Summary
Cette vidéo montre trois types d'analyses morphométriques de la rétine, qui comprennent la mesure de l'épaisseur de couche nucléaire interne, de quantifier le nombre de cellules ganglionnaires de la rétine (CGR) et de mesurer les tailles de CGR. La technique peut offrir une plate-forme simple mais scientifique pour analyses morphométriques.
Abstract
Les analyses morphométriques de sections rétiniennes ont été utilisés dans l'examen de maladies de la rétine. Pour des exemples, des cellules neuronales ont été considérablement perdu dans la couche de cellules ganglionnaires de la rétine (RGCL) chez le rat avec la N-méthyl-D-aspartate (NMDA) excitotoxicité induite par 1, la rétine d'ischémie-reperfusion 2 et le glaucome 3. Réduction de la couche plexiforme INL et interne (IPL) épaisseurs ont été inversés avec le traitement citicoline dans les yeux des rats soumis à l'excitotoxicité du glutamate acide kaïnique médiée par 4. Modification de la densité et la taille des soma RGC ont été observés avec différents traitements médicamenteux dans les yeux avec une pression intraoculaire élevée 3,5,6. Par conséquent, ayant des méthodes objectives de l'analyse des morphometries rétiniennes peuvent être d'une grande importance dans l'évaluation des pathologies de la rétine et l'efficacité des stratégies thérapeutiques.
La structure de la rétine est multi-couches et plusieurs différents types de neurones exier dans la rétine. Les paramètres morphométriques de la rétine comme le nombre de cellules, la taille des cellules et l'épaisseur des différentes couches sont plus complexes que le système de culture cellulaire. Dès le début, ces paramètres peuvent être détectés à l'aide d'autres logiciels d'imagerie commerciale. Les valeurs sont normalement de la valeur relative, et le passage à la valeur précise peut-être besoin de calcul plus précis. En outre, le tracé de la taille des cellules et la morphologie peuvent ne pas être exacts et suffisamment sensible pour l'analyse statistique, en particulier dans le modèle de glaucome chronique. Les mesures utilisées dans le présent protocole a fourni un moyen plus précis et facile. Et la longueur absolue de la ligne et la taille de la cellule peut être signalé directement et facile à copier d'autres fichiers. Par exemple, nous avons retracé la marge de la plupart des noyaux interne et externe dans l'INL et ont formé une ligne, puis en utilisant le logiciel pour dessiner un angle de 90 degrés pour mesurer l'épaisseur. Bien que sans l'aide du logiciel, la ligne peut-être oblique et l'évolution de l'épaisseur de la rétine peutne pas être reproductible parmi les observateurs individuels. En outre, le nombre et la densité de CGR peut également être quantifiée. Ce protocole diminue avec succès la variabilité dans la quantitation caractéristiques de la rétine, augmente la sensibilité dans la détection des changements minimes.
Cette vidéo démontre trois types d'analyses morphométriques des sections rétiniennes. Ils comprennent la mesure de l'épaisseur INL, quantifier le nombre de CGR et de mesurer les tailles de CGR en valeur absolue. Ces trois analyses sont effectuées avec l'enquêteur stéréo (MBF Bioscience - MicroBrightField, Inc.) La technique peut offrir une plate-forme simple mais scientifique pour analyses morphométriques.
Protocol
1. Outils
Microscope, Nikon
Enquêteur stéréo, MBF Bioscience - MicroBrightField, Inc
2. Préparation
- Avant de travailler sur une analyse morphométrique, chaque échantillon rétine est sectionné à 4 microns d'épaisseur et subit la coloration H & E.
- La section rétine est divisée en 4 régions - la région supérieure périphérique, la région centrale supérieure, la région périphérique inférieure, et la région inférieure centrale.
- Après avoir défini les régions, une image de chaque région est acquise à des grossissements 10x40 sous le microscope faisceau lumineux de Nikon.
- Maintenant, nous sommes prêts à analyser la morphométrie de la rétine.
3. Mesure de l'épaisseur INL
- Quatre mesures de l'épaisseur INL dans chaque région ont été mesurés. Quatre lignes sera tirée perpendiculairement à partir de la ligne de base de contour de la frontière extérieure de la INL.
- Ouvrez le logiciel appelé chercheur stéréo et choisissez la lentille 40x de la barre d'outils principale.
- Sélectionnez "Ouvrir une image" sous l'onglet «Fichier». Choisissez une image d'une région désirée rétine que vous souhaitez analyser.
- Choisissez le type de ligne de contour de la zone de liste déroulante de la barre d'outils principale et appuyez sur le "Move Auto".
- Faites un clic droit dans la fenêtre de traçage, et sélectionnez "Simple Click traçage".
- Dessiner la ligne de contour le long de la bordure intérieure de l'INL.
- Lorsque le dessin est fait, faites un clic droit dans la fenêtre de traçage et de choisir "Contour Open End".
- Sélectionnez un marqueur à la barre d'outils marqueur et ajouter des marqueurs aux points de jonction.
- Après l'ajout de tous les marqueurs, désélectionner l'icône marqueur à la barre d'outils marqueurs.
- Positionner un curseur au centre de l'un des marqueurs.
- Sélectionnez «QuickMesurer l'angle "sous l'onglet" Outils ".
- Faites un clic droit dans la fenêtre de traçage et de désélectionner le "continu" option.
- Mesurer un angle en cliquant d'abord au centre d'un marqueur, qui est adjacente au marqueur sélectionné pour une extrémité du segment de ligne.
- Puis, déplacez la souris vers le centre du marqueur concerné et cliquez à nouveau.
- Prolonger la ligne bande de caoutchouc de la frontière extérieure de l'INL.
- Ajustez l'angle jusqu'à 90 ° est atteint.
- Clic gauche à la position désirée. Une boîte de dialogue affichant une mesure d'angle apparaîtra juste après le clic.
- Appuyez sur la toucheTouche "Enter" tout en maintenant la souris.
- Un clic gauche sur la fenêtre de traçage de sorte qu'une ligne est tracée d'un bout à la fin nouveau sélectionné.
- Faites un clic droit dans la fenêtre de traçage et de choisir "Contour Open End".
- Tracer les lignes d'autres à des positions différentes, exactement de la même manière que décrit précédemment.
- Après avoir dessiné toutes les lignes, sélectionnez le mode d'édition et renommer les 4 segments de ligne en conséquence.
- Quatre mesures peuvent être obtenues en appuyant sur "Mesure Contour" bouton.
- Sélectionnez ces 4 mesures et de les coller dans une feuille de calcul en cliquant sur "Copy to Clipboard".
- Sélectionnez «Enregistrer sous» sous l'onglet «Fichier». Les données de suivi peuvent être sauvegardés comme un fichier de données.
- Sélectionnez "Ouvrir une image" sous l'onglet «Fichier». Choisissez une image d'une région désirée rétine que vous souhaitez analyser.
- Choisissez le type de ligne de contour de la zone de liste déroulante de la barre d'outils principale.
- Dessinez une ligne de contour le long de la frontière de la couche de fibres nerveuses (NFL).
- Mettre fin à la traçabilité avec le "Contour Open End" option.
- À chaque extrémité, ajouter un marqueur à l'extrémité de la ligne et une autre à la position proche de la pointe.
- Désélectionnez l'icône marqueur à la barre d'outils marqueur.
- Positionner un curseur au centre des marqueurs à la pointe.
- Sélectionnez «Angle Mesure rapide» sous l'onglet «Outils».
- Faites un clic droit dans la fenêtre de traçage et de désélectionner le "continu" option.
- Ajuster les lignes de bande en caoutchouc et mesurer un angle de 90 °.
- Appuyez sur la touche "Entrée" après une boîte de dialogue est sorti.
- Clic gauche til traçage fenêtre de sorte qu'une nouvelle ligne peut être étendue perpendiculairement à partir de la pointe.
- Tracez une autre ligne nouvelle dans le exactement de la même façon à l'autre extrémité.
- Deux limites sont créés dans lequel le nombre de RGC est compté.
- Choisissez une frontière comme une ligne d'exclusion qui touche les cellules ne sont pas comptés.
- Sélectionnez un type de marqueur et joindre une à chaque cellule vivante.
- Sélectionnez un autre type de marqueur pour les cellules mortes.
- Le nombre de chaque type de marqueurs placés seront affichés à côté de l'icône marqueur en conséquence à la barre d'outils marqueur.
- Sélectionnez le mode d'édition et de ramasser la base du contour. Faites un clic droit dans la fenêtre de traçage et de renommer la ligne.
- La longueur de la ligne de base du contour peut être obtenu en appuyant sur "Mesure Contour" bouton.
- Le nombre des cellules peut alors être exprimé par mm de la longueur.
- Sélectionnez «Enregistrer sous» sous l'onglet «Fichier». Lale traçage et les données de marqueurs peut être sauvegardé comme un fichier de données.
5. Mesurer la taille de cellule d'une cellule RGC
- Sélectionnez "Ouvrir une image" sous l'onglet «Fichier». Choisissez une image d'une région désirée rétine que vous souhaitez analyser.
- Zoom dans une cellule vivante et choisissez le type de ligne de contour de la zone de liste déroulante de la barre d'outils principale.
- Tracer une ligne de contour le long de la circonférence de la cellule.
- Vers la fin, faites un clic droit de la fenêtre de traçage et de sélectionner "contour Fin proche".
- La surface de la cellule sera affiché sous la rubrique de la zone dans la boîte de dialogue Contour mesure.
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Discussion
1. Comment faire pour obtenir une mesure d'épaisseur plus précis?
Vous pouvez agrandir l'image en cliquant sur "Zoom" et faites un clic gauche dans la fenêtre de traçage. La frontière INL peut être vu clairement. Si la pointe de la ligne n'est pas à la frontière extérieure de l'INL, nous pouvons ajuster la ligne sous le mode d'édition. Après avoir ramassé la ligne concernée, faites un clic droit de la fenêtre de traçage et de choisir "Insérer un point de contour sélectionné". Un point peut être ajouté à la frontière extérieure tandis que le point devrait être ajouté sur la même ligne. Ensuite, vous devez supprimer le point d'origine et une ligne avec une longueur plus précise peut être obtenue.
2. Comment maintenir à 90 ° de la ligne élastique?
Après une boîte de dialogue indiquant le degré est sorti, vous devez tenir la souris encore en appuyant sur la touche "Entrée". Puis, faites un clic gauche de la fenêtre de traçage de sorte qu'une ligne nouvelle ne peut être tirée.
3. Comment faire des cellules vivantes et mortes caunes ressembler?
Ces cellules d'une forme à peu près ronde avec cytoplasme et le noyau clairement observé sont considérés comme des CGR en direct. Ces cellules comparable petites et condensé sont considérés comme des cellules mortes.
4. Ces échantillons ont été soumis rétine coloration H & E dans le protocole actuel. Est-il possible de mesurer l'échantillon rétine avec coloration fluorescente?
Oui. Bien que le protocole actuel est sur la coloration H & E sections rétiniennes, l'échantillon de la rétine avec une coloration fluorescente peut aussi être de mesurer de la même manière. Par exemple, comme le montre la figure 1 en utilisant une coloration DAPI, tous les noyaux seront colorés et bleu visualisées en couleur sous un filtre de 405 nm. Les noyaux dans la couche des cellules ganglionnaires rétiniennes (RGCL), la couche interne nucléaire (INL) et la couche extérieure nucléaire (ONL) peut être vu. Puis l'épaisseur des différentes couches peuvent être détectés d'une manière similaire montré dans cette vidéo.
Figure 1.
À propos de la taille des différents signaux fluorescents colorés, notre groupe a publié un document concernant la taille des neurones dans le RGCL chez un rat modèle de glaucome (Luo et al, 2009).
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Disclosures
Les auteurs n'ont rien à révéler.
Acknowledgments
Le travail sur la recherche des yeux dans ce laboratoire est soutenu par la Fondation panaméricaine de la santé adjoint, Azalée (1972) Fonds de dotation, et le Fonds HKU des petits projets (20097176185).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Stereo Investigator | MicroBright Field | ||
| Microscope | Olympus Corporation | BX51 |
References
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