Summary
Denne videoen viser tre typer morfometriske analyser av netthinnen, som inkluderer måling av indre kjernefysiske tykkelse, kvantifisere antallet netthinnens ganglieceller (RGCs) og måle størrelser av RGCs. Teknikken kan tilby en enkel, men faglig plattform for morfometriske analyser.
Abstract
Morfometriske analyser av netthinnens seksjoner har blitt brukt i å undersøke retinal sykdommer. For eksempler, ble nevrale celler betydelig tapt i retinal ganglion celle lag (RGCL) i rotter modeller med N-metyl-D-aspartat (NMDA)-indusert en excitotoxicity, retinal ischemi-reperfusjon skade 2 og glaukom tre. Reduksjon av INL og indre plexiform lag (IPL) tykkelser ble reversert med citicoline behandling i rottenes øyne utsatt for kainic syre-mediert glutamat excitotoxicity 4. Endring av RGC tetthet og soma størrelser ble observert med ulike medikamentelle behandlinger i øynene med forhøyet intraokulært trykk 3,5,6. Derfor kan ha objektive metoder for å analysere netthinnens morphometries være av stor betydning i vurderingen av netthinnens patologi og effektiviteten av terapeutiske strategier.
Netthinnens struktur er multi-lag og flere forskjellige typer nerveceller Exist i netthinnen. De morfometriske parametere i netthinnen som celle nummer, celle størrelse og tykkelse av ulike lagene er mer kompleks enn den cellekultur systemet. Tidlig på, kan disse parametrene kan oppdages ved hjelp av annen kommersiell bildebehandling. Verdiene er normalt av relative verdi, og endre til den nøyaktige verdien kan trenge ytterligere nøyaktig beregning. Dessuten kan spore av cellen størrelse og morfologi ikke være nøyaktig og følsom nok for statistikk analyse, spesielt i kronisk glaukom modellen. Målingene brukes i denne protokollen gitt en mer presis og enkel måte. Og den absolutte lengden av linjen og størrelse av cellen kan rapporteres direkte og lett å bli kopiert til andre filer. For eksempel spores vi grensen til indre og ytre mest kjerner i INL og dannet en linje deretter bruke programvare for å tegne en 90 graders vinkel for å måle tykkelsen. Mens uten hjelp av programvaren, linjen kanskje skrå og endring av retinal tykkelse kanikke være repeterbare blant enkelte observatører. I tillegg kan antallet og tettheten av RGCs også skal tallfestes. Denne protokollen reduserer vellykket variasjonen i quantitating funksjoner i netthinnen, øker følsomheten i å oppdage små endringer.
Denne videoen vil demonstrere tre typer morfometriske analyser av netthinnens seksjoner. De omfatter måling av INL tykkelse, kvantifisere antallet RGCs og måle størrelser av RGCs i absolutt verdi. Disse tre analysene er utført med Stereo Investigator (MBF biovitenskap - MicroBrightField, Inc.). Teknikken kan tilby en enkel, men faglig plattform for morfometriske analyser.
Protocol
1. Verktøy
Mikroskop, Nikon
Stereo Investigator, MBF biovitenskap - MicroBrightField, Inc.
2. Forberedelse
- Før arbeider på noen morfometriske analyser, er hver retina prøve seksjoneres i 4 micron tykkelse og gjennomgår H & E farging.
- Netthinnen delen er delt inn i 4 regioner - øvre perifer regionen, øvre sentrale regionen, jo lavere perifer regionen, og den nedre sentrale regionen.
- Etter å ha definert regionene, er et bilde av hver region kjøpt til 10x40 forstørrelser under lyse stråle mikroskop av Nikon.
- Nå er vi klare til å analysere morfometri av netthinnen.
3. Måling INL tykkelse
- Fire målinger av INL tykkelse i hver region ble målt. Fire linjer vil bli trukket vinkelrett fra Contour grunnlinjen til den ytre grensen av INL.
- Åpne programvare kalt Stereo etterforsker og velg 40x Lens fra hovedverktøylinjen.
- Velg "Image Open" under fanen "File". Velg et bilde av en ønsket retinal region som du ønsker å analysere.
- Velg type kote fra Dropdown listen over Main Toolbar og trykk på "Auto Move"-knappen.
- Høyreklikk i tracing vinduet, og velg "Simple Klikk Tracing".
- Tegn kote langs den indre grensen til INL.
- Når tegningen er ferdig, høyreklikk i oppsporing vinduet og velg "End Åpen Contour".
- Velg en markør på markør verktøylinjen og legge markører i krysset poeng.
- Etter å legge alle de markørene, oppheve markøren ikonet Marker Toolbar.
- Plasser en markør i sentrum av en av markører.
- Velg "QuickMål Angle "under fanen" Tools ".
- Høyreklikk i vinduet oppsporing og velge bort "Continuous" alternativet.
- Mål en vinkel ved først å klikke i sentrum av en markør, som ligger ved siden av merketråden valgt for ett enden av linjen segmentet.
- Deretter flytter musen til midten av vedkommende merket og klikk på nytt.
- Utvid gummistrikk linjen til den ytre grensen av INL.
- Juster vinkelen til 90 ° er nådd.
- Venstre klikk på ønsket posisjon. En dialogboks som viser en vinkel måling vil dukke opp rett etter klikk.
- Trykk på"Enter"-tasten mens du holder musen fremdeles.
- Venstre klikk på tracing vinduet slik at en linje er trukket fra den ene enden til den nye valgte slutt.
- Høyreklikk i oppsporing vinduet og velg "End Åpen Contour".
- Tegn de andre linjene på ulike posisjoner i akkurat samme måte som beskrevet tidligere.
- Når du har tegnet alle linjene, velg redigeringsmodus og endre navn på de 4 linjesegmentene tilsvarende.
- Fire målinger kan fås ved å trykke "Contour Measurement"-knappen.
- Velg disse 4 målingene og lime dem til et regneark ved å klikke "Kopier til utklippstavlen".
- Velg "Lagre som" under fanen "File". De tracing data kan lagres som en datafil.
- Velg "Image Open" under fanen "File". Velg et bilde av en ønsket retinal region som du ønsker å analysere.
- Velg type kote fra Dropdown listen over hovedverktøylinjen.
- Tegn en kote langs grensen av nerve fiber lag (NFL).
- Avslutt tracing med alternativet "End Åpen Contour".
- Ved hver ende, legger en markør på tuppen av linjen og en annen ved posisjon nær spissen.
- Opphev markøren ikonet markør verktøylinjen.
- Plasser en markør i sentrum av markører på spissen.
- Velg "Quick Measure Angle" under fanen "Tools".
- Høyreklikk i vinduet oppsporing og velge bort "Continuous" alternativet.
- Juster strikken linjene og måle en vinkel på 90 °.
- Trykk på "Enter"-tasten etter en dialogboks dukket opp.
- Venstre klikk than tracing vinduet slik at en ny linje kan vinkelrett utvidet fra spissen.
- Tegn en ny linje i nøyaktig samme måte på en annen slutt.
- To grenser opprettes innenfor der antall RGCs telles.
- Velg en grense som en utelukkelse linje som cellen berører ikke telles.
- Velg en type markør og fest en til hver levende celle.
- Velg en annen type markør for de døde cellene.
- Antallet av hver type markører plassert vises ved siden av merketråden ikonet følgelig på markør verktøylinjen.
- Velg redigeringsmodus og plukke opp konturen grunnlinjen. Høyreklikk i vinduet oppsporing og endre navn på linjen.
- Lengden på konturen grunnlinjen kan fås ved å trykke "Contour Measurement"-knappen.
- Antall cellene kan da uttrykkes per mm av lengden.
- Velg "Lagre som" under fanen "File". Detoppsporing og markøren data kan lagres som en datafil.
5. Måling cellen størrelse med en RGC celle
- Velg "Image Open" under fanen "File". Velg et bilde av en ønsket retinal region som du ønsker å analysere.
- Zoom i en levende celle og velge type kote fra Dropdown listen over hovedverktøylinjen.
- Tegn en kote langs omkretsen av cellen.
- Omtrent slutten, høyreklikk på oppsporing vinduet og velg "End nær Contour".
- Arealet av cellen vil bli vist under element av området i Contour Measurement dialogboksen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
1. Hvordan få en mer nøyaktig tykkelse måling?
Du kan forstørre bildet ved å klikke på "Zoom inn"-knappen og venstre klikk i sporing vinduet. Den INL grensen kan ses tydelig. Hvis tuppen av linjen er ikke på den ytre grensen av INL, kan vi justere linjen under redigeringsmodus. Etter å ha hentet den aktuelle linjen, høyreklikk på oppsporing vinduet og velg "Sett Point i Selected Contour". Et punkt kan legges ved ytre grense, mens punktet tilføyes, bør være langs samme linje. Deretter må du slette det opprinnelige punktet, og en linje med en mer nøyaktig lengde kan skaffes.
2. Hvordan å opprettholde 90 ° av gummistrikk linjen?
Etter en dialogboks som viser graden er dukket opp, må du holde musen stille mens du trykker på "Enter"-tasten. Deretter forlot deretter sporing vinduet slik at en ny linje kan trekkes.
3. Hvordan levende celler og døde calen se ut?
Disse cellene i en omtrent rund form med cytoplasma og cellekjernen tydelig observert regnes som levende RGCs. De relativt små og kondensert celler regnes som døde celler.
4. Disse netthinnen prøver ble gjennomgått H & E flekker i den aktuelle protokollen. Er det mulig å måle netthinnen prøven med fluorescerende farging?
Ja. Selv om nåværende protokollen er på H & E flekker retinal seksjoner, retinal prøven med fluorescerende flekker kan også måle på samme måte. For eksempel, som vist i Figur 1 med DAPI farging, vil alle kjernene være flekkete og visualisert blå i fargen under en 405 nm filter. Kjerner i retinal ganglion celle laget (RGCL), kan indre kjerne lag (INL) og ytre kjerne lag (ONL) sees. Da tykkelsen av ulike lag kan oppdages på en lignende måte demonstrert i denne videoen.
Figur 1.
Om størrelsen på ulike fargede fluorescerende signaler, har vår gruppe publisert en artikkel om om størrelsen på nevroner i RGCL i en rotte glaukom modell (Luo et al, 2009).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noe å avsløre.
Acknowledgments
Arbeidet med øyet forskning i dette laboratoriet er støttet av American Health Assistant Foundation, Azalea (1972) Endowment Fund, og HKU lite prosjekt Fund (20097176185).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Stereo Investigator | MicroBright Field | ||
| Microscope | Olympus Corporation | BX51 |
References
- Lam, T. T., Abler, A. S., Tso, M. O. N-Methyl-D-Aspartate (NMDA)–Induced Apoptosis in Rat Retina. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 40, 2391-2397 (1999).
- Lam, T. T., Abler, A. S., Tso, M. O. Apoptosis and caspases after ischemia-reperfusion injury in rat retina. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 40, 967-975 (1999).
- Luo, X. G., Chiu, K., Lau, H. S., Lee, V. W. H., Yung, K. K. L., So, K. F. The Selective Vulnerability of Retinal Ganglion Cells in Rat Chronic Ocular Hypertension Model at Early Phase. Cellular and Molecular Neurobiology. 29 (8), 1143-1151 (2009).
- Han, Y. S., Chung, I. Y., Park, J. M., Yu, J. M. Neuroprotective effect of citicoline on retinal cell damage induced by kainic acid in rats. Korean J. Ophthalmol. 19, 219-226 (2005).
- Hernandez, M., Urcola, J. H. Retinal ganglion cell neuroprotection in a rat model of glaucoma following brimonidine, latanoprost or combined treatments. Exp. Eye Res. 86, 798-806 (2008).
- Chan, H. C., Chang, R. C. C., Ip, A. K. C., Chiu, K., Yuen, W. H., Zee, S. Y., So, K. F. Neuroprotective effects of Lycium barbarum Lynn on protecting retinal ganglion cells in an ocular hypertension model of glaucoma. Experimental Neurology. 203, 269-273 (2007).
