACUC hayvan protokol kapsamında gerçekleştirildi. Erkek ve kadın outbred İsviçre Webster (Taconic, Albany, NY) veya kendilenmiş C57BL6J (JAX, Bar Harbor, ME) fareler bizim koloni korunur ve tüm çalışmalar için kullanılmıştır. Vajinal fişi tespit edildi günü Noon embriyonik gün 0.5 olarak kabul edildi.
5. Temsilcisi Sonuçlar:
Spinoserebellar afferentleri parasagi içine feshetmebeyincik ttal bantları (Şekil 3 Voogd et al 1969; Grishkat ve Eisenman 1995; Vogel ve Prittie 1994; Vig ve ark 2005; Apps ve Hawkes 2009; Sillitoe ve ark 2010;. Reeber ve ark 2011). ) Reeber et al 2011), 2; Bu izleyiciler sürekli beyincik terminaller belirli alt kümeleri (Şekil 3 etiketlemek için kullanılacak olabilir) 1: Biz WGA-Alexa tracerlerin göstermek için alt torakal-üst lomber omurilik içine enjekte WGA-Alexa izleyiciler yoğun bir şekilde parlak ve tüm cerebella yosun tutmuş fiber topografya genel bir model (Şekil 3; Reeber ve ark 2011) görselleştirmek için kullanılabilir WGA-Alexa 488 ve 555 kombinasyon halinde kullanılabilir olması, 3) WGA-Alexa izleyiciler immünohistokimyasal (Şekil 5) ile uyumlu olduğu aynı hayvan (Şekil 4) ve 4) birden fazla yolları izleme için. Son dönem çalışmalarında WGA-Alexa tracerlerin etiket omuriliğe tracer teslim 6 saat sonra gibi erken bir zamanda beyincik terminalleri ve architectur izlemek için mükemmel bir seçim olduğunu gösterdigelişmekte olan yollar (Reeber ve ark, 2011) e.
Şekil 1, cerrahi alan bir Görüntü B. alt torakal-üst lomber bölgede vertebral kolon bir kambur hissediyorum vertebra boyunca parmaklarınızı çalıştırarak tespit edilebilir in vivo A. izleyiciler sağlamak için ekipman kurulumu . Dorsal laminektomi ortasında sarı bir ok ile gösterilir, "kambur", kabaca yapılmalıdır.
Şekil 2 alt torasik İllüstrasyon. Fare vertebral kolonun alt torakal-üst kereste bölgeden sağlam bir vertebral segment dorsal laminektomi öncesi ve sonrası A. şematik üst lomber vertebra segmenti B. Dorsal laminektomi, eklem ve sırt spinöz süreci arasında lamina yarıda kestikten sonra, bir veya iki vertebra segmentleri spinöz süreçleri kaldırarak yapılır.
Şekil 3. WGA-Alexa izleyiciler yoğun parlak ve yüksek çözünürlükte afferent projeksiyon topografya görselleştirmek için kullanılabilir. A. şematik WGA-Alexa kökeni ve sonlandırma 555 etiketli spinoserebellar nöron göstermektedir. WGA-Alexa 555 yetişkin omuriliğin alt torakal üst lomber bölgeye teslim sonrası enjeksiyon yerinde B. Resim C. Wholemount görüntü bir eş görüldüğü gibi omuriliğin alt torakal-üst lomber bölgede WGA-Alexa 555 enjeksiyonu takiben ön lobülleri spinoserebellar yolu izleme D. WGA-Alexa 555 anterograd yosun tutmuş liflerinin bantları ortaya koymaktadırRonal doku bölüm. Lobülleri orta hat (tüm görüntüleri için de geçerlidir) her iki tarafta Roma rakamlar ve sayılar etiket yosun tutmuş lif bantları tanımlanır. Ölçek barlar: B, 500 mikron C, 500 mm D 200 mm.
Şekil 4 WGA-Alexa izleyiciler aynı hayvan birden fazla nöral yolları etiketlenmesi için verimlidir. A. Wholemount şematik spinoserebellar yosun tutmuş lif bantları genel desen özetleyen fare beyincik. WGA-Alexa 555 lomber spinal kord ve WGA-Alexa 488 sağ tarafına doğru sol tarafta aynı segment içine enjekte edildi B. arka lobülleri kesti koronal doku bölümünde görüldüğü gibi, her iki WGA-Alexa tracerlerin beyincik taşınır ve terminallerin farklı alt kümeleri (ayrıca Reeber ve ark 2011) başarıyla etiketli. Kısaltmalar: köstebekresel katman (ml); Purkinje hücre tabakası (PCL), granül hücre tabakası (GCL), beyaz cevher (wm). Ölçek çubuklar: B, 100 mm.
Şekil 5 WGA-Alexa tracerlerin nöronlar ve projeksiyonlar üçlü etiketlenmesi için immünhistokimya ve histoloji ile birlikte kullanılabilir. A. WGA-Alexa 555 lobule III yosun tutmuş lif terminalleri yatırılır B. ZebrinII boyama lobule III Purkinje hücre çizgili bir dizi ortaya koymaktadır. Nöronal ve glial çekirdekleri C. DAPI boyama D. görüntü, paneller, A, B Birleştirilmiş ve üçlü etiketleme afferent bantları, Purkinje hücre şeritler, ve genel hücre mimarisini gösteren C EH. Paneller MS gösterilen kutulu bölgelerde yüksek büyütme görüntüler. Daha önce açıklandığı gibi Purkinje hücre şeritler (yorumlanan numaralı(Apps ve Hawkes, 2009)). Kısaltmalar: moleküler katman (ml), Purkinje hücre tabakası (PCL), granül hücre tabakası (GCL). Ölçek bar: D: D: D, 500 mikron (AC), H, 500 mikron (EG).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Biz başarılı bir akson ve dendrit, hızla gelişmekte olan ve erişkin farelerde sinir projeksiyonları etiketleme için bir roman floresan dayalı bir yaklaşım kullanarak izleme için gerekli cerrahi ve teknik detayları tarif var. WGA-Alexa kullanarak izleyiciler ve işaretleri, yüksek çözünürlükte desenli devre topoğrafyası ve üç boyutlu olarak analiz etmek için nasıl kullanılabileceğini gösteriyor.
Birçok izleyiciler kolera toksin altbirim B Biocytin, Neurobiotin, Phaseolus vulgaris leucoagglutinin (PHAL), fluororuby, fluoremerald ve fluorogold dahil nöronal devreleri izlemek için mevcuttur. Buna ek olarak, son genetik ve viral izleyiciler moleküler farklı nöronal altkümelerini topografik büyük bir hassasiyetle hedeflerine bağlı olduğunu göstermiştir. Tracer molekülleri bazı sinir izleyiciler ağırlıklı olarak ya anterograd veya retrograd yönde (örneğin, 3000 mw karşı BDA 10.000 mw) taşınabilir olmasına rağmen, çoğu zaman hem de taşınan olduğunu unutmayınyönleri. Çalışmalarda, topografik projeksiyon modelleri analizler için güvenilir nöroanatomik araçlar olarak WGA-Alexa tabanlı izleyiciler tanıtmak. WGA-Alexa, parlak fluoresces hızla taşınır ve serebellar sagital bölmeleri (Şekil 3) de dahil olmak üzere immünohistokimyasal işaretleri ile eşleştirilmiş için yeterince çok yönlü olduğunu göstermektedir.
Biz mevcut diğer nöroanatomik izleyiciler karşılaştırma WGA-Alexa kullanarak çeşitli sınırlamalar bulduk. BDA (Wu ve ark, 1999) aksine, daha önce WGA-Alexa karmaşık terminali uçlarının (Reeber ve ark 2011) (WGA-HRP) tüm morfoloji çıkmamasına gösterdi. Ancak, veziküler glutamat taşıyıcı 2 (VGLUT2) ve kokain ve amfetamin düzenlenmiş transkript peptid (CART) immünhistokimyasal (Reeber ve ark 2011 için immünohistokimyasal boyama ile WGA-Alexa izleme eşleştirme takip terminalleri anatomik bilgi değeri elde geliştirilmiş; Reeber Sillitoe, 2011). BirWGA-Alexa diğer eksiklik sinyal floresan sinyal korumak medya monte edilmiş olmasına rağmen, doku kesitlerinde nispeten hızlı bir şekilde düşürür. Bu nedenle kesme 2 gün içinde görüntüleme hala kabul etmesine karşın, genellikle görüntü kesme hemen sonra doku, etiketli elyaf ve terminaller başarıyla yansıması. Doku kesitlerinde immün sırasında yoğunluğunu kaybetmeye WGA-Alexa sinyali için bir eğilim var. Boyama sırasında daha az ve daha kısa yıkama kullanarak bu sorunu en aza indirebilirsiniz. Başka bir öneri immünohistokimya için işlenecektir komşu bölümleri ile karşılaştırmak için bir referans kesme günü takip doku bölümleri her zaman bir set montaj ve görüntü. Perfüzyon ve cryoprotection tracer yoğunluğu kaybı olmadan uzun süre saklanabilir ° C sonra elimizde OCT (Doku-Tek, Sakura Finetek, Torrance, CA) -80 muhafaza doku blokları gömülü.
Bizim approaizleme lifleri ch, kortikal, beyin sapı ve spinal yollar sinir haritalar izlemek için kolayca adapte olabilir. Şu anda genetiği değiştirilmiş hayvanlar ve seçici sistem lezyonları ve farmakolojik manipülasyonlar sonra devre oluşum dinamikleri çalışmak için devre oluşumu in vivo görüntüleme için WGA-Alexa İzli mermi kullanmayı olasılığını araştırıyor. WGA-Alexa Tarayıcıları hızlı ulaşım kısa vadeli analiz için izin verdiği için bizim yaklaşımımız topografik devrelerin yapısal plastisite sırasında meydana gelen dinamik değişimler ifşa ettiği için bir potansiyele sahiptir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Çıkar çatışması ilan etti.
Acknowledgments
Bu çalışma, başlangıç fonu Yeshiva Üniversitesi Albert Einstein College of Medicine RVS için yeni bir araştırmacı tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bead sterilizer | Fine Science Tools | Model Steri 250 Cat. # 18000-45 | |
| Cauterizer | Fine Science Tools | Cat. # 18000-00 | |
| Borosilicate glass capillaries | Harvard Apparatus | Cat. # 300056 | |
| Dual stage Glass Micropipette Puller | Narishige International | Model 001-PC-10 | |
| Micrometer syringe | Gilmont Instruments | Cat. # GS-1100 | |
| Small Animal Stereotaxic Instrument | Kopf Instruments | Model 940-A | |
| Electrode Manipulator | Kopf Instruments | Model 960 | |
| Vetcare chamber | Harvard Apparatus | Cat. # 340508 | |
| Heating Pad | Harvard Apparatus | Cat. # 341241 | |
| Leica DFC360 FX camera | Leica Microsystems | DFC360 FX | |
| Leica DFC490 camera | Leica Microsystems | DFC490 | |
| Leica DM5500 microscope | Leica Microsystems | DM5500 | |
| Leica DFC3000 FX camera | Leica Microsystems | DFC3000 FX | |
| Leica MZ16 FA microscope | Leica Microsystems | MZ16 FA | |
| CY3 Filter | Leica Microsystems | Model # 11600231 | |
| FITC Filter | Leica Microsystems | Model # 11513880 | |
| A4 DAPI/UV filter | Leica Microsystems | Model # 11504162 | |
| Wheat germ agglutinin, Alexa Fluor 488 conjugate | Invitrogen | Cat. #W11261 | |
| Wheat germ agglutinin, Alexa Fluor 555 conjugate | Invitrogen | Cat. #W32464 |
References
- Apps, R., Hawkes, R. Cerebellar cortical organization: a one-map hypothesis. Nat. Rev. Neurosci. 10, 670-681 (2009).
- Grishkat, H. L., Eisenman, L. M. Development of the spinocerebellar projection in the prenatal mouse. J. Comp. Neurol. 363, 93-108 (1995).
- Mesulam, M. Tracing neural connections with horseradish peroxidase. , Wiley. New York. (1982).
- Reeber, S. L., Sillitoe, R. V. Patterned expression of a cocaine- and amphetamine regulated transcript (CART) peptide reveals complex circuit topography in the rodent cerebellar cortex. Journal of Comparative Neurology. , (2011).
- Reeber, S. L., Gebre, S. A., Sillitoe, R. V. Fluorescence mapping of afferent topography in three dimensions. Brain. Struct. Funct. , (2011).
- Sillitoe, R. V., Stephen, D., Lao, Z., Joyner, A. L. Engrailed homeobox genes determine the organization of Purkinje cell sagittal stripe gene expression in the adult cerebellum. J. Neurosci. 28, 12150-12162 (2008).
- Sillitoe, R. V., Vogel, M. W., Joyner, A. L. Engrailed homeobox genes regulate establishment of the cerebellar afferent circuit map. J. Neurosci. 30, 10015-10024 (2010).
- Vig, J., Goldowitz, D., Steindler, D. A., Eisenman, L. M. Compartmentation of the reeler cerebellum: segregation and overlap of spinocerebellar and secondary vestibulocerebellar fibers and their target cells. Neuroscience. 130, 735-744 (2005).
- Vogel, M. W., Prittie, J. Topographic spinocerebellar mossy fiber projections are maintained in the lurcher mutant. J. Comp. Neurol. 343, 341-351 (1994).
- Voogd, J., Broere, G., van Rossum, J. The medio-lateral distribution of the spinocerebellar projection in the anterior lobe and the simple lobule in the cat and a comparison with some other afferent fibre systems. Psychiatr. Neurol. Neurochir. 72, 137-151 (1969).
- Wu, H. S., Sugihara, I., Shinoda, Y. Projection patterns of single mossy fibers originating from the lateral reticular nucleus in the rat cerebellar cortex and nuclei. J. Comp. Neurol. 411, 97-118 (1999).
