Summary
वयस्क में जन्मे ChR2 व्यक्त न्यूरॉन्स टुकड़ा electrophysiological तैयारी में चालाकी से किया जा सकता है क्रम में घ्राण तंत्रिका सर्किट के समारोह के प्रति उनके योगदान की जांच करने के लिए.
Abstract
मानक टुकड़ा इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी शोधकर्ताओं ने बिजली या औषधीय जोड़तोड़ 1,2 के जवाब में एकल कक्षों के विद्युत प्रतिक्रिया रिकॉर्डिंग से तंत्रिका circuitry के अलग - अलग घटकों की जांच करने के लिए अनुमति दी गई है. ऑप्टिकली आनुवंशिक रूप से लक्षित न्यूरॉन्स (optogenetics) पर नियंत्रण के तरीकों के आविष्कार के साथ, शोधकर्ताओं ने अब मानक टुकड़ा तैयारी में न्यूरॉन्स के विशिष्ट समूहों पर नियंत्रण का एक अभूतपूर्व स्तर है. विशेष रूप से, channelrhodopsin-2 (ChR2) 3,4 प्रकाश के साथ सहज शोधकर्ताओं न्यूरॉन्स सक्रिय करने के लिए अनुमति देता है. ChR2 मानक टुकड़ा इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी साथ एलईडी आधारित photostimulation सावधान अंशांकन के संयोजन से, हम अधिक से अधिक विस्तार के साथ घ्राण बल्ब, घ्राण प्रणाली के पहले केंद्रीय रिले में वयस्क जन्मे interneurons की भूमिका की जांच कर रहे हैं. ChR2 YFP के वायरल अभिव्यक्ति वयस्क जन्मे न्यूरॉन्स में विशेष का प्रयोग, हम चुनिंदा पुराने के परिवेश में युवा वयस्क जन्मे न्यूरॉन्स नियंत्रण कर सकते हैंघ परिपक्व न्यूरॉन्स. हमारे ऑप्टिकल नियंत्रण एक सरल और सस्ती एलईडी प्रणाली का उपयोग करता है, और हम दिखाने के लिए कैसे इस प्रणाली को समझने के लिए कितना प्रकाश एकल न्यूरॉन्स में गतिविधि spiking आह्वान की जरूरत है calibrated किया जा सकता है. इसलिए, नीले प्रकाश की संक्षिप्त चमक दूर ChR2 transduced नवजात कोशिकाओं का फायरिंग पैटर्न पर नियंत्रण कर सकते हैं.
Protocol
1. ऑप्टिकल अंशांकन: माप एलईडी पावर
- एक सक्रिय रूप से एक प्रशंसक और इस एलईडी / heatsink aparatus प्रत्यय द्वारा एक collimating लेंस करने के लिए ठंडा heatsink के लिए एक एलईडी सरणी संलग्न.
- बदलें दीपक एलईडी / heatsink / प्रशंसक / लेंस तंत्र के साथ brightfield रोशनी में इस्तेमाल किया. इस तंत्र को ध्यान से तैनात किया जाना चाहिए ताकि collimated बीम एलईडी कंडेनसर लेंस की दिशा में एक सीधे ऑप्टिकल पथ के साथ यात्रा. यकीन है कि heatsink / प्रशंसक ठीक प्रणाली के आम भूमि पर आधारित है.
- एक बिजली की आपूर्ति है कि तेजी से और वर्तमान के वर्ग दालों दे सकते हैं के साथ एलईडी सरणी ड्राइव. यह बिजली की आपूर्ति एक 5V टीटीएल एक पल्स जनरेटर से उद्भव नाड़ी द्वारा नियंत्रित किया जा सकता है.
- केंद्र प्रकाश क्षेत्र डायाफ्राम और condensor लेंस के बीच परिभाषित मार्ग के किनारे collimated बीम. आदर्श रूप में, एलईडी बीम थोड़ा पूरी तरह से खोला क्षेत्र डायाफ्राम उमड़ाना जाएगा. आमतौर पर, एक और अधिक कस collimated एलईडी बीम इस कम एपर्चर को भरने जाएगा है, और mor उपज जाएगाई एकरूपता की कीमत पर सत्ता. हमारे सेटअप में हम एक collimating लेंस है कि consenser डायाफ्राम में संयुग्म विमान में एलईडी सरणी के एक थोड़ा विस्तार छवि अनुमान को चुनने के द्वारा प्रकाश एकरूपता वृद्धि हुई है.
- संघनित्र इतना है कि क्षेत्र डायाफ्राम (प्रकाश स्रोत के लिए निकटतम डायाफ्राम) की छवि टुकड़ा कक्ष (1 छवि) पर ध्यान केंद्रित है ध्यान केंद्रित द्वारा Kohler रोशनी पाना. लेंस कागज की एक पतली ऊतक एक प्रोजेक्शन स्क्रीन के रूप में कार्य करने के लिए अन्य गहराई में क्षेत्र डायाफ्राम का ध्यान केंद्रित छवि की कल्पना कर सकते हैं.
- एक अपारदर्शी सामग्री में जाना जाता है व्यास के pinholes की एक श्रृंखला ड्रिल. एक ऑप्टिकल बिजली मीटर के संवेदक पर इन छोटे pinholes रखें. नमूना और बस बिजली मीटर चलती है जब तक यह अधिकतम पढ़ने देता क्षेत्र डायाफ्राम की छवि पर ध्यान केंद्रित बिजली मीटर केंद्र स्तर पर बिजली मीटर रखें. इस स्थिति में प्रत्यय बिजली मीटर.
- पूरी तरह से सभी (aperature डायाफ्राम apertures और खोलोडायाफ्राम क्षेत्र). व्यवस्थित संलग्न टुकड़ा चैम्बर / ऑप्टिकल LightPath के सापेक्ष शक्ति मीटर चाल और प्रबुद्ध क्षेत्र के भीतर ऑप्टिकल शक्ति की एकरूपता की गणना. आपके सिस्टम के लिए एकरूपता की साजिश बनाएँ. यदि खुर्दबीन ठीक Kohler रोशनी के साथ सेटअप उद्देश्य ध्यान केंद्रित पर केंद्रित है, अधिकतम शक्ति सीधे उद्देश्य के नीचे हो सकता है, करना चाहिए और इस ध्यान के बाहर क्षेत्रों अब एकरूपता साजिश के अनुसार शक्ति का एक ज्ञात राशि प्राप्त करना चाहिए.
- Pinhole में से प्रत्येक आकार के लिए, ऑप्टिकल शक्ति बनाम pinhole सतह क्षेत्र के एक मानक वक्र का निर्माण. एलईडी सरणी के लिए वर्तमान इनपुट का समायोजन करके, एकाधिक सत्ता के स्तर पर इस वक्र उत्पादन और mm2 प्रति प्रत्येक वक्र से बिजली की गणना. यदि एलईडी सरणी पट्टी प्रकाशिकी के लिए इस्तेमाल किया जा रहा है, ऑप्टिकल पट्टी (condensers, pinholes और फिल्टर) के लिए आवश्यक तत्वों को लागू करने के लिए पता है कितना प्रकाश पट्टी रोशनी के तहत फैलता है सुनिश्चित करें.
- बिजली मीटर flippingउद्देश्य चेहरा, 470nm पर रोशनी की तीव्रता की गणना जब पारा दीपक चालू है.
- चैम्बर के लिए एक जीवित टुकड़ा जोड़ें और मानक घटता के पुनर्निर्माण के लिए प्रकाश बिखरने मस्तिष्क के ऊतकों के माध्यम से प्रेषित सत्ता का निर्धारण.
2. टुकड़ा करने की क्रिया प्रक्रिया और इलैक्ट्रोफिजियोलॉजी
भाग एक: स्लाइस तैयार
- Anesthetize (60 मिलीग्राम / किग्रा Ketamine और 2mg/kg Xylazine) और माउस सिर काटना. ; ~ 310mOsm, पीएच 7.4 जब का एक मिश्रण के साथ bubbled NaCl 124, 3 KCl, 1.3 MgSO 4, 26 NaHCO 3, 1.25 4 NaHPO 20, ग्लूकोज, 2 CaCl 2: कृत्रिम मस्तिष्क रीढ़ की हड्डी में तरल पदार्थ में मस्तिष्क (ACSF मिमी में काटना 95% O2 और 5% 2) 5,1 सीओ, ख्याल रख रही घ्राण बल्ब नुकसान नहीं है . अगर पर एक किनारे (क्षैतिज वर्गों के लिए) के साथ भी ventral सतह के साथ दो गोलार्द्धों और जगह अलग करें.
- अगर और vibr प्रत्येक cortical गोलार्द्ध के पृष्ठीय सतह गोंदatome चक, और धीरे धीरे ठंडा ACSF के साथ स्नान को भरने. 300 सुक्ष्ममापी वर्गों में ventral सतह से स्लाइस, गरम (34-36 ° C) करने के लिए प्रत्येक अनुभाग के हस्तांतरण और oxygenated ACSF, उन्हें 30-45 मिनट के लिए ठीक करने के लिए अनुमति देता है.
भाग ख थ्रेसहोल्ड के ढीला पैच स्पाईक मापन:
- 30 मिनट के लिए कमरे के तापमान को स्लाइस लाने के बाद, धीरे oxygenated ACSF की लगातार छिड़काव के तहत खुर्दबीन कक्ष की रिकॉर्डिंग कक्ष में एक टुकड़ा जगह है.
जरूरत से ज्यादा ChR2 संक्रमित न्यूरॉन्स उत्तेजक के जोखिम को कम EYFP - ChR2 की उपस्थिति epifluorescence (छवि 2a) के तहत पुष्टि की जा सकती - कांच इलेक्ट्रोड एक विंदुक डांड़ी (Sutter P-97) पर खींचो. ACSF इस इलेक्ट्रोड के साथ भरें. जब ACSF स्नान में रखा टिप प्रतिरोध 7-10 MOhms के बीच होना चाहिए.
- फ्लोरोसेंट रोशनी के तहत, एक स्वस्थ ChR2 - EYFP न्यूरॉन परिपक्व आकारिकी के साथ टुकड़ा में ढूँढ. इसके अलावा पट्टी प्रकाशिकी के तहत इस न्यूरॉन सोमा का पता लगाने.
- प्रकाश सकारात्मक इलेक्ट्रोड टिप के माध्यम से पारित दबाव के साथ, पहचान फ्लोरोसेंट न्यूरॉन की ओर पैच इलेक्ट्रोड कम है. जब झिल्ली संपर्क किया है, जल्दी सकारात्मक दबाव जारी है और टिप के माध्यम से चूषण के एक छोटे और संक्षिप्त राशि लागू. एक मुहर giga ओम प्लाज्मा झिल्ली और पैच इलेक्ट्रोड की दीवारों के बीच बनाया जाना चाहिए.
- यहां तक कि अगर एक giga मुहर का गठन नहीं, अगर इलेक्ट्रोड पर्याप्त एक फ्लोरोसेंट न्यूरॉन गतिविधि spiking के करीब है एक औसत दर्जे का स्थानीय क्षेत्र के संभावित उत्पादन करना चाहिए है. प्रकाश के विभिन्न खुराक चमकती द्वारा ChR2 इस न्यूरॉन में सक्रिय करें. क्योंकि प्रकाश खुराक दोनों एलईडी शक्ति और अवधि का एक समारोह है गणना, कितना प्रकाश कई शक्तियों और durations के (छवि 2b) पर एक संभावित कार्रवाई का आह्वान आवश्यक है. इसके अलावा निरीक्षण कितना spiking पारा दीपक रोशनी के तहत होता है.
3. प्रतिनिधि परिणाम:
हमारे खुर्दबीन पर (ओलिंप BX51WI), हमारे एलईडी मैं हैn लाइन 2 apertures और एक कंडेनसर लेंस के साथ, इस प्रकार कारखाने स्थापित चापदीप के मूल LightPath बनाए रखने. दोनों क्षेत्र डायाफ्राम और aperature डायाफ्राम बंद करके, हम brightfield विपरीत पैच दबाना रिकॉर्डिंग (छवि 1b) के लिए पर्याप्त प्राप्त कर सकते हैं . सभी diaphragms के साथ पूरी तरह से खुला हम channelrhodopsin सक्रियण (छवि 1a) के लिए अधिकतम प्रकाश शक्ति टुकड़ा बेनकाब . हमारे खुर्दबीन पर, इस पट्टी विन्यास प्रकाश घनत्व है कि परिमाण के लगभग तीन आदेश अधिकतम पूरा क्षेत्र घनत्व से कम (4.1 μW / 2 मिमी बनाम 6.88 मेगावाट / 2 मिमी) पैदा करता है .
हम विजय - स्तम्भ प्रवासी (2a छवि) स्ट्रीम एक ढीला पैच से रिकॉर्डिंग में neuroblasts पलायन के lentiviral संक्रमण के बाद वयस्क जन्मे घ्राण बल्ब ग्रेन्युल और periglomerular न्यूरॉन्स सप्ताह के मजबूत लेबलिंग देखते हैं एक एकल वयस्क जन्मे ChR2 EYFP ग्रेन्युल सेल व्यक्त कि इंगित करता है एक कहावत में 5 एमएस उत्तेजनाउम, शक्ति (6.88 मेगावाट / 2 मिमी) spiking (छवि 2b) पैदा करने के लिए पर्याप्त है. अभिव्यक्ति के स्तर के बाद से कोशिकाओं के बीच बदलता है, प्रकाश की राशि है कि स्पाइक के लिए दहलीज गुजरता भिन्न और सांख्यिकीय ब्याज की प्रत्येक कोशिका प्रकार के लिए में वर्णित किया जाना चाहिए.
चित्रा 1 पूरे क्षेत्र photostimulation और पैच दबाना टुकड़ा इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी के लिए सरणी सेटअप का नेतृत्व किया . Channelrhodopsin सक्रिय (ChR2) हम खुली पीठ apertures और संघनित्र प्रकाशिकी (क) के माध्यम से एक collimated बीम परियोजना. यह विन्यास पूरी तरह से क्षेत्र डायाफ्राम बंद करने और क्षेत्र डायाफ्राम की modulating चौड़ाई (ख) के द्वारा उच्च विपरीत पट्टी प्रकाशिकी में बदला जा सकता है. Abbreviations: ए प्रशंसक, ज. heatsink, सी. एलईडी सरणी, मृ collimating लेंस, ई. दर्पण, एफ क्षेत्र डायाफ्राम, जी एपर्चर डायाफ्राम, एच. कंडेनसर लेंस, मैं साmple मंच, जे उद्देश्य.
चित्रा 2 पैच दबाना और पूरे क्षेत्र photostimulation के लिए एक 300μm घ्राण बल्ब की क्षैतिज टुकड़ा (एक) की छवि . Lentivirally संक्रमित वयस्क जन्मे ग्रेन्युल ChR2 - EYFP व्यक्त कोशिकाओं घ्राण बल्ब की कोर से radiating देखा जा सकता है. प्रकाश spiking आह्वान करने के लिए आवश्यक खुराक एलईडी फ्लैश (ख) की अवधि को बढ़ाने के द्वारा पाया जा सकता है. इस ग्रेन्युल कक्ष के लिए दहलीज पूर्ण एलईडी तीव्रता (2 2.43mW/mm) पर 5ms था. स्केल में (क) = 500μm, (ख) = 50ms में बड़े पैमाने.
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Discussion
तंत्रिका विज्ञान अनुसंधान के लिए 6 optogenetic उपकरणों की लोकप्रियता में हाल के वर्षों में एक विस्फोट देखा है. एक परिणाम के रूप में, यह तेजी से महत्वपूर्ण है इन नए उपकरणों का उपयोग शुरू करने के इच्छुक प्रयोगशालाओं के लिए प्रवेश की बाधा को कम. यहाँ हम का वर्णन कैसे एक साधारण और कम लागत और एक पारंपरिक पैच दबाना रिग के retrofitting अंशांकन का संचालन करने के लिए इतना है कि यह पूरा क्षेत्र channelrhodopsin - न्यूरॉन्स व्यक्त की ऑप्टिकल उत्तेजना कर सकते हैं. विशेष रूप में, हम घ्राण बल्ब वयस्क के लिए विशेष रूप से प्रकाश के साथ नवजात न्यूरॉन्स नियंत्रण neurogenesis का अध्ययन करने के लिए इस तकनीक को लागू.
हम प्रदर्शन कैसे निर्धारित करने के लिए अगर एक एलईडी प्रकाश स्रोत ChR2 सक्रियण के लिए पर्याप्त बिजली का उत्पादन, और प्रदर्शन कैसे आंतरिक रूप से तेजी से / एल ई डी की गति बंद आसानी से न्यूरॉन्स के लिए दिए गए प्रकाश की मात्रा को विनियमित कर सकते हैं. हालांकि हमारी प्रयोगशाला सफलतापूर्वक इस तकनीक का इस्तेमाल किया है, वहाँ प्रकाश प्रत्येक w की नियंत्रित खुराक न्यूरॉन्स को उजागर करने के वैकल्पिक तरीके हैंith अपने स्वयं के लाभ और कमियां.
यदि अधिक ऑप्टिकल शक्ति की जरूरत है, कई पारा लैंप काफी अधिक एक एलईडी सरणी से प्रकाश उपज है, और एक खुर्दबीन के उद्देश्य और फिल्टर सेट पहले से ही नमूना पर वांछित तरंगदैर्य ध्यान केंद्रित मौजूद हैं. हालांकि, इस समाधान के साथ न तो सत्ता और न ही जोखिम की अवधि को आसानी से नियंत्रित किया जा सकता है. जोखिम की लंबाई के लिए एक बाहरी शटर द्वारा नियंत्रित किया जा जरूरत है, और ये अक्सर एक एलईडी सरणी से ज्यादा महंगा है, और सत्ता में प्रकाश रास्ते पर तटस्थ घनत्व फिल्टर जोड़कर तनु हो की आवश्यकता होगी - कंपन है कि कम करेगा के कारण के जोखिम पर पैच दबाना प्रयोगों की सफलता दर.
हमारी कार्यान्वयन भी यह मुश्किल रोशनी के स्थानिक हद तक नियंत्रित करने के लिए बनाता है. यदि स्पॉट रोशनी ChR2 व्यक्त न्यूरॉन्स के विशिष्ट समूहों को लक्षित करने के लिए वांछित है, एक समाधान के लिए galvometer स्कैनिंग अलग दर्पण के साथ एक लेजर हाजिर स्कैनटुकड़ा पर स्थानों. इस बिंदु पर, तथापि, माइक्रोस्कोप के लिए जटिलता और लागत दोनों में एक पारंपरिक confocal सूक्ष्मदर्शी के समान करने के लिए शुरू होता है. हाल ही में विकसित वैकल्पिक 7 नमूना पर एक सूक्ष्म नेतृत्व सरणी की छवि का ध्यान केंद्रित है, या एक डिजिटल micromirror 8 डिवाइस के साथ उत्तेजना का एक समान क्षेत्र आकार है.
एलईडी arrays विशिष्ट लाभ है कि उन्हें विशिष्ट channelrhodopsin उत्तेजना के लिए उपयुक्त बनाने. उनके गति बंद / पर nanosecond timescales पर होता है और इसलिए इस गति को पतले जैविक ऊतकों को प्रकाश जोखिम की अवधि धुन इस्तेमाल किया जा सकता है. इसके अलावा, एल ई डी के रंग फ़िल्टरिंग के लिए आवश्यकता के बिना विशिष्ट उत्तेजना बैंड फिट चुना जा सकता है. लाल स्थानांतरित channelrhodopsin म्यूटेंट के आगमन के साथ, यह आसान हो सकता है अलग अलग रंग के दो एल ई डी का उपयोग करने के लिए व्यक्तिगत न्यूरॉन्स की दो अलग आबादियों उत्तेजित होगा. इस रिपोर्ट में इस्तेमाल किया है कि एक नीले जोड़ती की तरह (450nm पी - वैकल्पिक रूप से, सफेद एलईडी arrays) eak और हरे रंग (550nm) शिखर गैलियम नाइट्राइड डायोड - व्यापक स्पेक्ट्रम जो अन्वेषक उत्तेजना बैंड की एक विस्तृत श्रृंखला को लक्ष्य करने की स्वतंत्रता देता है.
ऑप्टिकल अंशांकन के बाद, प्रत्येक कोशिका प्रकार है कि channelrhodopsin व्यक्त करने के लिए निर्धारित है कितना प्रकाश की आवश्यकता है के लिए एक कार्रवाई संभावित आह्वान की विशेषता होना चाहिए. हम एक सरल electrophysiological ढीले पैच विधि है, जो विंदुक समाधान के साथ बदलने सेल आंतरिक गतिशीलता से बचने के लाभ दिया है का उपयोग लक्षण वर्णन का वर्णन. हालांकि, एक पूर्ण अध्ययन में पूरे सेल रिकॉर्डिंग निर्धारित करने के लिए कितना प्रकाश विध्रुवण के एक दी गई राशि का उत्पादन है, और समय पर इन पैदा क्षमता की स्थिरता के लिए आवश्यक हैं. दुर्भाग्य से प्रकाश खुराक गतिविधि spiking की संवेदनशीलता प्रायोगिक नियंत्रण के बाहर मानकों का एक संख्या पर निर्भर करता है. ये ChR2 अभिव्यक्ति के स्तर (निर्माण प्रतिलिपि संख्या के एक समारोह और वायरल प्रोम के विकास विनियमन शामिल हैंoter), और 9 न्यूरॉन के आंतरिक biophysical गुणों.
ChR2 - EYFP संलयन के फ्लोरोसेंट तीव्रता कितना प्रकाश सीमा के न्यूरॉन लाने की जरूरत है की एक संकेतक हो सकता है. हालांकि, वहाँ चैनल की भाँति समुच्चय के कारण अनुमान इस प्रकार में nonlinearities हैं, और स्पाइक दीक्षा क्षेत्र के लिए बाहर का चैनल को सक्रिय करने की वजह से conductances shunting द्वारा. अंततः, न्यूरॉन के हर प्रकार के लिए आबादी का एक सांख्यिकीय लक्षण वर्णन किया होगा. इस चेतावनी के लिए ग्रस्त है कि dimly फ्लोरोसेंट कोशिकाओं को पैच करने के लिए मुश्किल हैं, और इतना वायरल constructs एक अतिरिक्त फ्लोरोसेंट लेबल है कि somatically 10 प्रतिबंधित है से लाभ हो सकता है.
यह स्पष्ट है निरर्थक ChR2 संक्रमित न्यूरॉन पैच यदि प्रकाश करने के लिए अपने spiking गतिविधि को नियंत्रित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. इन विट्रो में optogenetics के बेहतर इस्तेमाल के लिए एक optogenetically synaptic कनेक्टिविटी की जांच करने के लिए हैसर्किट के अन्य सदस्यों के साथ आबादी को निशाना बनाया. हमारे हाथ में, हम ChR2 वयस्क जन्म पैच दबाना रिकॉर्डिंग के साथ mitral कोशिकाओं से ग्रेन्युल कोशिकाओं का पूरा क्षेत्र उत्तेजना मिलकर इन दो सेल 4 प्रकार के बीच नवगठित synapse के गुणों को मापने. क्योंकि एक एकल ग्रेन्युल और द्विकपर्दी सेल के बीच संपर्क की संभावना बहुत कम है, हमारी प्रयोग केवल कई ChR2 सैकड़ों ग्रेन्युल कोशिकाओं को व्यक्त करने के युगपत सक्रियण द्वारा ही संभव था. नए आनुवंशिक मार्करों और नई वायरल वितरण के लिए विशिष्ट neuronal आबादी लेबल तरीकों के विभिन्न प्रणालियों में भविष्य की खोज में इन विट्रो optogenetics की उपयोगिता में वृद्धि होगी. विशेष रूप से, इस तकनीक आदर्श अप्रत्याशित neuronal 11,12 सबसेट के बीच विरल लेकिन मजबूत कनेक्शन की खोज के लिए अनुकूल है. के रूप में इस तकनीक के लिए उपयोग की विविधता बढ़ती है, तो सरल और कम लागत हार्डवेयर के लिए की जरूरत में इन विट्रो स्लाइस पर दिया प्रकाश को नियंत्रित करने के लिए होगा.
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Disclosures
ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.
Acknowledgments
यह काम "युग नेट न्यूरॉन के फ्रेम में जीवन बीमा कंपनी" AG2R ला Mondiale "इकोले देस न्यूरोसाइंसेस डी पेरिस (ENP), Agence Nationale डे ला Recherche" ANR-09-NEUR-004 "द्वारा समर्थित किया गया था "यूरोपीय आयोग, और पाश्चर फाउंडेशन द्वारा FP7 कार्यक्रम के. सेबैश्चियन वैगनर Letten फाउंडेशन द्वारा समर्थित किया गया था.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ketamine | Imalgène 1000 | 100 mg/ml | |
| Xylazine | Rompun | 2% | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S5886 | &nbps; |
| KCl | Sigma-Aldrich | P5405 | |
| MgSO4 | Sigma-Aldrich | M1880 | |
| NaHCO3 | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| NaHPO4 | Sigma-Aldrich | S5011 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G7021 | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C7902 | |
| Agarose | Sigma-Aldrich | A9539 | |
| Pipette Puller | Sutter Instrument Co. | P-97 | |
| Glass Capillaries | Harvard Apparatus | GC150T-10 | 1.5 mm O.D./1.17 mm I.D. |
| LED array | Bridgelux | BXRA-C2000 | |
| Collimating lens | Thorlabs Inc. | LEDC1 | 40 mm beam diameter |
| Power supply | A1W Electronik | HKO2800 | 2.8 amp |
| Optical power meter | Thorlabs Inc. | PM 100 | |
| Heatsink | Thermaltake | A1838 | Silent Boost K8 |
| Fan | Thermaltake | A1838 | Silent Boost K8 |
| Vibratome | Leica Microsystems | VT1200S |
References
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