Summary
成人出生的神经元表达ChR2可以操纵片电生理的准备，以考察他们对嗅觉神经回路的功能的贡献。
Abstract
标准片电已使研究人员能够探测单个细胞的电反应记录在电器或药理操纵 1,2神经电路的各个组成部分。随着发明的方法，以光学控制基因有针对性的神经元（光遗传学），研究人员现在有一个前所未有的水平超过特定群体的神经元控制在标准片的准备。特别是，感光channelrhodopsin - 2（ChR2），使研究人员能够激活神经元，光3,4。通过结合基于LED的标准切片电ChR2 photostimulation小心校准，我们能够更详细地探测成人出生interneurons的嗅球，嗅觉系统的第一个中央继电器的作用。使用病毒表达ChR2 - YFP专门在成人出生的神经元，我们可以选择性地控制在旧环境的年轻成年出生的神经元ð成熟的神经元。我们的光控，使用一个简单而廉价的LED系统，我们展示了如何该系统可以进行校准，以了解需要多少光线唤起扣球在单个神经元的活动。因此，简短的闪烁的蓝灯可以远程控制ChR2转新生细胞的放电模式。
Protocol
1。光学校正：测量LED电源
- 将一个LED阵列积极冷却风扇，并加盖该LED /散热器aparatus一个准直透镜的散热片。
- 在明照明用LED /散热片/风扇/镜头仪器的更换灯泡。本设备必须仔细定位，使平行的LED光束对聚光镜的光沿直线路径传播。确保散热片/风扇是正确的接地系统的共同点。
- 电源，可以给当前的快速和方波驱动LED阵列。该电源可控制脉冲发生器产生一个5V TTL脉冲。
- 中心沿之间的视场光阑和冷凝器的镜头定义光路的准直光束。理想的情况下，LED光束会稍微过量的全面开放的视场光阑。通常情况下，更紧密平行的LED光束会少填补这个光圈，会产生铁道部E电源牺牲的统一性。在我们的设置中，我们增加了选择准直透镜，预计其在consenser膜片的共轭平面略有扩大图像的LED阵列光均匀。
- 实现由注重冷凝器，使视场光阑（最靠近光源的隔膜）的形象是集中对片室（ 图1）科勒照明。一个镜头纸薄组织可以作为投影屏幕，可视化集中在其他深度的视场光阑的图像。
- 钻一系列已知直径在一个不透明的材料的针孔。放置的光学功率计传感器，这些小针孔。将功率计对试样阶段，中心的电能表集中的视场光阑，通过简单的移动功率计，直到它提供了最大读数的形象。张贴在这个位置上的功率计。
- 完全打开光圈（aperature隔膜和视场光阑）。系统地将附片室/功率计，相对光学光路计算照射范围内的光功率的均匀性。构建你的系统的统一性情节。如果在显微镜正确设置与科勒照明目标的重点为中心，最大功率应直接下的目标，这一重点之外的地区，现在应该收到一个已知金额按均匀情节权力。
- 对于每一个针孔大小，建立标准曲线的光功率与针孔表面积。通过调整输入电流LED阵列，产生这条曲线在多种功率级别，从每条曲线，计算出每平方毫米的电源。如果是用于修补光学LED阵列，确保引进修补必要的光学元件（冷凝器，针孔和过滤器）知道多少光线下修补照明传输。
- 翻转功率计面对目标，在470nm的光照强度计算汞灯开启时。
- 添加一个活切片室，重建标准曲线，以确定通过散射脑组织传输的光功率。
2。程序切片和电
A部分：切片制备
- 麻醉（60毫克/公斤氯氨酮和甲苯噻嗪剂2mg/kg）和杀头的鼠标。解剖脑人工脑脊髓液（学联，MM：124 1.3 3氯化钾，氯化钠， 硫酸镁 ，26碳酸氢钠，1.25 NaHPO 4，20葡萄糖，氯化钙2〜310mOsm，pH值7.4时的混合物起泡95％O2和5％CO 2 5,1），注意不要损坏嗅球。琼脂分开的两个半球和地方，甚至一个边缘（水平段）的腹面。
- 胶琼脂和每个皮质半球的背水面的vibratome夹头，慢慢填补，用冰冷学联的洗澡。腹面切片在300微米的部分，传输每个加热（34-36 ° C）节和含氧学联，使他们能够恢复30-45分钟。
B部分：松散的门槛补丁测量秒杀
- 带来切片室温30分钟后，轻轻放置在显微镜下不断灌注含氧学联室录音室中分得一杯羹。
EYFP - ChR2存在过分刺激ChR2感染神经元的风险，可以确认下epifluorescence（图2A） - 拉吸管拉马（萨特的P - 97）玻璃电极。该电极与学联填充。当学联浴尖阻力应介于7-10兆欧。
- 在荧光灯照明，定位片与成熟形态健康ChR2 EYFP的神经元。同时定位下神经元的修补光学SOMA。
- 随着光积极通过电极尖端的压力，降低对确定的荧光神经元的补丁电极。膜接触时，迅速释放出积极的压力，并申请通过尖端的吸量小而短暂的。一个千兆欧姆密封应质膜和补丁电极的墙壁之间。
- GIGA密封即使没有形成，如果电极是足够接近一个荧光的神经元扣球活动应该产生一个可衡量的的局部领域的潜力。不同剂量的光闪烁激活ChR2在这个神经元。由于光剂量是两个LED电源和持续时间的函数，计算光线的多少，是必要的，以唤起动作电位在多个权力和持续时间（图2b）。此外观察扣球汞灯照明下发生多少。
3。代表性的成果：
在我们的显微镜（奥林巴斯BX51WI），我们的LED是我N线与2孔和一个聚光镜，从而保持了原有工厂安装的弧光灯的光路。通过关闭两个视场光阑和aperature隔膜，我们可以实现明对比足够的膜片钳记录（ 图1b）。所有隔膜完全打开，我们揭露切片channelrhodopsin激活（ 图1A）的最大光功率。在我们的显微镜，这个补丁配置产生的光密度约三个数量级，比最高的满场密度较低（4.1μW/ 2毫米与6.88毫瓦/平方毫米）。
一个成人出生的单ChR2 EYFP的表达粒细胞表明，我们看到强大的迁移在延髓的迁徙流（图2a）一个宽松的补丁录音神经母细胞的慢病毒感染后的标签成人出生的嗅球颗粒和periglomerular神经元周5毫秒的刺激在格言UM功率（6.88毫瓦/平方毫米 ）足以唤起扣球（ 图2b）。由于细胞之间的表达水平的变化，通过的门槛秒杀的光量会有所不同，应为每个感兴趣的细胞类型的统计学描述。
图1。满场photostimulation和膜片钳切片电LED阵列设置。要激活channelrhodopsin（ChR2），我们通过打开背面的光圈和冷凝器光学（一）项目一个准直光束。此配置可完全关闭的视场光阑和调节视场光阑的宽度（b）改为高对比度的修补光学。缩写：A.，B.散热器风扇，C. LED阵列，D.准直透镜，E.镜，F.场光阑，G.光圈，H.聚光镜， 一 SAmple阶段，J.目标。
图2。膜片钳和整场photostimulation嗅球（一）一个300μm的水平切片图像。可以看出，从嗅球的核心辐射Lentivirally感染的成人出生的颗粒细胞表达ChR2 - EYFP。光剂量需要引起扣球可以通过增加LED闪光灯的持续时间（二）发现。这粒细胞的阈值是5ms的完整的LED亮度（2.43mW/mm 2 ）。 （一）规模= 500微米，（B）= 50ms的规模。
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Discussion
近年来，人们在神经科学的研究6 optogenetic工具的普及爆炸。因此，它正变得越来越重要，希望开始使用这些新工具的实验室，以降低进入障碍。在这里，我们描述了如何进行一个简单和低成本的改造和传统的膜片钳钻机的校准，所以它可以做满场channelrhodopsin表达神经元光刺激。特别是，我们嗅球成年神经发生专门控制，新出生的神经元的研究应用此技术。
我们演示了如何确定是否ChR2激活了LED光源产生足够的权力，并演示如何本质上快速开/关速度的LED可以很容易地调节神经元的光剂量。虽然我们的实验室已经成功地使用这种技术，有替代方式，使神经元控制剂量轻每个W第i其自身的优点和缺点。
如果需要更多的光功率，会产生许多汞灯大大超过一个LED阵列的光，和显微镜的目标和过滤器设置已经存在聚焦到样品所需的波长。然而，这种解决方案既没有权力也没有暴露的持续时间可以很容易地控制。暴露的长度将需要由外部快门控制，这些往往比一个LED阵列更昂贵，并且电源将需要加入中性密度滤光片的光路衰减 - 引起震动，将减少风险膜片钳实验的成功率。
我们的实施也使得它难以控制的空间范围的照明。如果现场的照明需要针对特定群体的ChR2表达神经元，一个解决方案是一个galvometer扫描镜不同的激光点扫描片上的位置。然而，在这一点上，在显微镜开始像一个传统的复杂性和成本的共聚焦显微镜。最近开发的一个替代方案是，集中到一个微型LED阵列的形象 ，样本7或形状与数字微镜器件8的均匀场的激励。
LED阵列具有明显的优势，使它们特别适合channelrhodopsin刺激。他们开/关速度纳秒时间尺度上发生，所以这个速度可用于微调光线照射到生物组织的持续时间。此外，LED的颜色可以选择，以适应特定的激发波段，而不需要过滤。红移channelrhodopsin突变体的出现，这将是简单的使用两种不同颜色的LED分别激发两个不同人群的神经元。此外，白光LED阵列 - 如本报告中使用的一个结合蓝色（450nm的pEAK）和绿色（550nm的峰值）氮化镓二极管 - 广谱这给调查的目标激发带的广泛的自由。
光学校正后，必须每个细胞类型，表示channelrhodopsin特点，以确定需要多少光线，以唤起动作电位。我们描述了一个简单的电生理特性，使用宽松的修补方法，避免用移液管的解决方案改变细胞的内部动力的优势。然而，在一个完整的研究的全细胞记录是必要的，以确定光线的多少会产生一定量的去极化，并随着时间的推移这些诱发电位的稳定。不幸的是，扣球活动光剂量的敏感性取决于实验控制之外的参数。这些措施包括ChR2表达水平（病毒PROM的建设套数的功能和发育调控oter）和神经元的9固有的生物物理特性。
ChR2 EYFP的融合荧光强度可能会需要多少光线带来的神经元的阈值指标。不过，也有这种内在聚合渠道造成估计非线性，分流通过激活通道远端穗启动区造成的电导。最终，所有类型的神经元的人口的统计特性将要作出的。这遭受昏暗荧光细胞是很难打补丁的，所以病毒的结构可能会受益于额外的荧光标记，是somatically 限制 10的告诫。
这显然是多余的，如果光可以用来控制其扣球活动修补ChR2感染神经元。更好地利用一个体外的光遗传学调查突触连接的optogenetically有针对性的人口与电路的其他成员。在我们手中，我们再加上满场ChR2与膜片钳记录的成年出生的僧帽细胞的颗粒细胞刺激新形成的突触来衡量这两种类型的细胞4的属性。因为一个单一的颗粒和僧帽细胞之间的连接概率非常低，我们的实验是唯一可能数以百计ChR2表达颗粒细胞的同时激活。未来发现新的遗传标记和新病毒的交付方法，标签特定的神经元的人口将增加在体外光遗传学在不同的系统的实用性。特别是，这种技术非常适合发现意想不到的神经元亚群11,12之间稀疏，但有着密切的联系。由于这种技术使用的各种的不断增长，因此需要简单和低成本的硬件来控制光传送到体外片。
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Disclosures
没有利益冲突的声明。
Acknowledgments
这项工作是支持由寿险公司“AG2R - LA - MONDIALE”，巴黎高等DES神经科学（ENP），法新社国立德拉Recherche“的ANR - 09 - NEUR - 004”框架“的ERA - NET神经“第七框架计划由欧盟委员会和巴斯德基金会。塞巴斯蒂安瓦格纳Letten基金会的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ketamine | Imalgène 1000 | 100 mg/ml | |
| Xylazine | Rompun | 2% | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S5886 | &nbps; |
| KCl | Sigma-Aldrich | P5405 | |
| MgSO4 | Sigma-Aldrich | M1880 | |
| NaHCO3 | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| NaHPO4 | Sigma-Aldrich | S5011 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G7021 | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C7902 | |
| Agarose | Sigma-Aldrich | A9539 | |
| Pipette Puller | Sutter Instrument Co. | P-97 | |
| Glass Capillaries | Harvard Apparatus | GC150T-10 | 1.5 mm O.D./1.17 mm I.D. |
| LED array | Bridgelux | BXRA-C2000 | |
| Collimating lens | Thorlabs Inc. | LEDC1 | 40 mm beam diameter |
| Power supply | A1W Electronik | HKO2800 | 2.8 amp |
| Optical power meter | Thorlabs Inc. | PM 100 | |
| Heatsink | Thermaltake | A1838 | Silent Boost K8 |
| Fan | Thermaltake | A1838 | Silent Boost K8 |
| Vibratome | Leica Microsystems | VT1200S |
References
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