ניתוח Morphometric סעיפים רשתית

Summary

סרט זה מדגים שלושה סוגים של ניתוחים morphometric של הרשתית, אשר כוללים מדידת עובי השכבה הפנימית גרעינית, לכימות את מספר התאים הגנגליון ברשתית (RGCs) ומדידה של גדלים של RGCs. הטכניקה יכולה להציע פלטפורמה פשוטה אך מדעי ניתוחים morphometric.

Abstract

ניתוחים Morphometric סעיפים רשתית שימשו לבדיקת מחלות רשתית. לדוגמאות, תאים עצביים אבדו באופן משמעותי את שכבת התאים ברשתית גנגליון (RGCL) במודלים של עכברים עם N-methyl-D-aspartate (NMDA) הנגרמת excitotoxicity ^1, פגיעה ברשתית איסכמיה reperfusion ² ו ³ גלאוקומה. צמצום שכבת plexiform INL ופנימיים (IPL) עובי התהפכו עם טיפול citicoline בעיניים של חולדות נתון excitotoxicity חומצה בתיווך kainic גלוטמט ^4. שינוי של צפיפות RGC וגדלים סומה נצפו עם טיפולים תרופתיים שונים בעיניים עם לחץ תוך עיני גבוה ^3,5,6. לכן, לאחר שיטות אובייקטיביות של ניתוח ברשתית morphometries עשוי להיות בעל חשיבות רבה בהערכת מחלות רשתית ואת האפקטיביות של אסטרטגיות טיפוליות.

מבנה הרשתית היא מרובת שכבות סוגים שונים של נוירונים exiרחוב ברשתית. הפרמטרים morphometric של הרשתית כגון מספר תאים, גודל התא ועובי השכבות השונות הם מורכבים יותר מאשר מערכת תרבית תאים. מוקדם יותר, פרמטרים אלה ניתן לאתר באמצעות הדמיה אחרות תוכנה מסחרית. הערכים הם בדרך כלל בעל ערך יחסית, ושינוי הערך המדויק ייתכן שיהיה צורך בחישוב מדויק יותר. כמו כן, מעקב של גודל התא ומורפולוגיה לא יכול להיות מדויק ורגיש מספיק לניתוח סטטיסטי, במיוחד במודל גלאוקומה כרונית. המדידות בשימוש בפרוטוקול זה בתנאי דרך מדויקת יותר וקלה. אורך מוחלט של הקו ואת גודל התא ניתן לדווח ישירות קל להעתיק את הקבצים האחרים. לדוגמה, אנו לייחס את השוליים של גרעינים ביותר פנימית וחיצונית של INL ויצרו קו ואז באמצעות התוכנה לצייר זווית של 90 מעלות כדי למדוד את עובי. אמנם ללא עזרה של תוכנות, קו אלכסוני אולי ואת המשתנה של עובי הרשתית רשאילא יהיה הדיר בקרב צופים בודדים. בנוסף, מספר וצפיפות RGCs ניתן לכמת. פרוטוקול זה בהצלחה מקטין משונות quantitating התכונות של הרשתית, מעלה את הרגישות באיתור שינויים מינימליים.

סרט זה יהיה להדגים שלושה סוגים של ניתוחים morphometric של חלקים ברשתית. הם כוללים מדידת עובי INL, לכמת את מספר RGCs ומדידה של גדלים של RGCs בערך מוחלט. שלושת הניתוחים מבוצעים עם החוקר סטריאו (MBF Bioscience - MicroBrightField, Inc). הטכניקה יכולה להציע פלטפורמה פשוטה אך מדעי ניתוחים morphometric.

Protocol

1. כלים

, מיקרוסקופ Nikon

החוקר סטריאו, MBF Bioscience - MicroBrightField, Inc

2. הכנה

1. לפני העבודה על ניתוח כל morphometric, כל דגימה הרשתית מחולק על עובי 4 מיקרון ו עובר מכתים H & E.
2. סעיף הרשתית מחולקת ל -4 אזורים - האזור היקפי העליון, אזור המרכז העליון, באזור הפריפריה נמוך יותר, באזור המרכז נמוך יותר.
3. לאחר הגדרת אזורים, תמונה של כל אזור נרכש בהגדלה 10x40 במיקרוסקופ קרן בהירה של ניקון.
4. עכשיו, אנחנו מוכנים לנתח morphometry של הרשתית.

3. מדידת עובי INL

1. ארבע מדידות של עובי INL בכל אזור נמדדו. ארבע שורות יצויר בניצב מתחילת המחקר מתאר את הגבול החיצוני של INL.
2. פתח את תוכנה בשם החוקר סטריאו ולבחור עדשה 40X מסרגל הכלים הראשי.
3. בחר "פתח תמונה" תחת "קובץ" הכרטיסייה. בחרו תמונה של האזור ברשתית הרצוי שאתה רוצה לנתח.
4. בחר את סוג קו קונטור מתיבת הרשימה הנפתחת של סרגל הכלים הראשי, לחץ על "העברה אוטומטית" כפתור.
5. קליק ימני בחלון מעקב, ובחר "לחץ האיתור פשוט".
6. צייר קו מתאר לאורך הגבול הפנימי של INL.
7. כאשר הציור נעשה, קליק ימני בחלון מעקב ובחר "קונטור סוף פתוח".
8. בחר הסמן על סרגל הכלים של הסמן ולהוסיף סמנים על נקודות צומת.
9. לאחר הוספת כל סמנים, בטל את הסמל הסמן על סרגל הכלים של דה מרקר.
10. מקמו את הסמן במרכז אחת המצבות.

11. בחר "מהרגודל זוויות "תחת הלשונית" כלים ".

12. קליק ימני בחלון באיתור בטלו את הבחירה באפשרות "רציף".
13. למדוד את הזווית על ידי לחיצה על 1 במרכז סמן, אשר נמצא סמוך סמן נבחר בסופו של קטע הקו.

14. לאחר מכן, להזיז את העכבר אל מרכז סמן מודאג ולחץ שוב.
15. להאריך את הגומייה קו הגבול החיצוני של INL.
16. התאם את הזווית עד 90 מעלות הוא הגיע.

17. עזבו לחץ במיקום הרצוי. תיבת דו שיח המודיעה על מדידת זווית יופיע מיד אחרי לחץ.
18. לחצו על מקש "Enter" תוך כדי לחיצה על העכבר עדיין.

19. שמאל לחץ על חלון העקיבה כך נמשך קו מקצה אחד לקצה הנבחר החדש.
20. קליק ימני בחלון המעקב ולבחור "קונטור סוף פתוח".

21. לצייר את הקווים אחרים עמדות שונות בדיוק באותו אופן כפי שתואר קודם לכן.
22. לאחר ציור כל הקווים, בחר את מצב עריכה לשנות את שמות 4 מקטעי קו בהתאם.
23. ארבע מידות ניתן להשיג על ידי לחיצה על "קונטור מדידה" כפתור.
24. בחר את 4 מדידות ולהדביק אותם לגיליון אלקטרוני על ידי לחיצה על "העתק ללוח".
25. בחר באפשרות "שמירה בשם" תחת "קובץ" הכרטיסייה. נתוני מעקב ניתן לשמור כקובץ נתונים.

ss = "jove_title"> 4. כימות מספר RGCs

1. בחר "פתח תמונה" תחת "קובץ" הכרטיסייה. בחרו תמונה של האזור ברשתית הרצוי שאתה רוצה לנתח.
2. בחר את סוג קו קונטור מתיבת הרשימה הנפתחת של סרגל הכלים הראשי.
3. צייר קו מתאר לאורך הגבול של שכבת העצבים סיבים (NFL).
4. לסיים את המעקב עם "קונטור סוף פתוח" אפשרות.
5. בכל קצה, להוסיף 1 הסמן בקצה הקו ועוד במיקום הקרוב עצה.
6. בטלו את הבחירה על סמל סמן על סרגל הכלים של הסמן.
7. מקמו את הסמן במרכז סמנים בקצה.
8. בחר "זווית מדידה מהירה" תחת "הגדרות" הכרטיסייה.
9. קליק ימני בחלון באיתור בטלו את הבחירה באפשרות "רציף".
10. התאם את הלהקה קווי גומי למדוד זווית של 90 מעלות.
11. לחצו על מקש "Enter" לאחר תיבת הדו שיח הוא צץ.
12. השמאל לחץ tהוא התחקות החלון כך קו חדש ניתן להרחיב בניצב מקצה.
13. צייר קו נוסף חדש בצורה בדיוק בקצה השני.
14. שני הגבולות נוצרים שבתוכה מספר RGCs נספר.
15. בחר 1 הגבול כקו הרחקה אשר נוגע סלולריים לא נספר.
16. בחר סוג אחד של הסמן ולצרף 1 לכל תא חי.
17. בחר סוג אחר של סמן את התאים המתים.
18. המספר של כל סוג של סמנים להציב יוצג לצד סמל סמן בהתאם את סרגל הכלים של הסמן.
19. בחר את המצב עריכה להרים את המחקר מתאר. קליק ימני בחלון באיתור לשנות את הקו.
20. אורכו של קו הבסיס מתאר ניתן להשיג על ידי לחיצה על "קונטור מדידה" כפתור.
21. מספר התאים יכולים לבוא לידי ביטוי לכל מ"מ אורך.
22. בחר באפשרות "שמירה בשם" תחת "קובץ" הכרטיסייה.באיתור סמן הנתונים ניתן לשמור כקובץ נתונים.

5. מדידת גודל התא של תא RGC

1. בחר "פתח תמונה" תחת "קובץ" הכרטיסייה. בחרו תמונה של האזור ברשתית הרצוי שאתה רוצה לנתח.
2. זום בתא חי לבחור את סוג קו קונטור מתיבת הרשימה הנפתחת של סרגל הכלים הראשי.
3. צייר קו מתאר לאורך ההיקף של התא.
4. בסביבות סוף, קליק ימני בחלון מעקב ובחר "מיתאר סוף סגור".
5. השטח של התא יוצג בסעיף של שטח בתיבת מדידה קונטור שיח.

Discussion

1. כיצד לקבל מדידה מדויקת יותר עובי?

ניתן להגדיל את התמונה על ידי לחיצה על "קרב" על והשאיר לחץ בחלון העקיבה. הגבול INL ניתן לראות בבירור. אם קצה של הקו לא על הגבול החיצוני של INL, אנו יכולים להתאים את קו תחת מצב עריכה. לאחר בחירת קו הנוגעים בדבר, קליק ימני בחלון באיתור לבחור "הוספת טעם קונטור נבחר". נקודת ניתן להוסיף בגבול החיצוני בעוד נקודת הוסיף צריך להיות יחד באותה שורה. לאחר מכן, אתה צריך למחוק את הנקודה המקורי בקנה אחד עם אורך מדויק יותר ניתן להשיג.

2. איך לשמור על 90 מעלות של הקו את הגומייה?

אחרי תיבת דו שיח המודיעה תואר הוא צץ, אתה צריך להחזיק את העכבר עדיין תוך כדי לחיצה על מקש "Enter". לאחר מכן, עזב לחץ על חלון מעקב, כך הקו החדש ניתן להסיק.

3. כיצד תאים חיים ו-C מתיםאמות נראה?

תאים אלה בצורה עגולה בערך עם הציטופלסמה לבין הגרעין ציין בבירור נחשבים RGCs חיים. תאים אלה קטנים comparably מרוכז נחשבים תאים מתים.

4. דגימות אלה היו רשתית עבר H & E מכתים בפרוטוקול הנוכחי. האם ניתן למדוד את המדגם הרשתית עם כתמים ניאון?

כן. אף על פי הפרוטוקול הנוכחי הוא על H & E מכתים סעיפים רשתית, רשתית מדגם ניאון עם כתמים ניתן גם למדוד את אותו הדבר. לדוגמה, כפי שמוצג באיור 1 באמצעות מכתים DAPI, כל הגרעינים יהיה מוכתם כחול דמיינו בצבע תחת מסנן 405 ננומטר. גרעינים של שכבת תאים ברשתית גנגליון (RGCL), שכבת הגרעין הפנימית (INL) שכבת הגרעין החיצוני (ONL) ניתן לראות. אז עובי של שכבות שונות ניתן לאתר באופן דומה הראו בסרט הזה.

באיור 1.

בערך בגודל של אותות שונים ניאון צבעונית, הקבוצה פרסמה נייר בנוגע בערך בגודל של נוירונים RGCL ב עכברוש גלאוקומה המודל (לואו et al, 2009).

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Stereo Investigator		MicroBright Field
Microscope		Olympus Corporation	BX51