Summary
Это видео демонстрирует три типа морфометрических анализ сетчатки, которые включают в себя измерение внутренней ядерной толщины слоя, количественной количество ганглиозных клеток сетчатки (РГК) и измерения размеров РГК. Этот метод может предложить простой, но научная платформа для морфометрического анализа.
Abstract
Морфометрические анализы сетчатки раздела были использованы при изучении заболеваний сетчатки. Для примера, нервных клеток были значительно потеряли в сетчатке слой ганглиозных клеток (RGCL) у крыс модели с N-метил-D-аспартата (NMDA)-индуцированной токсичности 1, сетчатки ишемии травмы 2 и глаукома 3. Сокращение INL и внутренний слой плексиформные (IPL) толщиной были отменены с цитиколина лечение в глаза крыс подвергали каиновой кислоты глутамат-опосредованной токсичности 4. Изменение плотности РГК и размеров сома наблюдаются различные лекарств в глаз повышенного внутриглазного давления 3,5,6. Поэтому, имея объективных методов анализа сетчатки morphometries может иметь большое значение в оценке патологии сетчатки и эффективность терапевтических стратегий.
Сетчатки структуры многослойной и различные виды нейронов Exiм в сетчатке. Морфометрических параметров сетчатки, таких как сотовые номера, размера ячейки и толщины различных слоев являются более сложными, чем система клеточной культуры. Ранее эти параметры могут быть обнаружены с помощью других коммерческих программ обработки изображений. Значения, как правило, относительной стоимости, а также изменения к точному значению, возможно, потребуется дальнейшее точный расчет. Кроме того, отслеживание размера и морфологии клетки не могут быть точными и достаточно чувствительным для статистического анализа, особенно в хронической модели глаукомы. Измерения, используемые в настоящем протоколе обеспечивает более точный и простой способ. И абсолютная длина линии и размер клетки могут быть представлены непосредственно и легко быть скопированы на другие файлы. Например, мы проследили краю внутренней и внешней большинства ядер в INL и образовали линии, то с помощью программного обеспечения сделать 90 градусов для измерения толщины. Хотя без помощи программного обеспечения, линия может быть косой и изменение толщины сетчатки можетне должно быть повторяющихся между отдельными наблюдателями. Кроме того, количество и плотность РГК также могут быть определены количественно. Этот протокол успешно снижает вариабельность количественного функции сетчатки, повышает чувствительность выявления минимальных изменений.
Это видео покажет три вида морфометрических анализ сетчатки разделов. Они включают в себя измерение толщины INL, количественного числа РГК и измерения размеров РГК по абсолютной величине. Эти три анализы проводятся с Stereo следователь (ФМС Bioscience - MicroBrightField, Inc.) Этот метод может предложить простой, но научная платформа для морфометрического анализа.
Protocol
1. Инструменты
Микроскоп, Nikon
Stereo следователь, ФМС Bioscience - MicroBrightField, Inc
2. Подготовка
- Перед началом работы на любом морфометрического анализа, каждый образец сетчатки подразделяется на 4 мкм толщины и подвергается H & E окрашивания.
- Сетчатка разделен на 4 области - верхняя периферийной области, верхней центральной области, тем меньше периферийной области, а нижняя центральная область.
- После определения регионов, образ каждого региона приобретается на 10х40 увеличении под микроскопом яркий луч Nikon.
- Теперь мы готовы проанализировать морфометрии сетчатки.
3. Измерение толщины INL
- Четыре измерения INL толщину в каждом регионе были измерены. Четыре линии будут нарисованы перпендикулярно от контура базовой линии до внешней границы INL.
- Откройте программное обеспечение под названием Stereo следователя и выбрать 40x объектив с главной панели инструментов.
- Выберите "Изображение Open" на вкладке "Файл". Выберите образ желаемого сетчатки область, которую вы хотели бы проанализировать.
- Выберите тип линии контура из выпадающего списка на главной панели инструментов и нажмите кнопку "Auto Move" кнопки.
- Щелкните правой кнопкой мыши в окне трассировки и выберите "Просто нажмите трассировка".
- Нарисуйте контур линии вдоль внутренней границы INL.
- Когда рисунок будет сделано, щелкните правой кнопкой мыши в отслеживании окна и выберите "End открытого контура".
- Выберите маркер на маркер панели инструментов и добавить маркеры на точки соединения.
- После добавления всех маркеров, снять маркер значок на панели маркеров.
- Поместите курсор в центр одного из маркеров.
- Выберите "БыстрыйИзмерьте угол "на вкладке" Сервис ".
- Щелкните правой кнопкой мыши в окне трассировки и отменить "Непрерывный" вариант.
- Измерьте угол, щелкнув сначала в центре маркера, который находится рядом с маркером, отобранных для конца отрезка.
- Затем переместите мышь в центр соответствующего маркера и нажмите еще раз.
- Расширение линии резинкой на внешней границе INL.
- Отрегулируйте угол наклона до 90 °, будет достигнута.
- Левый клик в нужном месте. Диалоговое окно измерения угла появится сразу после клика.
- Нажмите"Enter", удерживая мышь до сих пор.
- Щелкните левой кнопкой мыши отслеживания окна так, чтобы линия от одного конца к новому выбранной цели.
- Щелкните правой кнопкой мыши в отслеживании окна и выберите "End открытого контура".
- Нарисуйте других линий на различных должностях в точности так же, как описано выше.
- После нанесения всех линиях, выберите режим редактирования и переименовать 4 отрезков соответственно.
- Четыре измерения можно получить, нажав кнопку "Контур измерения" кнопку.
- Выберите эти 4 измерения и вставить их в таблицу, нажав кнопку "Копировать в буфер обмена".
- Выберите пункт "Сохранить как" на вкладке "Файл". Отслеживание данных могут быть сохранены в виде файла данных.
- Выберите "Изображение Open" на вкладке "Файл". Выберите образ желаемого сетчатки область, которую вы хотели бы проанализировать.
- Выберите тип линии контура из выпадающего списка на главной панели инструментов.
- Нарисуйте контур линии вдоль границы слоя нервных волокон (NFL).
- Завершить трассировку с опцией "End открытого контура".
- На каждом конце добавить один маркер на кончик линии, а другой на позиции вблизи вершины.
- Снимите маркером значок на панели маркеров.
- Поместите курсор в центр маркеры на концах.
- Выберите "Быстрый угловой меры" на вкладке "Сервис".
- Щелкните правой кнопкой мыши в окне трассировки и отменить "Непрерывный" вариант.
- Настройка линии резинкой и измерить угол 90 °.
- Нажмите клавишу "Ввод" после того, как диалоговое окно выскочил.
- Щелкните левой кнопкой мыши тОн отслеживания окна так, чтобы новая линия может быть продлен перпендикулярно от вершины.
- Нарисуйте еще одну новую строку в точно так же на другом конце.
- Две границы создаются в которых число считается РГК.
- Выберите один границы как исключение линии, которая касается клетки не учитывается.
- Выберите один тип маркера и прикрепить по одному на каждую живую клетку.
- Выберите другой тип маркера для мертвых клеток.
- Количество каждого типа маркеров размещены будет отображаться рядом с маркером значок соответственно на маркер панели инструментов.
- Выберите режим редактирования и забрать контур линии. Щелкните правой кнопкой мыши в окне трассировки и переименовать линию.
- Длина контура исходной информации может быть получен путем нажатия кнопки "Контур измерения" кнопку.
- Количество ячеек может быть выражена в мм длины.
- Выберите пункт "Сохранить как" на вкладке "Файл".отслеживание и маркер данные могут быть сохранены в виде файла данных.
5. Измерение размера ячейки в ячейку RGC
- Выберите "Изображение Open" на вкладке "Файл". Выберите образ желаемого сетчатки область, которую вы хотели бы проанализировать.
- Увеличить в живой клетке и выберите тип контура линии из выпадающего списка на главной панели инструментов.
- Нарисуйте контур линии вдоль окружности клетки.
- Примерно в конце концов, щелкните правой кнопкой мыши отслеживания окна и выберите "Конец близко контуру".
- Площадь ячейки будут отображаться в соответствии с пунктом района в диалоговом окне измерений контура.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
1. Как получить более точное измерение толщины?
Вы можете увеличить изображение, нажав кнопку "Увеличить" и щелкните левой кнопкой мыши в окне трассировки. INL границы хорошо видно. Если кончик линии, не на внешней границе INL, мы можем корректировать линию в режим редактирования. После выбора соответствующего линии, щелкните правой кнопкой мыши отслеживания окна и выберите "Вставить точку в отдельных Контур". Точки могут быть добавлены на внешней границе, а точка добавил должны быть на одной линии. Затем, вы должны удалить исходные точки и линии с более точной длины могут быть получены.
2. Как сохранить 90 ° линии резинкой?
После того, как диалоговое окно показывает степень выскочил, вы должны держать мышь по-прежнему удерживая нажатой клавишу "Ввод". Затем щелкните левой кнопкой мыши отслеживания окна так, чтобы новая линия может быть обращено.
3. Как живые клетки и мертвые слоктя выглядеть?
Эти клетки в примерно круглой формы с цитоплазмой и ядром четко прослеживается считаются живыми РГК. Эти сравнительно небольшие и конденсированных клетки считаются мертвыми клетками.
4. Те, сетчатка образцы подверглись H & E окрашивания в текущем протоколе. Можно ли измерить сетчатки образца с флуоресцентной окраски?
Да. Хотя текущий протокол о H & E окрашивания сетчатки разделов, образец сетчатки флуоресцентного окрашивания можно измерять так же. Например, как показано на рисунке 1 с использованием DAPI окрашивания, все ядра будут окрашенных и визуализировать синего цвета при 405 нм фильтра. Ядра в сетчатке слой ганглиозных клеток (RGCL), внутренний ядерный слой (INL) и наружный ядерный слой (ONL) можно увидеть. Тогда толщины различных слоев могут быть обнаружены таким же образом, показано в этом видео.
Рисунок 1.
О размерах различных окрашенных флуоресцентные сигналы, наша группа опубликовала документ, касающийся размером нейронов в RGCL в крысу глаукома модели (луо и др., 2009).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего раскрывать.
Acknowledgments
Работа над глазом исследования в этой лаборатории поддерживается American Health Foundation помощник, Азалия (1972), благотворительный фонд, и Фонд поддержки малого HKU проекта (20097176185).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Stereo Investigator | MicroBright Field | ||
| Microscope | Olympus Corporation | BX51 |
References
- Lam, T. T., Abler, A. S., Tso, M. O. N-Methyl-D-Aspartate (NMDA)–Induced Apoptosis in Rat Retina. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 40, 2391-2397 (1999).
- Lam, T. T., Abler, A. S., Tso, M. O. Apoptosis and caspases after ischemia-reperfusion injury in rat retina. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 40, 967-975 (1999).
- Luo, X. G., Chiu, K., Lau, H. S., Lee, V. W. H., Yung, K. K. L., So, K. F. The Selective Vulnerability of Retinal Ganglion Cells in Rat Chronic Ocular Hypertension Model at Early Phase. Cellular and Molecular Neurobiology. 29 (8), 1143-1151 (2009).
- Han, Y. S., Chung, I. Y., Park, J. M., Yu, J. M. Neuroprotective effect of citicoline on retinal cell damage induced by kainic acid in rats. Korean J. Ophthalmol. 19, 219-226 (2005).
- Hernandez, M., Urcola, J. H. Retinal ganglion cell neuroprotection in a rat model of glaucoma following brimonidine, latanoprost or combined treatments. Exp. Eye Res. 86, 798-806 (2008).
- Chan, H. C., Chang, R. C. C., Ip, A. K. C., Chiu, K., Yuen, W. H., Zee, S. Y., So, K. F. Neuroprotective effects of Lycium barbarum Lynn on protecting retinal ganglion cells in an ocular hypertension model of glaucoma. Experimental Neurology. 203, 269-273 (2007).
