Summary
इस वीडियो रेटिना की morphometric विश्लेषण है, जो भीतर परमाणु परत मोटाई मापने, (RGCs) रेटिना नाड़ीग्रन्थि कोशिकाओं की संख्या बढ़ाता और RGCs के आकार को मापने के तीन प्रकार को दर्शाता है. तकनीक morphometric विश्लेषण के लिए एक सरल लेकिन वैज्ञानिक मंच की पेशकश कर सकते हैं.
Protocol
1. उपकरण
माइक्रोस्कोप Nikon है,
स्टीरियो अन्वेषक, MBF बायोसाइंस - MicroBrightField, Inc,
2. तैयारी
- किसी भी morphometric विश्लेषण पर काम करने से पहले, प्रत्येक रेटिना नमूना 4 माइक्रोन मोटाई में sectioned है और एच ई धुंधला आए.
- परिधीय क्षेत्र ऊपरी, ऊपरी मध्य क्षेत्र, कम परिधीय क्षेत्र, और कम मध्य क्षेत्र रेटिना अनुभाग 4 क्षेत्रों में विभाजित है.
- क्षेत्रों को परिभाषित करने के बाद, प्रत्येक क्षेत्र की एक छवि 10x40 magnifications में Nikon के उज्ज्वल बीम खुर्दबीन के नीचे हासिल कर ली है.
- अब, हम रेटिना के morphometry का विश्लेषण करने के लिए तैयार हैं.
3. लीग मोटाई मापने
- प्रत्येक क्षेत्र में लीग मोटाई के चार माप मापा गया. चार लाइनों समोच्च आधारभूत से लंबरूप लीग की बाहरी सीमा के लिए तैयार है.
- स्टीरियो अन्वेषक सॉफ्टवेयर बुलाया खोलें और मुख्य टूलबार से 40x लेंस का चयन करें.
- टैब "फ़ाइल" के अंतर्गत "छवि खोलें" का चयन करें. एक वांछित रेटिना क्षेत्र है कि आप का विश्लेषण करना चाहते हैं की एक छवि चुनें.
- मुख्यऔज़ारपट्टी ड्रापडाउन सूची बॉक्स से समोच्च रेखा के प्रकार चुनें और "ऑटो ले जाएँ" बटन दबाएँ.
- अनुरेखण विंडो में दायाँ क्लिक करें, और "सरल अनुरेखण क्लिक करें" चुनें.
- लीग के भीतर सीमा पर समोच्च रेखा ड्रा.
- जब आरेखण किया है, सही अनुरेखण विंडो में क्लिक करें और "अंत ओपन कंटूर" चुनें.
- मार्कर उपकरण पट्टी पर एक मार्कर का चयन करें और जंक्शन बिंदुओं पर मार्करों जोड़.
- सभी मार्करों जोड़ने के बाद, मार्कर टूलबार में मार्कर आइकन अचयनित.
- मार्करों के एक के केंद्र में एक कर्सर स्थिति.
- "त्वरित चुनेंकोण को मापने के लिए "उपकरण" टैब के तहत ".
- अनुरेखण विंडो में दायाँ क्लिक करें और "निरंतर" विकल्प अचयनित.
- पहले एक मार्कर है, जो लाइन खंड के एक अंत के लिए चयनित मार्कर के निकट के केंद्र पर क्लिक करके एक कोण उपाय.
- फिर, संबंधित मार्कर के केंद्र के लिए माउस को स्थानांतरित करने के लिए और फिर क्लिक करें.
- रबर बैंड लीग की बाहरी सीमा के लिए लाइन का विस्तार.
- कोण समायोजित करें जब तक 90 डिग्री तक पहुँच जाता है.
- इच्छित स्थान पर क्लिक करें छोड़ दिया. एक संवाद बॉक्स एक कोण माप दिखा सही क्लिक के बाद पॉप जाएगा.
- प्रेसकुंजी दर्ज करें "" जब माउस अभी भी पकड़े.
- और अनुरेखण खिड़की पर क्लिक करें वाम इतना है कि एक लाइन के एक छोर से नई चयनित अंत करने के लिए तैयार है.
- सही अनुरेखण विंडो में क्लिक करें और "एंड ओपन कंटूर" चुनें.
- बिल्कुल उसी तरह से पहले वर्णित के रूप में विभिन्न पदों पर अन्य लाइनों ड्रा.
- सभी लाइनों ड्राइंग के बाद, संपादन मोड का चयन करें और 4 लाइन खंड तदनुसार नाम बदलने.
- चार माप "कंटूर मापन" बटन दबाकर प्राप्त किया जा सकता है.
- इन 4 माप का चयन करें और एक स्प्रेडशीट के लिए उन्हें "क्लिपबोर्ड में प्रतिलिपि बनाएँ" पर क्लिक करके पेस्ट करें.
- चुनें "फ़ाइल" टैब के तहत "के रूप में सहेजें". अनुरेखण डेटा को एक डेटा फ़ाइल के रूप में सहेजा जा सकता है.
- टैब "फ़ाइल" के अंतर्गत "छवि खोलें" का चयन करें. एक वांछित रेटिना क्षेत्र है कि आप का विश्लेषण करना चाहते हैं की एक छवि चुनें.
- मुख्यऔज़ारपट्टी ड्रापडाउन सूची बॉक्स से समोच्च रेखा के प्रकार चुनें.
- तंत्रिका फाइबर परत (एनएफएल) की सीमा के साथ एक समोच्च रेखा ड्रा.
- विकल्प "अंत ओपन कंटूर" के साथ अनुरेखण समाप्ति.
- प्रत्येक के अंत में, लाइन के टिप पर एक मार्कर और टिप के पास स्थिति में एक और जोड़.
- मार्कर उपकरण पट्टी पर मार्कर चिह्न अचयनित.
- नोक पर मार्करों के केंद्र में एक कर्सर स्थिति.
- "उपकरण" टैब के तहत "त्वरित उपाय कोण" का चयन करें.
- अनुरेखण विंडो में दायाँ क्लिक करें और "निरंतर" विकल्प अचयनित.
- रबर बैंड लाइनों को समायोजित और 90 डिग्री के कोण को मापने.
- प्रेस "Enter" कुंजी के बाद एक संवाद बॉक्स के ऊपर popped है.
- वाम क्लिक टीवह खिड़की अनुरेखण इतना है कि एक नई लाइन को लंबरूप टिप से बढ़ाया जा सकता है.
- ठीक उसी तरह एक और अंत में एक और नई लाइन ड्रा.
- दो सीमाओं बनाया जाता है जो भीतर RGCs की संख्या में गिना जाता है.
- बहिष्कार लाइन है जो सेल छू नहीं गिना जाता है के रूप में एक सीमा चुनें.
- मार्कर का एक प्रकार का चयन करें और प्रत्येक जीवित कोशिका के लिए एक देते हैं.
- मृत कोशिकाओं के लिए मार्कर का एक और प्रकार का चयन करें.
- रखा मार्करों के प्रत्येक प्रकार की संख्या मार्कर चिह्न के साथ प्रदर्शित किया जाएगा तदनुसार मार्कर उपकरण पट्टी पर.
- संपादन मोड का चयन करें और समोच्च आधारभूत उठाओ. अनुरेखण विंडो में दायाँ क्लिक करें और नाम बदलने लाइन.
- समोच्च आधार रेखा की लंबाई "कंटूर मापन" बटन दबाकर प्राप्त किया जा सकता है.
- कक्षों की संख्या तो लंबाई की मिमी प्रति व्यक्त किया जा सकता है.
- चुनें "फ़ाइल" टैब के तहत "के रूप में सहेजें".अनुरेखण और डेटा मार्कर एक डेटा फ़ाइल के रूप में सहेजा जा सकता है.
5. एक RGC सेल का सेल आकार को मापने
- टैब "फ़ाइल" के अंतर्गत "छवि खोलें" का चयन करें. एक वांछित रेटिना क्षेत्र है कि आप का विश्लेषण करना चाहते हैं की एक छवि चुनें.
- एक जीवित कोशिका में ज़ूम और मुख्यऔज़ारपट्टी की ड्रापडाउन सूची बॉक्स से समोच्च रेखा के प्रकार का चयन करें.
- सेल की परिधि के साथ एक समोच्च रेखा ड्रा.
- अंत के बारे में, सही अनुरेखण खिड़की पर क्लिक करें और "अंत करीब समोच्च का चयन करें.
- सेल के क्षेत्र कंटूर मापन संवाद बॉक्स में क्षेत्र के आइटम के तहत प्रदर्शित किया जाएगा.
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Discussion
1. कैसे एक और अधिक सटीक मोटाई माप प्राप्त करने के लिए?
आप "ज़ूम" बटन पर क्लिक करके छवि विस्तार कर सकते हैं और अनुरेखण विंडो में क्लिक करें छोड़ दिया है. लीग सीमा स्पष्ट रूप से देखा जा सकता है. यदि लाइन के टिप लीग की बाहरी सीमा पर नहीं है, हम संपादन मोड के तहत लाइन समायोजित कर सकते हैं. संबंधित लाइन को चुनने के बाद, सही अनुरेखण खिड़की पर क्लिक करें और चुनें "चयनित कंटूर में प्वाइंट डालें". एक बिंदु बाहरी सीमा पर जोड़ा जा सकता है जबकि जोडी बिंदु एक ही रेखा के साथ होना चाहिए. तो, आप मूल बिंदु को नष्ट किया है और एक और अधिक सटीक लंबाई के साथ एक लाइन प्राप्त किया जा सकता है.
2. रबर बैंड लाइन की 90 ° बनाए रखने के लिए?
एक संवाद बॉक्स डिग्री दिखाने के बाद ऊपर popped है, आप के लिए माउस को अभी भी पकड़ जबकि "Enter" कुंजी दबाने है. तो, इतना है कि एक नई लाइन तैयार किया जा सकता है अनुरेखण खिड़की पर क्लिक करें छोड़ दिया.
3. कैसे जीवित कोशिकाओं और मृत सीells की तरह लग रहे हो?
Cytoplasm और स्पष्ट रूप से मनाया नाभिक के साथ एक लगभग गोल आकार में उन कोशिकाओं रहते RGCs के रूप में माना जाता है. Comparably छोटे और गाढ़ा उन कोशिकाओं को मृत कोशिकाओं के रूप में माना जाता है.
4. उन रेटिना के नमूने वर्तमान प्रोटोकॉल में एच एंड ई धुंधला आया गया. यह फ्लोरोसेंट धुंधला के साथ रेटिना नमूना उपाय संभव है?
हां. हालांकि वर्तमान प्रोटोकॉल एच एंड ई रेटिना वर्गों धुंधला, फ्लोरोसेंट धुंधला के साथ रेटिना नमूना पर भी उसी तरह के उपाय किया जा सकता है. उदाहरण के लिए, के रूप में चित्र 1 में दिखाया DAPI धुंधला का उपयोग, सभी नाभिक दाग और रंग में कल्पना नीले रंग की एक 405 एनएम फिल्टर के तहत किया जाएगा. रेटिना नाड़ीग्रन्थि सेल परत (RGCL) में नाभिक, भीतरी परमाणु परत (लीग) और बाहरी परमाणु परत (ONL) देखा जा सकता है. तो इस वीडियो में प्रदर्शन एक समान रास्ते में विभिन्न परतों की मोटाई पता लगाया जा सकता है.
आकृति 1.
अलग दाग फ्लोरोसेंट संकेतों के आकार के बारे में, हमारे समूह एक चूहे मोतियाबिंद मॉडल (Luo एट अल, 2009) में RGCL में न्यूरॉन्स के आकार के बारे में के विषय में पत्र प्रकाशित किया है.
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Disclosures
लेखकों का खुलासा करने के लिए के लिए कुछ भी नहीं है.
Acknowledgments
इस प्रयोगशाला में आंख अनुसंधान पर काम अमेरिकी स्वास्थ्य सहायक फाउंडेशन, Azalea (1972) बंदोबस्ती कोष, और हमारी प्राथिमीक लघु परियोजना निधि (20097176185) द्वारा समर्थित है.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Stereo Investigator | MicroBright Field | ||
| Microscope | Olympus Corporation | BX51 |
References
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