Análises morfométricas de secções da retina

Summary

Este vídeo demonstra três tipos de análise morfométrica da retina, que incluem a medição da espessura da camada nuclear interna, a quantificação do número de células ganglionares da retina (RGCs) e medindo os tamanhos dos RGCs. A técnica pode oferecer uma plataforma simples, mas científica para análises morfométricas.

Abstract

Análises morfométricas de secções da retina têm sido utilizados na análise doenças da retina. Para exemplos, as células neuronais foram significativamente perdido na camada de células ganglionares da retina (RGCL) em modelos de ratos com N-metil-D-aspartato (NMDA)-induzida excitotoxicidade ^1, lesão de isquemia-reperfusão da retina e glaucoma ^{2 3.} Redução do INL e interior camada plexiforme (IPL) espessuras foram invertidos com o tratamento com citicolina em olhos de ratos submetidos a excitotoxicidade do glutamato mediada pelo ácido caínico ^4. Alteração da densidade de RGC e tamanhos do soma foram observadas com tratamentos medicamentosos diferentes em olhos com pressão intra-ocular elevada ^3,5,6. Portanto, ter métodos objetivos de analisar as morphometries na retina podem ser de grande importância na avaliação de patologias da retina e da eficácia de estratégias terapêuticas.

A estrutura da retina é multi-camadas e vários tipos diferentes de neurônios exir na retina. Os parâmetros morfométricos do retina tais como o número de células, o tamanho da célula e da espessura das camadas de diferentes são mais complexas do que o sistema de cultura celular. Logo no início, estes parâmetros podem ser detectadas usando software de imagem de outro comercial. Os valores são normalmente de valor relativo, e mudando para o valor exacto pode necessitar de cálculo mais preciso. Além disso, o traçado do tamanho da célula e morfologia pode não ser preciso e suficientemente sensível para a análise estatística, especialmente no modelo de glaucoma crónico. As medições utilizados neste protocolo fornecido um modo mais preciso e rápido. E o comprimento absoluto da linha e tamanho da célula pode ser directa e fácil de ser copiado para outros arquivos. Por exemplo, descrevemos a história da margem de núcleos mais interior e exterior, no INL e formou uma linha, em seguida, usando o software para desenhar um ângulo de 90 graus para medir a espessura. Embora sem a ajuda do software, a linha oblíqua e talvez a mudança de espessura da retina podenão ser repetitivo entre observadores individuais. Além disso, o número e densidade de RGCs também pode ser quantificada. Este protocolo com sucesso diminui a variabilidade na quantificação características da retina, aumenta a sensibilidade na detecção de alterações mínimas.

Este vídeo vai demonstrar três tipos de análises morfométricas das secções da retina. Eles incluem a medição da espessura INL, quantificar o número de RGCs e medição dos tamanhos de RGCs em valor absoluto. Estas três análises são realizadas com Stereo Investigator (MBF Bioscience - MicroBrightField, Inc.). A técnica pode oferecer uma plataforma simples, mas científica para análises morfométricas.

Protocol

1. Ferramentas

Microscópio, Nikon

Investigador Stereo, MBF Bioscience - MicroBrightField, Inc.

2. Preparação

1. Antes de trabalhar em qualquer análise morfométrica, cada amostra de retina é seccionado em 4 mícrons de espessura e sofre a coloração H & E.
2. A secção de retina é dividida em 4 regiões - região periférica superior, a região central superior, a parte inferior região periférica, e quanto menor região central.
3. Depois de definir as regiões, uma imagem de cada região é adquirida em ampliações 10x40 sob o microscópio feixe luminoso da Nikon.
4. Agora, estamos prontos para analisar a morfometria da retina.

3. Medição da espessura INL

1. Quatro medições de espessura INL em cada região foram medidos. Quatro linhas serão desenhadas perpendicularmente a partir da base de contorno para a borda externa do INL.
2. Abra o software chamado Stereo Investigator e escolher a lente 40x da barra de ferramentas principal.
3. Selecione "Abrir Imagem" na guia "Arquivo". Escolha a imagem de uma região desejada da retina que você gostaria de analisar.
4. Escolha o tipo de linha de contorno da caixa de lista suspensa da barra de ferramentas principal e pressione o botão "Auto Move" botão.
5. Botão direito do mouse na janela de rastreamento, e selecione "Simple Clique Tracing".
6. Desenhe a linha de contorno ao longo da fronteira interna do INL.
7. Quando o desenho é feito, com o botão direito na janela de rastreamento e escolha "Contour Open End".
8. Seleccionar um marcador na barra de ferramentas marcador e adicionar marcadores nos pontos de junção.
9. Depois de adicionar todos os marcadores, desmarcar o ícone de marcador na barra de ferramentas do marcador.
10. Posicionar um cursor no centro de um dos marcadores.

11. Selecione "QuickMedir o ângulo "na guia" Ferramentas ".

12. Botão direito do mouse na janela de rastreamento e desmarcar a opção "Contínuo".
13. Medir um ângulo clicando primeiro no centro de um marcador, que é adjacente ao marcador seleccionado para uma extremidade do segmento de linha.

14. Em seguida, mova o mouse para o centro do marcador em questão e clique novamente.
15. Estender a linha de elástico para a borda externa do INL.
16. Ajustar o ângulo até 90 ° é atingido.

17. Clique deixado na posição desejada. Uma caixa de diálogo mostrando uma medição do ângulo irá aparecer logo após o clique.
18. Pressione o botãoTecla "Enter", mantendo o rato ainda.

19. Clique esquerdo da janela de rastreio de modo que uma linha é traçada a partir de uma extremidade à extremidade novo seleccionada.
20. Botão direito do mouse na janela de rastreamento e escolha "Contour Open End".

21. Desenhar as linhas outros em diferentes posições no exactamente da mesma maneira como descrito anteriormente.
22. Depois de desenhar todas as linhas, selecione o modo de edição e renomear os 4 segmentos de linha em conformidade.
23. Quatro medidas podem ser obtidas pressionando "Medição Contour" botão.
24. Selecione essas medidas 4 e colá-los para uma planilha, clicando em "Copiar para a Área de Transferência".
25. Selecione "Salvar como" na aba "Arquivo". Os dados de rastreamento pode ser salva como um arquivo de dados.

1. Selecione "Abrir Imagem" na guia "Arquivo". Escolha a imagem de uma região desejada da retina que você gostaria de analisar.
2. Escolha o tipo de linha de contorno da caixa de lista suspensa da barra de ferramentas principal.
3. Desenhar uma linha de contorno ao longo da fronteira da camada de fibras nervosas (NFL).
4. Termine o rastreamento com o "Contour Open End" opção.
5. Em cada extremidade, adicionar um marcador na ponta da linha e outro na posição perto da ponta.
6. Desmarque o ícone marcador na barra de ferramentas do marcador.
7. Posicionar um cursor no centro dos marcadores na ponta.
8. Selecione "Angle medida rápida" na guia "Ferramentas".
9. Botão direito do mouse na janela de rastreamento e desmarcar a opção "Contínuo".
10. Ajustar as linhas da faixa de borracha e medir um ângulo de 90 °.
11. Pressione a tecla "Enter" depois de uma caixa de diálogo é apareceu.
12. Esquerda clique em tele rastreio janela de modo que uma nova linha pode ser estendida perpendicularmente a partir da ponta.
13. Desenhe outra linha nova no exatamente da mesma maneira no outro fim.
14. Dois limites são criados dentro do qual o número de RGCs é contado.
15. Escolha uma fronteira como uma linha de exclusão que os toques de células não é contado.
16. Selecione um tipo de marcador e anexar um para cada célula viva.
17. Selecione outro tipo de marcador para as células mortas.
18. O número de cada tipo de marcadores colocados será exibido com o ícone marcador em conformidade na barra de ferramentas marcador.
19. Selecione o modo de edição e pegar a linha de base de contorno. Botão direito do mouse na janela de rastreamento e renomear a linha.
20. O comprimento da linha de base contorno pode ser obtido por compressão de "medição de contorno" botão.
21. O número de células podem então ser expresso por mm de comprimento.
22. Selecione "Salvar como" na aba "Arquivo". Orastreamento e os dados de marcadores podem ser salvos como um arquivo de dados.

5. Medindo o tamanho da célula de uma célula RGC

1. Selecione "Abrir Imagem" na guia "Arquivo". Escolha a imagem de uma região desejada da retina que você gostaria de analisar.
2. Zoom em uma célula viva e escolha o tipo de linha de contorno da caixa de lista suspensa da barra de ferramentas principal.
3. Desenhar uma linha de contorno ao longo da circunferência da célula.
4. Por volta do fim, com o botão direito na janela de rastreamento e selecione "End contorno próximo".
5. A área da célula será exibido no item de Área na caixa de diálogo Contorno Medição.

Discussion

1. Como obter uma medição de espessura mais precisa?

Você pode ampliar a imagem clicando em "Zoom in" e à esquerda, clique na janela de rastreamento. A fronteira INL pode ser visto claramente. Se a ponta da linha não está na borda externa do INL, podemos ajustar a linha sob o modo de edição. Após escolher a linha em causa, com o botão direito na janela de rastreamento e escolha "Ponto de Inserção na Contour Selecionado". Um ponto pode ser adicionado na fronteira exterior, enquanto o ponto adicionada deve ser ao longo da mesma linha. Então, você tem que apagar o ponto original e uma linha com um comprimento mais preciso pode ser obtido.

2. Como manter 90 ° da linha de banda de borracha?

Depois de uma caixa de diálogo mostrando o grau é de aparecer, você tem que segurar o mouse ainda enquanto pressiona a tecla "Enter". Em seguida, clique esquerdo da janela de rastreamento para que uma nova linha pode ser desenhada.

3. Como as células vivas e mortas cells parece?

Estas células de uma forma aproximadamente redonda com citoplasma e núcleo claramente observado são considerados como RGCs vivos. Estas células comparavelmente pequenas e condensada são consideradas como as células mortas.

4. Essas amostras foram submetidas retina H & E coloração no protocolo atual. É possível medir a amostra retina com coloração fluorescente?

Sim. Embora o protocolo de corrente está ligado a H e E coloração secções da retina, a amostra da retina com coloração fluorescente pode também ser medir a mesma forma. Por exemplo, como mostrado na Figura 1 utilizando coloração DAPI, todos os núcleos será manchado e azul visualizado na cor sob um filtro de 405 nm. Núcleos na camada de células ganglionares da retina (RGCL), a camada nuclear interior (INL) e da camada nuclear externa (ONL) pode ser visto. Em seguida, a espessura das camadas de diferentes podem ser detectados de forma semelhante demonstrado neste vídeo.

Figura 1.

Sobre o tamanho de diferentes manchadas sinais fluorescentes, o nosso grupo publicou um documento sobre o tamanho de neurônios no RGCL em um rato glaucoma modelo (Luo et al, 2009).

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Stereo Investigator		MicroBright Field
Microscope		Olympus Corporation	BX51