Summary
Deze video toont drie soorten morfometrische analyses van het netvlies, waaronder het meten van de binnenste nucleaire laag dikte, het kwantificeren van het aantal retinale ganglioncellen (RGC) en het meten van de afmetingen van RGC. De techniek kan bieden een eenvoudige, maar wetenschappelijk platform voor morfometrische analyses.
Abstract
Morfometrische analyses van het netvlies onderdelen zijn gebruikt bij de behandeling van retinale aandoeningen. Voor voorbeelden werden neuronale cellen significant verlies in de retinale ganglion cellaag (RGCL) in ratmodellen met N-methyl-D-aspartaat-(NMDA)-geïnduceerde excitotoxiciteit 1 retinale ischemie-reperfusie 2 en glaucoom 3. Vermindering van INL en innerlijke plexiform laag (IPL) diktes werden teruggedraaid met Citicoline behandeling in ratten de ogen blootgesteld aan kainic zuur-gemedieerde glutamaat excitotoxiciteit 4. Wijziging van RGC dichtheid en soma maten werden waargenomen met verschillende behandelingen met medicijnen in de ogen met een verhoogde intra-oculaire druk 3,5,6. Daarom kan met objectieve methoden van het analyseren van de retinale morphometries van grote betekenis zijn bij de evaluatie van retinale aandoeningen en de effectiviteit van therapeutische strategieën.
Het netvlies structuur is multi-lagen en verschillende soorten neuronen Exist in het netvlies. De morfometrische parameters van het netvlies, zoals het aantal cellen, celgrootte en de dikte van de verschillende lagen zijn complexer dan de celcultuur. Vroeg op, kunnen deze parameters worden gedetecteerd met behulp van andere commerciële imaging software. De waarden zijn gewoonlijk van relatieve waarde, en de overgang naar de juiste waarde kan verder nauwkeurige berekening nodig. Ook kan het traceren van de celgrootte en morfologie niet nauwkeurig en gevoelig genoeg statistische analyse van met name de chronische glaucoom model. De metingen die in dit protocol voorzien in een meer nauwkeurige en eenvoudige manier. En de absolute lengte van de lijn en de grootte van de cel direct gemakkelijk worden gekopieerd naar andere bestanden worden gerapporteerd. Zo volgden we de rand van de binnenste en buitenste de meeste kernen in de INL en vormden een lijn dan met behulp van de software om een hoek van 90 graden te vestigen op de dikte te meten. Terwijl zonder de hulp van de software, de lijn misschien schuin en het veranderen van retinale dikte kanniet herhaalbaar zijn bij individuele waarnemers. Bovendien kan het aantal en de dichtheid van RGC worden gekwantificeerd. Dit protocol vermindert met succes de variabiliteit in kwantificeren van kenmerken van het netvlies, verhoogt de gevoeligheid bij het opsporen van minimale veranderingen.
Deze video tonen drie soorten morfometrische analyse van het netvlies secties. Zij omvatten meten INL dikte, dat het aantal RGC en meting van de grootte van RGC in absolute waarde. Deze drie analyses worden uitgevoerd met Stereo Investigator (MBF bio - MicroBrightField, Inc.) De techniek kan bieden een eenvoudige, maar wetenschappelijk platform voor morfometrische analyses.
Protocol
1. Gereedschap
Microscoop, Nikon
Stereo Investigator, MBF bio - MicroBrightField, Inc
2. Voorbereiding
- Bij werkzaamheden aan een morfometrische analyse, elk netvlies monster doorsnede van 4 micron dikte en ondergaat de H & E kleuring.
- Het netvlies sectie is verdeeld in 4 regio's - de bovenste perifere regio, de bovenste centrale regio, de lagere perifere regio, en de lagere centrale regio.
- Na het definiëren van de regio's, wordt een beeld van elke regio verworven 10x40 vergrotingen onder de heldere straal microscoop van Nikon.
- Nu zijn we klaar om morfometrie van het netvlies te analyseren.
3. Het meten van de dikte INL
- Vier metingen van INL dikte in elk gebied werden gemeten. Vier lijnen loodrecht worden getrokken uit de contour baseline tot de buitenste grens van het INL.
- Open de software met de naam Stereo Investigator en kies de 40x lens van de Main Toolbar.
- Selecteer "Image Open" onder het tabblad "Bestand". Kies een afbeelding van een gewenste netvlies regio die u wilt analyseren.
- Kies het type van de contourlijn van het uitklapmenu van de hoofdwerkbalk en druk op de "Auto Move" knop.
- Klik met de rechtermuisknop in het opsporen venster, en selecteer "Simpele Klik Tracing".
- Teken de contour lijn langs de binnenkant van het INL.
- Als de tekening klaar is, klik met de rechtermuisknop in het opsporen en kies "End Open Contour".
- Selecteer een marker op de marker werkbalk en voeg markeringen op de kruising punten.
- Na het toevoegen van alle markers, schakelt u de marker icoon aan de Marker Toolbar.
- Plaats een cursor in het midden van een van de markers.
- Selecteer "QuickMeet Angle "onder het tabblad" Tools ".
- Klik met de rechtermuisknop in het opsporen venster en deselecteer de "Continue" optie.
- Meet een hoek door eerst op in het midden van een markering, die grenst aan de marker gekozen voor een uiteinde van het lijnsegment.
- Vervolgens verplaatst u de muis naar het midden van de betreffende marker en klik nogmaals.
- Uitbreiding van de rubberen band lijn naar de buitenste rand van het INL.
- Pas de hoek tot 90 ° is bereikt.
- Links klik op de gewenste positie. Er verschijnt een dialoogvenster met een hoek meting juiste pop-up na de klik.
- Druk op de"Enter" toets terwijl u de muis nog steeds.
- Klik links op de tracing venster zodat een lijn getrokken van het ene eind naar het nieuwe geselecteerde einde.
- Klik met de rechtermuisknop in het opsporen en kies "End Open Contour".
- Trek de andere lijnen op verschillende posities op dezelfde wijze als hiervoor beschreven.
- Na het tekenen van alle lijnen, selecteert u de bewerken modus en dus de naam van de vier lijnstukken.
- Vier metingen kan worden verkregen door op de "Contour Measurement" knop.
- Selecteer deze 4 metingen en plakken in een spreadsheet door te klikken op "Kopiëren naar klembord".
- Selecteer "Opslaan als" onder het tabblad "Bestand". Het opsporen van gegevens kunnen worden opgeslagen als een bestand.
- Selecteer "Image Open" onder het tabblad "Bestand". Kies een afbeelding van een gewenste netvlies regio die u wilt analyseren.
- Kies het type van de contourlijn van het uitklapmenu van de Main Toolbar.
- Teken een contourlijn langs de grens van zenuwvezellaag (NFL).
- Beëindig het traceren met de optie "End Open Contour".
- Aan elk uiteinde, dient een marker op de punt van de lijn en een aan de positie bij de top.
- Schakel de marker icoon aan de marker werkbalk.
- Plaats een cursor in het midden van de markeringen op het uiteinde.
- Selecteer "Direct Meten Angle" onder het tabblad "Tools".
- Klik met de rechtermuisknop in het opsporen venster en deselecteer de "Continue" optie.
- Pas de rubber band lijnen en meet een hoek van 90 °.
- Druk op de "Enter" toets na een dialoogvenster is uitgeklapt.
- Klik met de linkermuisknop thij tracing venster zodat een nieuwe lijn kan loodrecht worden uitgebreid van de tip.
- Teken nog een nieuwe regel in precies dezelfde manier op een ander einde.
- Twee grenzen gecreëerd waarin het aantal RGC geteld.
- Kies een grens als een uitsluiting lijn die de cel raakt niet wordt geteld.
- Selecteer een type marker en daaraan een aan elke levende cel.
- Selecteer een ander type marker voor de dode cellen.
- Het aantal van elk type van de geplaatste markers wordt weergegeven naast de marker icoon hiervan bij de marker werkbalk.
- Selecteer de bewerkingsmodus en pak de contour baseline. Klik met de rechtermuisknop in het venster en het opsporen van de naam van de lijn.
- De lengte van de contour basislijn kan worden verkregen door op de "Contour Measurement" knop.
- Het aantal cellen kunnen daarna worden uitgedrukt per mm van de lengte.
- Selecteer "Opslaan als" onder het tabblad "Bestand". Detracering en de markering van gegevens kan worden opgeslagen als een gegevensbestand.
5. Het meten van de cel grootte van een RGC cel
- Selecteer "Image Open" onder het tabblad "Bestand". Kies een afbeelding van een gewenste netvlies regio die u wilt analyseren.
- Zoom in een levende cel en kies het type van de contourlijn van het uitklapmenu van de Main Toolbar.
- Teken een contourlijn langs de omtrek van de cel.
- Rond het einde met de rechtermuisknop op het opsporen en selecteer "End dicht contour".
- De oppervlakte van de cel wordt weergegeven onder de post van Area in de Contour Meting dialoogvenster.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
1. Hoe maak je een meer nauwkeurige dikte meting te verkrijgen?
U kunt het beeld vergroten door te klikken op "Zoom in" knop en de linker muisknop in het opsporen venster. De INL grens is duidelijk te zien. Als de tip van de lijn is niet aan de buitenste rand van het INL, kunnen we de lijn aan te passen onder de bewerkingsmodus. Na het plukken van de betrokken lijn met de rechtermuisknop op het opsporen en kies "Plaats Point in geselecteerde contour". Een punt kan worden toegevoegd aan de buitengrens, terwijl toegevoegd het punt zou moeten zijn langs dezelfde lijn. Dan moet je de oorspronkelijke punt te verwijderen en een lijn met een meer nauwkeurige lengte kan worden verkregen.
2. Hoe tot 90 ° van de rubberen band lijn te handhaven?
Na een dialoogvenster met de graad is opgedoken, moet u de muis stil te houden terwijl u de "Enter". Dan, links op de tracing venster, zodat een nieuwe lijn kan worden getrokken.
3. Hoe levende cellen en dode cel eruit?
Die cellen in een ruwweg ronde vorm met cytoplasma en de kern duidelijk waargenomen worden beschouwd als levende RGC. Die relatief kleine en gecondenseerde cellen worden beschouwd als dode cellen.
4. Die netvlies monsters werden ondergaan H & E kleuring in het huidige protocol. Is het mogelijk om het netvlies monster te meten met fluorescerende vlekken?
Ja. Hoewel de huidige protocol op de H & E kleuring retinale secties de retinale monster fluorescentiekleuring kan worden gemeten op dezelfde wijze. Bijvoorbeeld, zoals getoond in figuur 1 met DAPI kleuring, zal de kernen gekleurd en visueel blauw onder een 405 nm filter. Kernen in de retinale ganglion cellaag (RGCL), kan binnen de nucleaire laag (INL) en buitenste nucleaire laag (ONL) te zien. Dan de dikte van verschillende lagen worden gedetecteerd op soortgelijke wijze aangetoond in deze video.
Figuur 1.
Over de grootte van verschillende gekleurde TL-signalen, heeft onze fractie een artikel gepubliceerd met betrekking tot over de grootte van neuronen in de RGCL in een rat glaucoom model (Luo et al., 2009).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Het werk op het oog onderzoek in dit laboratorium wordt ondersteund door de Amerikaanse Health Assistant Foundation, Azalea (1972) Endowment Fund, en HKU fonds voor kleinschalige projecten (20097176185).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Stereo Investigator | MicroBright Field | ||
| Microscope | Olympus Corporation | BX51 |
References
- Lam, T. T., Abler, A. S., Tso, M. O. N-Methyl-D-Aspartate (NMDA)–Induced Apoptosis in Rat Retina. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 40, 2391-2397 (1999).
- Lam, T. T., Abler, A. S., Tso, M. O. Apoptosis and caspases after ischemia-reperfusion injury in rat retina. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 40, 967-975 (1999).
- Luo, X. G., Chiu, K., Lau, H. S., Lee, V. W. H., Yung, K. K. L., So, K. F. The Selective Vulnerability of Retinal Ganglion Cells in Rat Chronic Ocular Hypertension Model at Early Phase. Cellular and Molecular Neurobiology. 29 (8), 1143-1151 (2009).
- Han, Y. S., Chung, I. Y., Park, J. M., Yu, J. M. Neuroprotective effect of citicoline on retinal cell damage induced by kainic acid in rats. Korean J. Ophthalmol. 19, 219-226 (2005).
- Hernandez, M., Urcola, J. H. Retinal ganglion cell neuroprotection in a rat model of glaucoma following brimonidine, latanoprost or combined treatments. Exp. Eye Res. 86, 798-806 (2008).
- Chan, H. C., Chang, R. C. C., Ip, A. K. C., Chiu, K., Yuen, W. H., Zee, S. Y., So, K. F. Neuroprotective effects of Lycium barbarum Lynn on protecting retinal ganglion cells in an ocular hypertension model of glaucoma. Experimental Neurology. 203, 269-273 (2007).
