Summary
Bu video retina ganglion hücrelerinin sayısı (RGCs) ve niceleme RGCs boyutları ölçülerek, iç nükleer tabaka kalınlığı ölçümü de retinanın morfometrik analizler, üç tip gösterir. Tekniği morfometrik analizler için basit ama bilimsel bir platform sunabilir.
Abstract
Retinal bölümlerin morfo analizleri retinal hastalıklar inceleyerek kullanılmıştır. Örnekler için, nöronal hücrelerde önemli ölçüde N-metil-D-aspartat ile sıçan modelinde retina ganglion hücre tabakası (RGCL) kayboldu (NMDA) eksitotoksisite 1, retinal iskemi-reperfüzyon yaralanması 2 ve glokom 3-indüklenen. INL ve iç pleksiform tabakası azaltılması (IPL) kainik asit-aracılı glutamat eksitotoksi 4 maruz sıçan gözünde sitikolin tedavisi ile tersine döndü kalınlıkta. RGC yoğunluğu ve soma boyutlarda Alterasyon göziçi basınç 3,5,6 gözlerde farklı ilaç tedavileri ile gözlenmiştir. Bu nedenle, retina morphometries analiz objektif yöntemlerle sahip retinal patolojiler ve tedavi stratejilerinin etkinliğini değerlendirmek büyük önem olabilir.
Retina yapısı çoklu katmanlar ve nöronlar exi birkaç farklı olduğunuretinada st. Gibi farklı katmanlardan hücre sayısı, hücre boyutu ve kalınlığı gibi retina morfometrik parametreler hücre kültür sistemi daha karmaşıktır. Erken, bu parametrelerin diğer ticari görüntüleme yazılımı kullanılarak tespit edilebilir. Değerleri göreceli değerinin normalde, ve kesin bir değere değişen daha doğru hesaplama gerekebilir. Ayrıca, hücre boyutu ve morfolojisi izleme, özellikle kronik glokom modeli, doğru ve istatistik analiz için yeterince hassas olmayabilir. Bu protokolde kullanılan ölçümler daha hassas ve kolay bir şekilde sağlanmaktadır. Ve hücre çizgisi ve büyüklüğü mutlak uzunluğu, doğrudan veya diğer dosyaları kopyalanacak kolay kaydedilmiştir. Örneğin, INL yılında iç ve dış en çekirdeklerin marjı takip ve kalınlığını ölçmek için 90 derecelik bir açı çizmek için yazılım kullanarak bir çizgi oluşturdu. Yazılım yardımı olmadan, belki eğik çizgi ve retina kalınlığı değişen olabilir ikenBireysel gözlemciler arasında tekrarlanabilir olmayabilir. Buna ek olarak, RGCs sayısını ve ayrıca yoğunluğu belirlenebilir. Bu protokol başarıyla, retinanın özellikleri miktarlarının değişkenliği azalır minimal değişiklikler tespit hassasiyetini artırır.
Bu video retina bölümleri morfometrik analizler üç tip gösterecektir. Bunlar, INL kalınlığının ölçülmesi RGCs sayısı miktarının ve mutlak değerinin RGCs boyutları ölçüm içerir. Bu üç analizleri Stereo Araştırıcı (- MicroBrightField, Inc MBF Bioscience) ile gerçekleştirilir. Tekniği morfometrik analizler için basit ama bilimsel bir platform sunabilir.
Protocol
1. Araçlar
Mikroskop, Nikon
Stereo Araştırmacı, MBF Bioscience - MicroBrightField, Inc
2. Hazırlık
- Herhangi bir morfometrik analiz çalışmaya başlamadan önce, her bir retina örneği 4 mikron kalınlığında kesitler ve H & E boyama uğrar.
- Üst periferal bölgesi, üst merkezi bölge, düşük periferal bölgeye ve alt merkezi bölge - retina bölümünde 4 bölgeye ayrılmaktadır.
- Bölgelerde tanımladıktan sonra, her bölgenin bir görüntü Nikon parlak ışını mikroskop altında 10x40 büyütülerek elde edilir.
- Şimdi, retinanın morfometri analiz etmek için hazırız.
3. INL kalınlığı ölçümü
- Her bir bölge içinde INL kalınlığının dört ölçümün ölçüldü. Dört satır INL dış sınırına kontur başlangıca dik çizilecektir.
- Stereo Investigator adlı yazılımı açın ve Ana Araç Çubuğu ile 40x Lens seçin.
- Sekmesinde "File" altında "Resim Aç" seçeneğini seçin. Analiz etmek istediğiniz bir arzu retina bölgenin bir görüntü seçin.
- Ana Araç Çubuğu Açılan liste kutusundan kontur çizgisi türünü seçin ve "Auto Move" düğmesine basın.
- Sağ izleme penceresinde tıklatın ve "Basit tıklayın İzleme" seçeneğini seçin.
- INL iç sınırı boyunca kontur çizgi çizin.
- Çizim yapılır, sağ izleme penceresinde tıklatın ve "Open End Kontur" seçeneğini seçin.
- Işaretleyici Araç çubuğunda bir işaretleyici seçin ve kavşak noktalarında işaretleri ekleyebilirsiniz.
- Tüm işaretleri ekledikten sonra, Marker Araç Çubuğu de işaretleyici simgesi kaldırın.
- Belirteçlerin birinin merkezinde bir imleç yerleştirin.
- "Hızlı SeçAraçlar "" sekmesi altında "Açı ölçün.
- Sağ izleme penceresinde tıklayın ve "Sürekli" seçeneğini kaldırın.
- Birinci çizgi parçasının bir uç için seçilen işaretleyici bitişik olan bir işaretleyici, merkezinde tıklaması ile bir açı ölçün.
- Ardından, ilgili belirteç merkezine fareyi tekrar tıklayın.
- INL dış sınırına lastik bant hattı uzatın.
- 90 ° ulaşılana kadar açısını ayarlayın.
- Istenilen konumda sol tıklayın. Bir açı ölçümü gösteren bir iletişim kutusu tıklayın hemen sonra açılacaktır.
- BasınYine fare tutarak "Enter" tuşuna.
- Bir çizgi bir ucundan itibaren yeni seçilen sonuna kadar çekilir, böylece izleme penceresinin tıklayın bırakılır.
- Sağ izleme penceresinde tıklayın ve "Open End Kontur" seçeneğini seçin.
- Daha önce tarif edildiği gibi aynı şekilde farklı pozisyonlarda diğer çizgi çizer.
- Bütün çizgiler çizdikten sonra, düzenleme modunu seçin ve buna göre 4 çizgi parçaları yeniden adlandırın.
- Dört ölçümleri "Kontur Ölçme" butonuna basarak elde edilebilir.
- Bu 4 ölçüm seçin ve "Panoya Kopyala" tıklayarak bir tabloya yapıştırabilirsiniz.
- Sekmesini seçin "Dosya" nın altında "Farklı Kaydet". Izleme verileri bir veri dosyası olarak kaydedilebilir.
- Sekmesinde "File" altında "Resim Aç" seçeneğini seçin. Analiz etmek istediğiniz bir arzu retina bölgenin bir görüntü seçin.
- Ana Araç Çubuğu Açılan liste kutusundan kontur çizgisi türünü seçin.
- Sinir lifi tabakası (NFL) sınır boyunca bir kontur çizgi çizin.
- Seçeneği "End Open Çevresi" ile izleme End.
- Her sonunda bir hattın ucunda marker ucuna yakın konumda başka bir ekleyin.
- Işaretleyici Araç çubuğunda işaretleyici simgesi kaldırın.
- Ucunda belirteçlerin merkezinde bir imleci yerleştirin.
- Sekmesinde "Araçlar" altında "Hızlı Measure Angle" seçeneğini seçin.
- Sağ izleme penceresinde tıklayın ve "Sürekli" seçeneğini kaldırın.
- Lastik bant hatları ayarlayın ve 90 ° lik bir açı ölçer.
- Bir iletişim kutusu kadar uzattı sonra "Enter" tuşuna basın.
- Sol tıklama tyeni bir satır dik ucundan uzatılabilir böylece o pencere izleme.
- Bir başka ucunda aynı şekilde yeni bir çizgi çizin.
- İki sınırları RGCs sayısı sayılır, içinde oluşturulur.
- Hücre dokunuşlar sayılmaz bir dışlama çizgisi olarak bir sınırı seçin.
- Işaretleyici bir türünü seçin ve her canlı hücre bir takın.
- Ölü hücreleri için bir belirteç başka bir türü seçin.
- Yerleştirilen işaretleri her tür sayısı işaretleyici Araç çubuğunda buna göre işaretleyici simgesi yanında görüntülenir.
- Düzenleme modunu seçin ve kontur temel almak. Sağ izleme penceresinde tıklatın ve hat yeniden adlandırın.
- Kontur taban uzunluğu "Kontur Ölçme" butonuna basarak elde edilebilir.
- Hücrelerin sayısının daha sonra uzunluğunun mm başına ifade edilebilir.
- Sekmesini seçin "Dosya" nın altında "Farklı Kaydet".izleme ve marker veriler bir veri dosyası olarak kaydedilebilir.
5.. Bir RGC hücre hücre boyutu Ölçme
- Sekmesinde "File" altında "Resim Aç" seçeneğini seçin. Analiz etmek istediğiniz bir arzu retina bölgenin bir görüntü seçin.
- Canlı bir hücreye Zoom ve Ana Araç Çubuğu Açılan liste kutusundan kontur çizgisi türünü seçin.
- Hücrenin çevresi boyunca bir kontur çizgi çizmek.
- Sonunda ilgili olarak, sağ izleme penceresini tıklatın ve "End yakın kontur" seçeneğini seçin.
- Hücre alanı Kontur Ölçüm iletişim kutusundaki Alan kalemi altında gösterilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
1. Daha doğru bir kalınlığı ölçümü nasıl elde edilir?
Bu butonu "Zoom" e tıklayarak görüntüyü büyütmek ve izleme penceresinde sol tıklama yapabilirsiniz. INL sınır açıkça görülebilir. Çizginin ucu INL dış sınırında değilse, biz Düzenleme modu altında çizgi ayarlayabilirsiniz. Ilgili satırı alıp sonra sağ izleme penceresi tıklayın ve "Seçilmiş Kontur Nokta Ekle". Eklenen noktası aynı hat boyunca olmalıdır sırada bir nokta dış sınırında eklenebilir. Daha sonra, orijinal noktası silmek için olan ve daha kesin bir uzunluğa sahip bir hat elde edilebilir.
2. Lastik bant hattı 90 ° korumak için nasıl?
Derecesini gösteren bir iletişim kutusu kadar uzattı sonra, "Enter" tuşuna basarken hala fare tutmak zorunda. Sonra, yeni bir çizgi çizilir böylece izleme penceresinde sol tıklayın.
3. Nasıl canlı ve ölü hücreleri c yapmakarşın benziyor?
Sitoplazma ve açıkça gözlenen çekirdek ile kabaca yuvarlak olanlar hücreleri canlı RGCs olarak kabul edilmektedir. Bu nispeten küçük ve yoğunlaştırılmış hücreler ölü hücreleri olarak kabul edilmektedir.
4. Bu retina örnekleri mevcut protokolde H & E boyama maruz kalmışlardır. Bu floresan boyama ile retina örnek ölçmek mümkün mü?
Evet. Geçerli protokol H & retina bölümleri boyama E, floresan boyama ile retina örnek üzerinde olsa da aynı şekilde ölçmek olabilir. Örneğin, DAPI olarak boyanması kullanılarak Şekil 1'de gösterildiği gibi, her bir çekirdek 405 nm altında filtre boyanmış ve renk açısından görüntülenmiştir mavi olacaktır. Retina ganglion hücre tabakası (RGCL) içinde çekirdek, iç çekirdek tabakasında (INL) ve dış nükleer tabaka (ONL) görülebilir. Daha sonra farklı tabakaların kalınlığı bu video göstermiştir benzer bir şekilde tespit edilebilir.
Şekil 1..
Farklı lekeli floresan sinyallerin boyutu hakkında, grubumuzun bir sıçan glokom modeli (Luo ve ark, 2009) RGCL nöronların boyutu hakkında ilgili bir bildiri yayınladı.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.
Acknowledgments
Bu laboratuvarda göz araştırma çalışmaları Amerikan Sağlık Yardımcısı Vakfı, Açelya (1972) Bağış Fonu ve HKU Küçük Projeler Fonu (20097176185) tarafından desteklenmektedir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Stereo Investigator | MicroBright Field | ||
| Microscope | Olympus Corporation | BX51 |
References
- Lam, T. T., Abler, A. S., Tso, M. O. N-Methyl-D-Aspartate (NMDA)–Induced Apoptosis in Rat Retina. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 40, 2391-2397 (1999).
- Lam, T. T., Abler, A. S., Tso, M. O. Apoptosis and caspases after ischemia-reperfusion injury in rat retina. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 40, 967-975 (1999).
- Luo, X. G., Chiu, K., Lau, H. S., Lee, V. W. H., Yung, K. K. L., So, K. F. The Selective Vulnerability of Retinal Ganglion Cells in Rat Chronic Ocular Hypertension Model at Early Phase. Cellular and Molecular Neurobiology. 29 (8), 1143-1151 (2009).
- Han, Y. S., Chung, I. Y., Park, J. M., Yu, J. M. Neuroprotective effect of citicoline on retinal cell damage induced by kainic acid in rats. Korean J. Ophthalmol. 19, 219-226 (2005).
- Hernandez, M., Urcola, J. H. Retinal ganglion cell neuroprotection in a rat model of glaucoma following brimonidine, latanoprost or combined treatments. Exp. Eye Res. 86, 798-806 (2008).
- Chan, H. C., Chang, R. C. C., Ip, A. K. C., Chiu, K., Yuen, W. H., Zee, S. Y., So, K. F. Neuroprotective effects of Lycium barbarum Lynn on protecting retinal ganglion cells in an ocular hypertension model of glaucoma. Experimental Neurology. 203, 269-273 (2007).
