Summary
이 비디오는 망막 신경절 세포의 개수 (RGCs)를 quantifying하고 RGCs의 크기를 측정, 내부 핵 층의 두께를 측정 포함 망막의 morphometric 분석의 세 가지 유형을 보여줍니다. 기술 morphometric 분석을위한 간단하면서도 과학적인 플랫폼을 제공할 수 있습니다.
Abstract
망막 섹션 Morphometric 분석은 망막 질환 검사에 사용되었습니다. 예제의 경우의 연결 세포는 크게 N-메틸-D-aspartate와 쥐 모델에서 망막 신경절 세포 계층 (RGCL)에 분실되었다 (NMDA) excitotoxicity 1, 망막 국소 빈혈 - reperfusion 상해 2, 녹내장 3-유도된. INL 및 내부 plexiform 계층의 감소 (IPL)은 카인산-매개 글루 탐 산염의 excitotoxicity 4로 들어서는 쥐 '눈에는 citicoline 치료 반대했다 두께. RGC 밀도와 소마 크기의 변경은 고가 intraocular 압력 3,5,6과 눈속에서 다른 약물 치료와 함께 관찰되었다. 따라서 망막 morphometries를 분석의 객관적인 방법을 갖는 것은 망막 pathologies 및 치료 전략의 효과를 평가에 큰 의미있을 것으로 생각됩니다.
망막 구조는 멀티 레이어와 뉴런 exi 여러 종류입니다망막에있는 일. 이러한 서로 다른 레이어의 휴대폰 번호, 휴대 크기 및 두께 등 망막의 morphometric 매개 변수는 세포 배양 시스템보다 더 복잡합니다. 초기에 이러한 매개 변수는 다른 상용 이미징 소프트웨어를 사용하여 감지가 가능하다. 값은 상대적인 가치를 일반적이며, 정확한 값으로 변경하면 더 정확한 계산을 할 수 있습니다. 또한, 세포의 크기와 형태의 추적은 특히 만성 녹내장 모델에서 정확하고 통계 분석을위한 충분한 예민하지 않을 수 있습니다. 이 프로토콜에 사용되는 측정은보다 정확하고 편리한 방법을 제공했습니다. 그리고 세포의 라인 및 크기의 절대 길이를 직접 및 기타 파일을 복사할 쉽게 신고 할 수 있습니다. 예를 들어, INL의 안쪽과 바깥쪽 가장 핵의 마진을 추적하고 두께를 측정하는 90도 각도를 그리는 소프트웨어를 사용하여 라인을 형성했다. 소프트웨어의 도움없이는 아마도 경사 라인과 망막 두께의 변화가 있지만개별 관측 사이에서 반복하지. 또한, RGCs의 개수 및 밀도도 계량하실 수 있습니다. 이 프로토콜은 성공적으로 망막의 기능을 quantitating에 다양성을 감소 최소한의 변화를 감지에서 감도를 증가시킵니다.
이 비디오는 망막 섹션 morphometric 분석의 세 가지 유형을 설명합니다. 그들은 INL 두께를 측정 RGCs의 수를 quantifying와 절대값에 RGCs의 크기를 측정 등이 있습니다. 이 세 가지 분석은 스테레오 탐정 (- MicroBrightField 주식 MBF Bioscience)와 함께 진행됩니다. 기술 morphometric 분석을위한 간단하면서도 과학적인 플랫폼을 제공할 수 있습니다.
Protocol
1. 도구
현미경, 니콘
스테레오 탐정, MBF Bioscience - MicroBrightField 주식 회사
2. 준비
- 어떤 morphometric 분석 작업을하기 전에 각 망막 샘플은 4 미크론의 두께에 sectioned이며 H & E 염색법를 겪습.
- 상단 주변 지역, 상단 중앙 지역, 낮은 주변 지역, 그리고 낮은 중부 지방 - 망막 부분은 4 지역으로 나누어져 있습니다.
- 영역을 정의 후, 각 지역의 이미지는 니콘의 밝은 빔 현미경 10x40 배율로 취득합니다.
- 이제, 우리는 망막의 morphometry을 분석할 준비가 된 것입니다.
3. INL 두께를 측정
- 각 영역의 INL 두께 네 성능은 측정되었다. 포 라인은 INL의 바깥 경계에 윤곽 기준에서 수직 그릴 것입니다.
- 스테레오 탐정이라는 소프트웨어를 열고 메인 툴바에서 40x 렌즈를 선택합니다.
- 탭에서 "파일"아래의 "이미지 열기"를 선택합니다. 당신은 분석하고자하는 원하는 망막 지역의 이미지를 선택하십시오.
- 메인 툴바의 드롭 다운 목록 상자에서 윤곽 라인의 유형을 선택하고 "자동 이동"버튼을 누르십시오.
- 오른쪽 추적 창을 클릭하고 "간단한 클릭 추적"를 선택합니다.
- INL의 내부 경계를 따라 등고선 라인을 그립니다.
- 추첨이 완료되면, 오른쪽 추적 창에서 클릭하고 "최종 열기 컨투어"를 선택합니다.
- 마커 도구 모음에서 표시를 선택하고 연결 지점에 마커를 추가할 수 있습니다.
- 모든 마커를 추가한 후, 마커 툴바에있는 마커 아이콘을 취소합니다.
- 마커 중 하나의 중심에 커서를 둡니다.
- "빨리를 선택하십시오도구 ""탭 아래 "각도를 측정합니다.
- 오른쪽 추적 창에 클릭하고 "지속"옵션을 해제.
- 첫번째 라인 세그먼트의 끝을 위해 선택한 마커에 인접한 마커의 중심을 클릭하여 각도를 측정합니다.
- 그런 다음 관련 마커의 중심에 마우스를 이동하고 다시 클릭합니다.
- INL의 바깥 테두리에 고무 밴드 라인을 확장합니다.
- 90 °에 도달할 때까지 각도를 조정합니다.
- 원하는 위치에 클릭 왼쪽. 각도 측정을 보여주는 대화 상자를 클릭하면 오른쪽에 나타납니다.
- 를 눌러여전히 마우스를 누른 상태에서 "Enter"키를.
- 줄이 한쪽 끝을에서 새로 선택한 끝에 그려진 있도록 추적 창을 클릭 왼쪽.
- 오른쪽 추적 창을 클릭하고 "최종 열기 컨투어"를 선택합니다.
- 이전에 설명한대로 정확히 같은 방식으로 다른 위치에 다른 라인을 그립니다.
- 모든 라인을 그리는 후 편집 모드를 선택하고 이에 따라 4 선 세그먼트의 이름을 바꿉니다.
- 네 성능은 '컨투어 측정 "버튼을 누르면 얻을 수있다.
- 이러한 4 가지 측정을 선택하고 "클립 보드에 복사 '를 클릭하면 스프레드 시트로 붙여 넣습니다.
- 선택이 탭에서 "파일"아래의 "다른 이름으로 저장"을 클릭하십시오. 추적 데이터는 데이터 파일로 저장할 수 있습니다.
- 탭에서 "파일"아래의 "이미지 열기"를 선택합니다. 당신은 분석하고자하는 원하는 망막 지역의 이미지를 선택하십시오.
- 메인 툴바의 드롭 다운 목록 상자에서 윤곽 라인의 유형을 선택하십시오.
- 신경 섬유 층 (NFL)의 국경을 따라 등고선 라인을 그립니다.
- 옵션 "최종 열기 컨투어"로 추적을 종료합니다.
- 각 끝에 한 줄의 끝부분에서 마커와 끝 가까이 위치에서 서로를 추가합니다.
- 마커 도구 모음에서 마커 아이콘을 취소합니다.
- 일각에서 마커의 중심에 커서를 둡니다.
- 탭에서 '도구'아래의 '빠른 측정 각도 "를 선택하십시오.
- 오른쪽 추적 창에 클릭하고 "지속"옵션을 해제.
- 고무 밴드 라인을 조정하고 90 °의 각도를 측정합니다.
- 대화 상자가 뜬 후 "Enter"키를 누르십시오.
- 왼쪽 버튼을 클릭 t새로운 라인이 수직 팁에서 확장할 수 있도록 그 창문을 추적.
- 다른 끝에 정확히 같은 방식으로 다른 새로운 라인을 그립니다.
- 두 경계는 RGCs의 수를 계산하는 내에서 만들어집니다.
- 세포 처리가 계산되지 제외 줄에 한 가지 경계를 선택합니다.
- 마커 중 하나 유형을 선택하고 각 라이브 셀 하나를 첨부해 주시기 바랍니다.
- 죽은 세포에 대한 마커의 또 다른 유형을 선택합니다.
- 위치 마커의 각 유형의 숫자 마커 도구 모음에 따라 마커 아이콘과 함께 표시됩니다.
- 편집 모드를 선택하고 윤곽 기준을 선택하십시오. 오른쪽 추적 창에 클릭하고 라인을 바꿉니다.
- 윤곽 기준의 길이는 "컨투어 측정"버튼을 누르면 얻을 수있다.
- 세포의 수는 다음 길이 mm 당 표현할 수있다.
- 선택이 탭에서 "파일"아래의 "다른 이름으로 저장"을 클릭하십시오.레이싱이나 마커 데이터를 데이터 파일로 저장할 수 있습니다.
5. RGC 세포의 세포 크기를 측정
- 탭에서 "파일"아래의 "이미지 열기"를 선택합니다. 당신은 분석하고자하는 원하는 망막 지역의 이미지를 선택하십시오.
- 라이브 세포 확대 및 메인 툴바의 드롭 다운 목록 상자에서 윤곽 라인의 유형을 선택합니다.
- 세포의 둘레를 따라 등고선 라인을 그립니다.
- 최종 관한에서는 오른쪽 추적 창을 클릭하고 "최종 가까운 윤곽"를 선택합니다.
- 세포의 영역은 컨투어 측정 대화 상자에 영역의 항목에 표시됩니다.
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Discussion
1. 보다 정확한 두께 측정을 구하는 방법?
이 버튼을 "확대"를 클릭하여 이미지를 확대 및 추적 창에서 클릭두고 있습니다. INL 테두리가 분명하게 볼 수 있습니다. 라인의 끝은 INL의 바깥 경계에 있지 않으면, 우리는 편집 모드에서 라인을 조정할 수 있습니다. 관련 라인을 따기 후 오른쪽 추적 창을 클릭하고 선택 "선택된 윤곽선의 포인트를 넣습니다." 추가 포인트가 같은 라인을 따라해야하는 동안 지점이 바깥쪽 경계에 추가할 수 있습니다. 그런 다음, 원래 지점을 삭제하고 더 정확한 길이 라인은 얻을 수 있습니다.
2. 고무 밴드 라인의 90 °를 유지하는 방법?
학위를 보여주는 대화 상자가 팝업되면, 당신은 "Enter"키를 누르면서 여전히 마우스를 개최해야합니다. 그런 다음 새로운 라인이 그려진 수 있도록 추적 창을 클릭 떠났어.
3. 어떻게 살아있는 세포와 죽은 C를ells처럼 보여?
세포질과 핵이 명확하게 관찰로 대략 둥근 모양의 이들 세포는 라이브 RGCs로 간주됩니다. 이러한 comparably 작고 농축 세포가 죽은 세포로 간주됩니다.
4. 이러한 망막 샘플은 현재 프로토콜의 H & E 염색법을 거쳐되었다. 그것은 형광 염색법과 망막 샘플을 측정할 수 있습니까?
예. 현재 프로토콜 H & 망막 섹션을 더럽히는 것 E, 형광 염색법과 망막 샘플에 있지만 역시 같은 방법으로 측정할 수 있습니다. 예를 들어, 같은 DAPI의 염색법을 사용하여 그림 1에 표시된 모든 핵은 405 nm의 필터 아래 스테인드와 색상의 시각 파란색 될 것입니다. 망막 신경절 세포 계층 (RGCL)의 핵은 내면의 핵 계층 (INL) 및 외부 핵 계층 (ONL)을 볼 수 있습니다. 그런 다음 다른 레이어의 두께는이 동영상에서 보여주는 비슷한 방법으로 검색하실 수 있습니다.
1 그림.
다른 스테인드 형광 신호의 크기에 대해서, 우리의 그룹은 쥐의 녹내장 모델 (루오 외, 2009)에서 RGCL에서 뉴런의 크기에 관한 논문을 발표했습니다.
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Disclosures
저자가 공개하는 게 없다.
Acknowledgments
이 실험실의 안과 연구 작업은 미국의 건강 보조 재단, 진달래 (1972) 기증 기금, 그리고 HKU 소형 프로젝트 기금 (20,097,176,185)에 의해 지원됩니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Stereo Investigator | MicroBright Field | ||
| Microscope | Olympus Corporation | BX51 |
References
- Lam, T. T., Abler, A. S., Tso, M. O. N-Methyl-D-Aspartate (NMDA)–Induced Apoptosis in Rat Retina. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 40, 2391-2397 (1999).
- Lam, T. T., Abler, A. S., Tso, M. O. Apoptosis and caspases after ischemia-reperfusion injury in rat retina. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 40, 967-975 (1999).
- Luo, X. G., Chiu, K., Lau, H. S., Lee, V. W. H., Yung, K. K. L., So, K. F. The Selective Vulnerability of Retinal Ganglion Cells in Rat Chronic Ocular Hypertension Model at Early Phase. Cellular and Molecular Neurobiology. 29 (8), 1143-1151 (2009).
- Han, Y. S., Chung, I. Y., Park, J. M., Yu, J. M. Neuroprotective effect of citicoline on retinal cell damage induced by kainic acid in rats. Korean J. Ophthalmol. 19, 219-226 (2005).
- Hernandez, M., Urcola, J. H. Retinal ganglion cell neuroprotection in a rat model of glaucoma following brimonidine, latanoprost or combined treatments. Exp. Eye Res. 86, 798-806 (2008).
- Chan, H. C., Chang, R. C. C., Ip, A. K. C., Chiu, K., Yuen, W. H., Zee, S. Y., So, K. F. Neuroprotective effects of Lycium barbarum Lynn on protecting retinal ganglion cells in an ocular hypertension model of glaucoma. Experimental Neurology. 203, 269-273 (2007).
