Summary
Dieses Video zeigt drei Arten von morphometrischen Analysen der Netzhaut, die Messung der inneren Körnerschicht Dicke, indem die Anzahl der retinalen Ganglienzellen (RGZ) und Messung der Größen von RGCs gehören. Die Technik bietet eine einfache, aber wissenschaftliche Plattform für morphometrische Analysen.
Abstract
Morphometrische Analyse von Netzhautschnitte in Prüfung retinalen Krankheiten verwendet. Beispiele wurden neuronalen Zellen signifikant im retinalen Ganglienzellen (RGCL) im Rattenmodell mit N-Methyl-D-Aspartat verloren (NMDA) Exzitotoxizität 1, retinalen Ischämie-Reperfusionsverletzung 2 und 3-Glaukom induziert. Reduzierung der INL und inneren plexiformen Schicht (IPL) Dicken wurden mit Citicolin Behandlung bei Ratten 'Augen unterzogen Kainsäure-vermittelte Glutamatexzitotoxizität 4 umgekehrt. Änderung der RGC Dichte und Soma Größen wurden mit verschiedenen medikamentösen Behandlungen bei Augen mit erhöhtem Augeninnendruck 3,5,6 beobachtet. Daher kann mit objektiven Verfahren zur Analyse der retinalen morphometries von großer Bedeutung bei der Bewertung von retinalen Pathologien und die Wirksamkeit von therapeutischen Strategien sein.
Das Retina-Struktur ist Multi-Schichten und verschiedene Arten von Neuronen Exist in der Netzhaut. Die morphometrischen Parameter der Retina, wie Zellzahl, Zellgröße und die Dicke der verschiedenen Schichten sind komplexer als der Zellkultur. Frühe auf, können diese Parameter unter Verwendung anderer kommerzieller Bildbearbeitungssoftware werden. Die Werte sind in der Regel von relativer Wert, und das Ändern der genaue Wert kann weiter eine genaue Berechnung müssen. Auch kann das Tracing der Zellgröße und Morphologie nicht genau und empfindlich genug für statistische Auswertung, vor allem in der chronischen Glaukom-Modell. Die Messungen in diesem Protokoll verwendet werden, sofern eine genauere und einfache Weise. Und die absolute Länge der Leitung und der Größe der Zelle kann direkt und einfach zu anderen Dateien kopiert werden gemeldet werden. Zum Beispiel verfolgt wir den Rand der inneren und äußeren meisten Kerne in der INL und eine Linie gebildet ist dann mit der Software, um eine 90-Grad-Winkel zu zeichnen, um die Dicke zu messen. Während ohne die Hilfe der Software kann die Leitung vielleicht schräg und personelle Veränderungen der Netzhautdickenicht wiederholbar sein zwischen den einzelnen Beobachtern. Darüber hinaus kann die Anzahl und Dichte von RGCs ebenfalls quantifiziert werden. Dieses Protokoll erfolgreich verringert die Variabilität in der quantitativen Merkmale der Netzhaut, erhöht die Empfindlichkeit bei der Erkennung minimale Änderungen.
Dieses Video wird zeigen, drei Arten von morphometrischen Analysen der retinalen Abschnitten. Dazu gehören die Messung der Dicke INL, indem die Anzahl der RGCs und Messen der Größen von RGCs absolut. Diese drei Analysen werden mit Stereo-Investigator (- MicroBrightField, Inc. MBF Bioscience) durchgeführt. Die Technik bietet eine einfache, aber wissenschaftliche Plattform für morphometrische Analysen.
Protocol
1. Werkzeuge
Mikroskop, Nikon
Stereo Investigator, MBF Bioscience - MicroBrightField, Inc.
2. Vorbereitung
- Vor Arbeiten an jedem morphometrische Analyse ist jeder Netzhaut Probe bei 4 Mikrometer Dicke geschnitten und unterzieht sich der H & E Färbung.
- Oberen Randbereich der oberen mittleren Bereich der unteren Randbereich, und die unteren mittleren Bereich - Die Netzhaut Abschnitt ist in 4 Bereiche aufgeteilt.
- Nach der Definition der Regionen wird ein Bild der jeweiligen Region bei 10x40 Vergrößerungen unter dem hellen Lichtstrahl Mikroskop von Nikon erworben.
- Nun sind wir bereit, Morphometrie der Netzhaut zu untersuchen.
3. Mess-INL Dicke
- Vier Messungen der INL Dicke in jeder Region wurden gemessen. Vier Linien werden senkrecht von der Kontur Basislinie gezogen werden, um den äußeren Rand des INL.
- Öffnen Sie die Software mit dem Namen Stereo Investigator und wählen Sie das 40x Objektiv von der Haupt-Werkzeugleiste.
- Wählen Sie "Bild öffnen" unter der Registerkarte "Datei". Wählen Sie ein Bild von einem gewünschten retinalen Region, die Sie gerne analysieren würde.
- Wählen Sie die Art der Konturlinie aus der Dropdown-Listenfeld der Haupt-Werkzeugleiste und drücken Sie die "Auto Move"-Taste.
- Mitten im Tracing-Fenster klicken, und wählen Sie "Simple Click-Tracing".
- Zeichnen Sie die Konturlinie entlang der inneren Grenze des INL.
- Wenn die Zeichnung fertig ist, direkt in der Tracing-Fenster und wählen Sie "End Open Contour".
- Wählen Sie einen Marker an der Marker Symbolleiste hinzufügen und Markierungen an den Verbindungsstellen.
- Nach dem Hinzufügen alle Markierungen, deaktivieren Sie die Marker-Symbol in der Symbolleiste Marker.
- Positionieren eines Cursors in der Mitte einer der Marker.
- Wählen Sie "QuickMessen Sie Angle "unter dem Reiter" Tools ".
- Mitten im Tracing-Fenster klicken und deaktivieren Sie die "Continuous"-Option.
- Messen eines Winkels indem man zunächst in der Mitte einer Markierung, die benachbart zu der Markierung für ein Ende der Strecke ist, ausgewählt.
- Dann bewegen Sie die Maus in die Mitte des betreffenden Marker aus und klicken Sie erneut.
- Erweitern Sie das Gummiband Linie an der äußeren Grenze des INL.
- Stellen Sie den Winkel bis 90 ° erreicht wird.
- Linke Maustaste an die gewünschte Position. Ein Dialogfeld zeigt eine Winkelmessung öffnet sich direkt nach dem Klick.
- Drücken Sie die Taste"Enter"-Taste bei gedrückter Maustaste immer noch.
- Linksklick auf den Tracing-Fenster, so dass eine Linie von einem Ende zum neuen ausgewählten Ende gezogen wird.
- Mitten im Tracing-Fenster und wählen Sie "Open-End Contour".
- Malen die anderen Linien an unterschiedlichen Positionen in genau der gleichen Weise wie zuvor beschrieben.
- Nach dem Zeichnen Sie alle Zeilen, wählen Sie den Bearbeiten-Modus und benennen Sie die 4 Liniensegmenten entsprechend.
- Vier Messungen können durch Drücken von "Contour Measurement"-Taste erreicht werden.
- Wählen Sie diese 4 Messungen und fügen Sie sie in eine Tabelle, indem Sie auf "Copy to Clipboard".
- Wählen Sie "Speichern unter" unter der Registerkarte "Datei". Die Tracing-Daten können als Datei gespeichert werden.
- Wählen Sie "Bild öffnen" unter der Registerkarte "Datei". Wählen Sie ein Bild von einem gewünschten retinalen Region, die Sie gerne analysieren würde.
- Wählen Sie die Art der Konturlinie aus der Dropdown-Listenfeld auf der Hauptsymbolleiste.
- Zeichnen Sie eine Konturlinie entlang der Grenze des Nervenfaserschicht (NFL).
- Beenden Sie das Tracing mit der Option "Open-End Contour".
- An jedem Ende, fügen eine Markierung an der Spitze der Leitung und ein anderes an der Position nahe der Spitze.
- Deaktivieren Sie die Marker-Symbol in der Symbolleiste Marker.
- Positionieren Sie den Cursor in der Mitte der Markierungen an der Spitze.
- Wählen Sie "Quick-Measure Angle" unter dem Reiter "Tools".
- Mitten im Tracing-Fenster klicken und deaktivieren Sie die "Continuous"-Option.
- Passen Sie die Gummiband-Linien und messen Sie einen Winkel von 90 °.
- Drücken Sie die "Enter"-Taste, nachdem ein Dialogfeld auftauchte.
- Linksklick ter Tracing Fenster, so dass eine neue Linie kann senkrecht von der Spitze verlängert werden.
- Zeichnen Sie eine weitere neue Zeile in der genau die gleiche Weise an einem anderen Ende.
- Zwei Grenzen erzeugt werden, in dem die Anzahl von RGCs gezählt wird.
- Wählen Sie eine Grenze als Ausschluss Linie, die die Zelle berührt nicht gezählt wird.
- Wählen Sie eine Art von Markierung und fügen eine auf jeder lebenden Zelle.
- Wählen Sie eine andere Art der Markierung für die toten Zellen.
- Die Anzahl der einzelnen Arten von Markierungen platziert werden neben dem Marker-Symbol angezeigt werden dementsprechend an der Marker-Symbolleiste.
- Wählen Sie den Bearbeitungsmodus und holen die Kontur Grundlinie. Mitten im Tracing-Fenster klicken und benennen Sie die Linie.
- Die Länge der Grundlinie Kontur kann durch Drücken von "Contour Measurement"-Taste erreicht werden.
- Die Anzahl der Zellen können dann pro mm der Länge ausgedrückt werden.
- Wählen Sie "Speichern unter" unter der Registerkarte "Datei". DieAufspüren und die Marker-Daten können als Datei gespeichert werden.
5. Messung der Zellgröße der Zellen RGC
- Wählen Sie "Bild öffnen" unter der Registerkarte "Datei". Wählen Sie ein Bild von einem gewünschten retinalen Region, die Sie gerne analysieren würde.
- Zoom in einer lebenden Zelle und wählen Sie den Typ der Konturlinie aus der Dropdown-Listenfeld auf der Hauptsymbolleiste.
- Malen einer Konturlinie entlang des Umfangs der Zelle.
- Gegen Ende der rechten Maustaste auf das Tracing-Fenster und wählen Sie "End Kontur schließen".
- Der Bereich der Zelle wird unter dem Punkt der Fläche in den Contour Measurement Dialogfeld angezeigt werden.
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Discussion
1. Wie, um eine genauere Messung zu erhalten Dicke?
Sie können das Bild durch Klicken auf "Zoom in"-Taste vergrößern und klicken Sie links im Fenster verfolgen. Der INL-Grenze ist deutlich zu erkennen. Wenn die Spitze der Linie ist nicht an der äußeren Grenze des INL, können wir die Zeile unter dem Bearbeiten-Modus einzustellen. Nach dem Pflücken werden die betreffenden Zeile der rechten Maustaste auf das Tracing-Fenster und wählen Sie "Einfügen Point in ausgewählten Kontur". Ein Punkt kann am äußeren Rand hinzugefügt werden, während der Punkt aufgenommen entlang der gleichen Linie sein sollte. Dann müssen Sie den ursprünglichen Punkt zu löschen und eine Linie mit einer genaueren Länge erreicht werden kann.
2. Wie bis 90 ° des Gummibandes Linie aufrecht zu erhalten?
Nachdem ein Dialogfeld zeigt den Grad aufgeklappt ist, muss man die Maus immer noch halten, während Sie die Taste "Enter". Dann links auf die Tracing-Fenster, so dass eine neue Linie gezogen werden können.
3. Wie lebende Zellen und tote cEllen aussehen?
Diese Zellen haben eine annähernd runde Form mit Zytoplasma und Zellkern deutlich zu beobachten sind als Live-RGCs betrachtet. Diese vergleichsweise kleinen und kondensierte Zellen werden als tote Zellen betrachtet.
4. Diese Retina-Proben wurden H & E Färbung im aktuellen Protokoll unterzogen. Ist es möglich, die Netzhaut Probe mit Fluoreszenzfärbung zu messen?
Ja. Obwohl aktuelle Protokoll ist auf der H & E Färbung Netzhautschnitte, die Netzhaut Probe mit Fluoreszenz-Färbung kann auch messen die gleiche Weise. Zum Beispiel, wie in 1 gezeigt, mit DAPI-Färbung, wird alle Kerne angefärbt und visualisiert blau unter einem 405 nm-Filter. Kerne aus dem retinalen Ganglienzellen (RGCL), kann die innere Körnerschicht (INL) und der äußeren Körnerschicht (ONL) gesehen werden. Dann wird die Dicke der verschiedenen Schichten können in ähnlicher Weise in diesem Video gezeigt nachgewiesen werden.
Abbildung 1.
Über die Größe der unterschiedlichen Fluoreszenzsignale gebeizt, unsere Fraktion hat ein Papier über die etwa die Größe von Neuronen im RGCL in einem Ratten-Modell Glaukom (Luo et al, 2009) veröffentlicht.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts zu offenbaren.
Acknowledgments
Die Arbeit am Auge Forschung in diesem Labor wird von der American Health Assistant-Stiftung, Azalee (1972) Endowment Fund, und HKU Small Project Fund (20097176185) unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Stereo Investigator | MicroBright Field | ||
| Microscope | Olympus Corporation | BX51 |
References
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- Lam, T. T., Abler, A. S., Tso, M. O. Apoptosis and caspases after ischemia-reperfusion injury in rat retina. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 40, 967-975 (1999).
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