Summary
Videoen viser tre typer morfometriske analyse af nethinden, som omfatter måling af indre kernelag tykkelse, der kvantificerer antallet af retina-ganglieceller (rGCS) og måle størrelsen af rGCS. Teknikken kan tilbyde en enkel, men videnskabelig platform for morfometriske analyser.
Abstract
Morfometriske analyse af retinale afsnit er blevet anvendt i behandlingen af retinale sygdomme. For eksempel blev neuronale celler signifikant tabt i retina-ganglieceller lag (RGCL) i rottemodeller med N-methyl-D-aspartat (NMDA)-induceret excitotoksicitet 1 retinal iskæmi-reperfusionsskade 2 og glaukom 3. Reduktion af INL og indre netformige lag (IPL) tykkelser blev vendt med citicolin behandling rotter øjne underkastet kaininsyre-medieret glutamatexcitotoksicitet 4. Ændring af RGC tæthed og Soma størrelser blev observeret med forskellige medicinske behandlingsmetoder i øjnene med forhøjet intraokulært tryk 3,5,6. Derfor kan have objektive metoder til at analysere de retinale morphometries være af stor betydning ved vurderingen af retinale patologier og effektiviteten af terapeutiske strategier.
Den nethindestruktur er flere lag og flere forskellige typer af neuroner exist i nethinden. De morfometriske parametre retina, såsom celletal, cellestørrelse og tykkelsen af forskellige lag er mere kompleks end den cellekultursystem. Tidligt, kan disse parametre påvises ved hjælp af anden kommerciel imaging software. Værdierne er normalt af relative værdi, og der skiftes til den præcise værdi kan kræve yderligere nøjagtig beregning. Ligeledes kan sporing af cellestørrelsen og morfologi ikke er nøjagtig og følsom nok til statistisk analyse, især kronisk glaukom modellen. Målingerne, der bruges i denne protokol gav en mere præcis og nem måde. Og den absolutte længde af linien og størrelsen af cellen kan rapporteres direkte og let at blive kopieret til andre filer. For eksempel spores vi margen af den indre og ydre mest kerner i INL og dannede en linje derpå ved hjælp af software til at trække en 90 graders vinkel til at måle tykkelsen. Mens uden hjælp af softwaren, kan linjen måske skæve og skiftende af retinal tykkelsevære reproducerbar blandt individuelle observatører. Derudover kan antallet og densiteten af rGCS også kvantificeres. Denne protokol held reducerer variabiliteten i kvantificering træk ved nethinden, forøger følsomheden i detektion minimale ændringer.
Denne video vil vise tre typer morfometriske analyser af retinale sektioner. De omfatter måling af INL tykkelse, der kvantificerer antallet af rGCS og måle størrelsen af rGCS i absolut værdi. Disse tre analyser er udført med Stereo Investigator (MBF Bioscience - MicroBrightField, Inc.). Teknikken kan tilbyde en enkel, men videnskabelig platform for morfometriske analyser.
Protocol
1. Værktøj
Microscope, Nikon
Stereo Investigator, MBF Bioscience - MicroBrightField, Inc.
2. Forberedelse
- Før du arbejder på en morfometrisk analyse, er hver nethinden prøve sektioneret ved 4 micron tykkelse og gennemgår H & E farvning.
- Nethinden er delt i 4 regioner - øvre perifere område, det øvre centrale region, den nedre periferi, og den nedre centrale region.
- Efter de regioner, er et billede af hver region erhvervet på 10x40 forstørrelser under lys stråle mikroskop for Nikon.
- Nu er vi klar til at analysere morfometri af nethinden.
3. Måling INL tykkelse
- Fire målinger af INL tykkelse i hver region blev målt. Fire linier vil blive trukket vinkelret fra konturen basislinien til den ydre kant af INL.
- Åbn software kaldet Stereo Investigator og vælge 40x Lens fra Main Toolbar.
- Vælg "Image Open" under fanebladet "Filer". Vælg et billede af en ønsket retinal region, som du gerne vil analysere.
- Vælg den type af kontur linje fra Dropdown listen af Main Toolbar og tryk på "Auto Move" knappen.
- Højreklik i opsporingen vinduet, og vælg "Simple Klik Tracing".
- Trække kontur langs den indre kant af INL.
- Når tegningen er færdig, skal du højreklikke i opsporingen vinduet og vælge "End Open Contour".
- Vælg en markør på markør værktøjslinjen og tilføje markører ved knudepunkter.
- Når du har tilføjet alle de markører, fravælge markøren ikonet på Marker Toolbar.
- Placer en markør i centrum af en af de markører.
- Vælg "QuickMål Angle "under fanebladet" Tools ".
- Højreklik i opsporingen vindue og fravælge "Continuous" valgmulighed.
- Måle en vinkel ved først at klikke på midten af en markør, der er nabostillet til det markør udvalgt til en ende af liniesegment.
- Så flyt musen til midten af det pågældende mærke, og klik igen.
- Forlænge elastik linie til den ydre kant af INL.
- Juster vinklen til 90 ° er nået.
- Venstre klik på det ønskede position. En dialogboks viser en vinkel måling vil poppe op lige efter klikket.
- Tryk"Enter" tasten, mens du holder musen stille.
- Venstre klik på sporing vinduet, så en linje trukket fra den ene ende til den nye valgte ende.
- Højreklik i opsporingen vinduet og vælge "End Open Contour".
- Tegne de andre linier ved forskellige positioner på nøjagtig samme måde som beskrevet før.
- Efter at trække alle de linjer, skal du vælge Redigering mode og omdøbe de 4 linjesegmenter i overensstemmelse hermed.
- Fire målinger kan opnås ved at trykke "Contour Measurement"-knappen.
- Vælg disse 4 målinger og indsætte dem i et regneark ved at klikke på "Kopier til udklipsholder".
- Vælg "Gem som" under fanebladet "Filer". De sporing data kan gemmes som en datafil.
- Vælg "Image Open" under fanebladet "Filer". Vælg et billede af en ønsket retinal region, som du gerne vil analysere.
- Vælg den type af kontur linje fra Dropdown listen af Main Toolbar.
- Tegn en kontur langs grænsen af nerve fiber lag (NFL).
- Afslut sporing med mulighed for "End Open Contour".
- Ved hver ende, tilsættes en markør på spidsen af linien og en anden ved den position nær spidsen.
- Fravælg markøren ikonet på markør værktøjslinjen.
- Placer en markør i centrum af markører i spidsen.
- Vælg "Quick Measure Angle" under fanebladet "Tools".
- Højreklik i opsporingen vindue og fravælge "Continuous" valgmulighed.
- Juster elastik linjer og måle en vinkel på 90 °.
- Tryk på "Enter" efter en dialogboks dukkede op.
- Venstre klik than sporing vinduet, så en ny linje, kan vinkelret udvides fra spidsen.
- Tegn en anden ny linje i nøjagtig samme måde i den anden ende.
- To grænser skabes inden for hvilken antallet af rGCS tælles.
- Vælg en grænse som en udelukkelse linje, som de celle rører ikke tælles.
- Vælg en type af markør og vedlægge en til hver levende celle.
- Vælge en anden type markør for de døde celler.
- Antallet af hver type placerede markører vil blive vist ved siden af markøren ikonet tilsvarende i markør værktøjslinjen.
- Vælg redigeringstilstand og afhente konturen baseline. Højreklik i opsporingen vinduet og omdøbe linjen.
- Længden af konturen basislinje kan opnås ved at trykke "Contour Measurement"-knappen.
- Antallet af celler kan derefter udtrykkes pr mm af længden.
- Vælg "Gem som" under fanebladet "Filer". Densporing og markør data kan gemmes som en datafil.
5. Måling af cellestørrelse i en RGC celle
- Vælg "Image Open" under fanebladet "Filer". Vælg et billede af en ønsket retinal region, som du gerne vil analysere.
- Zoom i en levende celle og vælge den type af kontur linje fra Dropdown listen af Main Toolbar.
- Tegn en kontur langs omkredsen af cellen.
- Omkring slutningen, Højreklik opsporing vinduet og vælg "End tæt kontur".
- Det område af cellen vil blive vist under punktet af arealet i de Contour måling dialogboksen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
1. Sådan får du en mere præcis tykkelse måling?
Du kan forstørre billedet ved at klikke på "Zoom ind" knappen og venstre klik i opsporingen vinduet. Den INL kant ses tydeligt. Hvis spidsen af linien ikke er ved den ydre kant af INL, kan man justere linje under redigering tilstand. Efter picking den pågældende strækning, skal du klikke til højre opsporing vinduet og vælg "Indsæt Point i Valgte Contour". Et punkt kan tilføjes ved den ydre grænse, mens den ekstra punkt bør være langs den samme linie. Så skal du slette det oprindelige punkt og en linje med en mere præcis længde kan opnås.
2. Hvordan at opretholde 90 ° i elastikken linjen?
Efter en dialogboks viser graden springer op, skal du holde musen stille, mens du trykker på "Enter". Så forlod du klikke på sporing vinduet, så en ny linje kan tegnes.
3. Hvordan gør levende celler og døde calen ud?
Disse celler i en stort set rund form med cytoplasmaet og kernen klart observeret betragtes som levende rGCS. Disse forholdsvis små og kondenseret celler betragtes som døde celler.
4. Disse nethinden prøver blev gennemgået H & E farvning i den gældende protokol. Er det muligt at måle nethinden prøven med fluorescerende farvning?
Ja. De foreliggende protokol er på H & E farvning retinale sektioner, den retinale prøven med fluorescerende farvning kan også måle på samme måde. For eksempel som vist i figur 1 med DAPI-farvning, vil alle kernerne skal farves, og visualiseres blå under 405 nm filter. Kerner i retina-ganglieceller lag (RGCL), kan indre kernelag (INL) og ydre cellekernelag (ONL) ses. Derefter tykkelsen af forskellige lag kan detekteres på en lignende måde vist i denne video.
Figur 1.
Om størrelsen af forskellige fluorescerende signaler, har vores gruppe offentliggjort et dokument om om størrelsen af neuroner i RGCL i en rotte glaukom model (Luo et al, 2009).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at afsløre.
Acknowledgments
Arbejdet med øjet forskning på dette laboratorium er støttet af American Health Assistant Foundation, Azalea (1972) Endowment Fund, og HKU Small Project Fund (20097176185).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Stereo Investigator | MicroBright Field | ||
| Microscope | Olympus Corporation | BX51 |
References
- Lam, T. T., Abler, A. S., Tso, M. O. N-Methyl-D-Aspartate (NMDA)–Induced Apoptosis in Rat Retina. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 40, 2391-2397 (1999).
- Lam, T. T., Abler, A. S., Tso, M. O. Apoptosis and caspases after ischemia-reperfusion injury in rat retina. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 40, 967-975 (1999).
- Luo, X. G., Chiu, K., Lau, H. S., Lee, V. W. H., Yung, K. K. L., So, K. F. The Selective Vulnerability of Retinal Ganglion Cells in Rat Chronic Ocular Hypertension Model at Early Phase. Cellular and Molecular Neurobiology. 29 (8), 1143-1151 (2009).
- Han, Y. S., Chung, I. Y., Park, J. M., Yu, J. M. Neuroprotective effect of citicoline on retinal cell damage induced by kainic acid in rats. Korean J. Ophthalmol. 19, 219-226 (2005).
- Hernandez, M., Urcola, J. H. Retinal ganglion cell neuroprotection in a rat model of glaucoma following brimonidine, latanoprost or combined treatments. Exp. Eye Res. 86, 798-806 (2008).
- Chan, H. C., Chang, R. C. C., Ip, A. K. C., Chiu, K., Yuen, W. H., Zee, S. Y., So, K. F. Neuroprotective effects of Lycium barbarum Lynn on protecting retinal ganglion cells in an ocular hypertension model of glaucoma. Experimental Neurology. 203, 269-273 (2007).
