Summary
هذا الفيديو يشرح ثلاثة أنواع من التحليلات المورفومترية من شبكية العين، والتي تشمل قياس سماكة طبقة داخلية النووية، قياس عدد خلايا الشبكية العقدة (الأوقات تستخدم GMT) وقياس الأحجام من الأوقات تستخدم GMT. لا يمكن للتقنية يقدم منصة بسيطة ولكنها علمية لتحليل المورفومترية.
Abstract
وقد استخدمت تحليلات المورفومترية من أقسام الشبكية في دراسة أمراض شبكية العين. فعلى سبيل المثال، قد فقدت كثيرا الخلايا العصبية في طبقة الخلايا العقدية للشبكية (RGCL) في نماذج الفئران مع N-ميثيل مد اسبارتاتي (NMDA) التي يسببها excitotoxicity 1، الشبكية الإسكيمية-ضخه الاصابة (2) والزرق 3. الحد من طبقة ضفيري INL والداخلي (IPL) سمك تم عكس العلاج citicoline في أعين الفئران تعرض لkainic excitotoxicity جلتاميت حامض بوساطة 4. ولوحظ تغيير في كثافة RGC والأحجام سوما مع العلاجات الدوائية المختلفة في عيون مع ارتفاع ضغط العين 3،5،6. لذلك، قد تواجه وسائل موضوعية لتحليل morphometries شبكية العين تكون ذات أهمية كبيرة في تقييم أمراض شبكية العين، ومدى فعالية الاستراتيجيات العلاجية.
بنية شبكية العين هي متعددة الطبقات وعدة أنواع مختلفة من الخلايا العصبية EXIش في شبكية العين. المعلمات المورفومترية من شبكية العين مثل عدد الخلايا، وحجم الخلية وسمك طبقات مختلفة هي أكثر تعقيدا من خلية نظام الثقافة. في وقت مبكر، ويمكن الكشف عن هذه المعلمات باستخدام برامج أخرى من التصوير التجاري. القيم هي عادة من القيمة النسبية، وتغيير لقيمة دقيق قد تحتاج حساب مزيد من الدقة. أيضا، قد تتبع من حجم الخلية والصرف لا تكون دقيقة وحساسة بما يكفي للتحليل الإحصائي، وخصوصا في نموذج الزرق المزمن. قدمت القياسات المستخدمة في هذا البروتوكول على نحو أكثر دقة وسهولة. ويمكن ذكرت وطول مطلقة من خط وحجم الخلية مباشرة وسهلة ليتم نسخها إلى ملفات أخرى. على سبيل المثال، تعود علينا هامش الأنوية الداخلية والخارجية الأكثر خطورة في INL وشكل خط ثم استخدام البرنامج لرسم زاوية 90 درجة لقياس سماكة. في حين من دون مساعدة من البرنامج، خط مائل ربما وتغيير سمك شبكية العين قدلا تكون قابلة للتكرار بين المراقبين الفردية. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن أيضا أن عدد وكثافة الأوقات تستخدم GMT يكون كميا. هذا البروتوكول يقلل بنجاح التغير في ملامح quantitating من شبكية العين، ويزيد من حساسية في الكشف عن تغيرات طفيفة.
وهذا الفيديو شرح ثلاثة أنواع من التحليلات المورفومترية من المقاطع في شبكية العين. وهي تشمل قياس سماكة INL، قياس عدد من الأوقات تستخدم GMT وقياس الأحجام من الأوقات تستخدم GMT في القيمة المطلقة. وتجرى هذه التحليلات مع ثلاثة من أصل محقق ستيريو (MBF العلوم البيولوجية - MicroBrightField، وشركة). لا يمكن للتقنية يقدم منصة بسيطة ولكنها علمية لتحليل المورفومترية.
Protocol
1. أدوات
مجهر، نيكون
ستيريو محقق، MBF العلوم البيولوجية - MicroBrightField، وشركة
2. إعداد
- قبل ان يعمل على أي تحليل المورفومترية، كل عينة شبكية العين هو مقطوع في سماكة ميكرون (4) ويخضع لتلطيخ H & E.
- وينقسم هذا الباب إلى شبكية العين 4 مناطق - المنطقة المحيطية العليا، والمنطقة العليا الوسطى، وانخفاض منطقة هامشية، وانخفاض المنطقة الوسطى.
- بعد تحديد المناطق، ويتم الحصول على صورة من كل منطقة في تكبير 10x40 تحت المجهر شعاع مشرق من نيكون.
- الآن، نحن على استعداد لتحليل قياس الأشكال في شبكية العين.
3. قياس سماكة INL
- تم قياس أربع قياسات سماكة INL في كل منطقة. وسيتم اختيار أربعة خطوط عموديا من خط الأساس كفاف إلى الحدود الخارجية للINL.
- فتح البرمجيات ودعا محقق ستيريو واختيار عدسة 40X من شريط الأدوات الرئيسي.
- حدد "فتح صورة" تحت عنوان "ملف" التبويب. اختيار صورة من منطقة الشبكية المطلوبة التي ترغب في تحليلها.
- اختيار نوع خط كفاف من مربع قائمة منسدلة من شريط الأدوات الرئيسي ثم اضغط على "نقل السيارات" الزر.
- انقر على الحق في إطار البحث عن المفقودين، وحدد "بسيط للبحث عن المفقودين كليك".
- رسم خط كفاف على طول الحدود الداخلية للINL.
- عند الانتهاء من الرسم، انقر على الحق في إطار البحث عن المفقودين واختيار "كونتور النهاية المفتوحة".
- تحديد علامة على شريط الأدوات علامة وإضافة علامات عند نقاط تقاطع.
- بعد إضافة كافة علامات، وإلغاء رمز علامة في شريط الأدوات ماركر.
- وضع المؤشر في وسط واحدة من العلامات.
- حدد "سريعةقياس زاوية "تحت علامة التبويب" أدوات ".
- انقر على الحق في إطار البحث عن المفقودين وإلغاء تحديد "مستمر" الخيار.
- قياس زاوية بالضغط للمرة الأولى في مركز للعلامة، والذي هو المتاخمة للعلامة اختيار لوضع حد للجزء خط.
- ثم، حرك الماوس إلى مركز للعلامة المعنية وانقر مرة أخرى.
- تمديد خط الشريط المطاطي على الحدود الخارجية للINL.
- ضبط زاوية حتى يتم التوصل إلى 90 درجة.
- غادر انقر على الموضع المطلوب. سوف يظهر مربع حوار يظهر قياس زاوية يطفو على السطح مباشرة بعد نقرة.
- اضغط على مفتاح "Enter" في حين الضغط على الماوس لا يزال.
- غادر فوق إطار تتبع بحيث يتم رسم خط واحدة من نهاية إلى نهاية المحدد جديد.
- انقر على الحق في إطار البحث عن المفقودين واختيار "كونتور النهاية المفتوحة".
- رسم خطوط أخرى في مواقع مختلفة في بنفس الطريقة تماما كما هو موضح من قبل.
- بعد رسم كل الخطوط، حدد وضع تحرير وإعادة تسمية قطاعات السطر 4 وفقا لذلك.
- ويمكن الحصول على أربعة قياسات عن طريق الضغط على "كونتور القياس" الزر.
- حدد هذه القياسات 4 و لصقها إلى جدول بالنقر على "نسخ إلى الحافظة".
- حدد "حفظ باسم" في ظل "ملف" التبويب. ويمكن حفظ البيانات تتبع كملف بيانات.
ق ق = "jove_title"> 4. قياس عدد من الأوقات تستخدم GMT
- حدد "فتح صورة" تحت عنوان "ملف" التبويب. اختيار صورة من منطقة الشبكية المطلوبة التي ترغب في تحليلها.
- اختيار نوع خط كفاف من مربع قائمة منسدلة من شريط الأدوات الرئيسي.
- رسم خط كفاف على طول الحدود بين طبقة الألياف العصبية (NFL).
- وضع حد للبحث عن المفقودين مع "النهاية المفتوحة كونتور" الخيار.
- في كل نهاية، إضافة واحد علامة على غيض من خط وآخر في موقف بالقرب من الحافة.
- إلغاء رمز علامة علامة في شريط الأدوات.
- وضع المؤشر في وسط علامات على معلومات سرية.
- حدد "زاوية التدبير السريع" تحت عنوان "أدوات" في علامة التبويب.
- انقر على الحق في إطار البحث عن المفقودين وإلغاء تحديد "مستمر" الخيار.
- ضبط خطوط الشريط المطاطي وقياس زاوية 90 درجة.
- اضغط على مفتاح "Enter" بعد برزت مربع حوار يصل.
- اليسار فوق تيهو البحث عن المفقودين نافذة بحيث يمكن تمديد خط جديد عموديا من غيض.
- رسم خط آخر جديد في الطريق نفسه بالضبط في نهاية آخر.
- يتم إنشاء اثنين من ضمن الحدود التي يتم احتساب عدد الأوقات تستخدم GMT.
- اختيار واحد على خط الحدود والإقصاء الذي لا يحسب اللمسات الخلية.
- تحديد نوع واحد من علامة ونعلق واحد إلى كل خلية حية.
- حدد نوع آخر من علامة للحصول على الخلايا الميتة.
- سيتم عرض عدد من كل نوع من العلامات وضعت جنبا إلى جنب مع رمز علامة وفقا لذلك في شريط الأدوات علامة.
- حدد وضع التحرير والتقاط خط الأساس كفاف. انقر على الحق في إطار البحث عن المفقودين وإعادة تسمية خط.
- ويمكن الحصول على طول خط الأساس كفاف عن طريق الضغط على "كونتور القياس" الزر.
- ويمكن بعد ذلك في عدد من الخلايا يمكن التعبير عنها لكل ملم من طول.
- حدد "حفظ باسم" في ظل "ملف" التبويب. وويمكن حفظ البيانات والبحث عن المفقودين علامة كملف بيانات.
5. قياس حجم الخلية من خلية RGC
- حدد "فتح صورة" تحت عنوان "ملف" التبويب. اختيار صورة من منطقة الشبكية المطلوبة التي ترغب في تحليلها.
- التكبير في خلية حية، واختيار نوع خط كفاف من مربع قائمة منسدلة من شريط الأدوات الرئيسي.
- رسم خط كفاف على طول محيط الخلية.
- في حوالي نهاية المطاف، انقر على الحق في إطار البحث عن المفقودين وتحديد "كفاف نهاية قريبة".
- وسيتم عرض منطقة الخلية في إطار هذا البند من المنطقة في مربع الحوار كونتور القياس.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
1. كيفية الحصول على قياس سماكة أكثر دقة؟
يمكنك تكبير الصورة بالنقر على "تكبير" زر وتركت فوق في إطار البحث عن المفقودين. يمكن النظر إلى الحدود INL بوضوح. إذا غيض من خط ليست على الحدود الخارجية للINL، لا يمكننا ضبط خط تحت وضع التحرير. بعد حصوله على خط العلاقة، انقر على الحق في إطار البحث عن المفقودين واختيار "إدراج نقطة في محيط مختارة". يمكن إضافة نقطة على الحدود الخارجية في حين أن نقطة وأضاف يجب أن يكون على طول الخط نفسه. ثم، لديك لحذف نقطة الأصلي ويمكن الحصول على خط يبلغ طوله أكثر دقة.
2. كيفية الحفاظ على 90 درجة من خط المطاط الفرقة؟
بعد برزت مربع حوار يظهر درجة أعلى، لديك لعقد الماوس في حين لا يزال الضغط على مفتاح "Enter". ثم غادر فوق إطار تتبع بحيث يمكن رسم خط جديد.
3. كيف الخلايا الحية وج الميتells تبدو وكأنها؟
وتعتبر تلك الخلايا في شكل دائري تقريبا مع السيتوبلازم والنواة لوحظ بوضوح في جميع الأوقات تستخدم GMT الحية. وتعتبر تلك الخلايا الصغيرة نسبيا ومكثف والخلايا الميتة.
4. وقد خضعت تلك العينات شبكية العين H & E تلطيخ في البروتوكول الحالي. هل من الممكن لقياس عينة شبكية العين مع تلطيخ الفلورسنت؟
نعم. على الرغم من أن بروتوكول الحالي على H & E تلطيخ أقسام شبكية العين، وشبكية العين مع عينة تلطيخ فلوري أيضا يمكن قياس بنفس الطريقة. على سبيل المثال، كما هو مبين في الشكل رقم 1 باستخدام تلوين دابي، وسوف تكون كل نواة الملون وزرقاء اللون في تصور تحت التصفية نانومتر 405. النوى في طبقة الخلايا العقدية للشبكية (RGCL)، يمكن أن ينظر طبقة النووية الداخلية (INL)، وطبقة النووي الخارجي (فقط. t). ويمكن بعد ذلك يتم الكشف عن سمك الطبقات المختلفة بطريقة مشابهة برهنت في هذا الفيديو.
الشكل 1.
حول حجم اشارات مختلفة الفلورسنت الملون، وقد نشرت مجموعتنا ورقة حول حول حجم الخلايا العصبية في RGCL في الفئران الزرق نموذج (لو وآخرون، 2009).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لديهم ما يكشف.
Acknowledgments
ويدعم العمل على الأبحاث العين في هذا المختبر من قبل مؤسسة الصحة الاميركية مساعد، الأزالية (1972) صندوق الهبات، وجامعة هونغ كونغ صندوق المشاريع الصغيرة (20097176185).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Stereo Investigator | MicroBright Field | ||
| Microscope | Olympus Corporation | BX51 |
References
- Lam, T. T., Abler, A. S., Tso, M. O. N-Methyl-D-Aspartate (NMDA)–Induced Apoptosis in Rat Retina. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 40, 2391-2397 (1999).
- Lam, T. T., Abler, A. S., Tso, M. O. Apoptosis and caspases after ischemia-reperfusion injury in rat retina. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 40, 967-975 (1999).
- Luo, X. G., Chiu, K., Lau, H. S., Lee, V. W. H., Yung, K. K. L., So, K. F. The Selective Vulnerability of Retinal Ganglion Cells in Rat Chronic Ocular Hypertension Model at Early Phase. Cellular and Molecular Neurobiology. 29 (8), 1143-1151 (2009).
- Han, Y. S., Chung, I. Y., Park, J. M., Yu, J. M. Neuroprotective effect of citicoline on retinal cell damage induced by kainic acid in rats. Korean J. Ophthalmol. 19, 219-226 (2005).
- Hernandez, M., Urcola, J. H. Retinal ganglion cell neuroprotection in a rat model of glaucoma following brimonidine, latanoprost or combined treatments. Exp. Eye Res. 86, 798-806 (2008).
- Chan, H. C., Chang, R. C. C., Ip, A. K. C., Chiu, K., Yuen, W. H., Zee, S. Y., So, K. F. Neuroprotective effects of Lycium barbarum Lynn on protecting retinal ganglion cells in an ocular hypertension model of glaucoma. Experimental Neurology. 203, 269-273 (2007).
