Summary
ChR2を表現成人生まれのニューロンは嗅覚神経回路の機能に向けての貢献を検討するために、スライスの電気生理学的な準備に操作することができます。
Abstract
標準スライスの電気生理学は、研究者は電気的または薬理学的操作の1,2に対応して単一細胞の電気的応答を記録することによって、神経回路の個々のコンポーネントをプローブすることができました。光学的に遺伝的に標的ニューロンを（optogenetics）を制御する方法の発明で、研究者は今、標準のスライス標本におけるニューロンの特定のグループを制御するための前例のないレベルを持っている。特に、感光channelrhodopsin - 2（ChR2）研究者が光3,4でニューロンを活性化することができます。標準スライスの電気生理学とChR2のLEDベースの光刺激を慎重にキャリブレーションを組み合わせることで、我々はより詳細で嗅球、嗅覚系の最初の中心的なリレーの成人生まれの介在の役割を調べることができます。成人生まれのニューロンで特異的にChR2 - YFPのウイルスの式を使用して、我々は選択的に古いの環境では若い成人生まれのニューロンを制御することができますD成熟ニューロン。私たちの光制御が簡単で安価なLEDシステムを使用して、そして我々は、このシステムは、光が単一のニューロンのスパイク活動を喚起するために必要とされるどの程度理解するためにキャリブレーションする方法を示しています。したがって、青色光の短い点滅は、リモートChR2形質導入新生児の細胞の発火パターンを制御することができます。
Protocol
1。光学的キャリブレーション：測定LEDパワー
- 積極的にファンや接辞によってコリメートレンズにこのLED /ヒートシンクのaparatusを冷却するヒートシンクにLEDアレイを取り付けます。
- LED /ヒートシンク/ファン/レンズ装置で明視野照明で使用されているランプを交換してください。この装置は慎重にコリメートLEDビームが集光レンズに向かってまっすぐな光路に沿って移動するように配置する必要があります。ヒートシンク/ファンが適切にシステムの共通のグランドに接地されていることを確認します。
- 現在の高速かつ矩形パルスを与えることができる電源とLEDアレイを駆動する。この電源は、パルス発生器から発信された5VのTTLパルスによって制御されることがあります。
- 中心視野絞りとコンデンサーレンズの間に定義された光路に沿って平行ビーム。理想的には、LEDの光がわずかに完全に開かれた視野絞りを入れすぎないでしょう。一般的に、より緊密にコリメートLEDビームが少ないこの口径を記入し、MORが生成されます均一性を犠牲にして、電子パワー。我々のセットアップでは、consenserのダイヤフラムで、その共役面にLEDアレイの若干拡大画像を投影コリメートレンズを選択することで、光の均一性を増加した。
- 視野絞り（光源に最も近い絞り）の画像をスライスチャンバー（ 図1）に焦点を当てているようにコンデンサーを集中しケーラー照明を実現。レンズの紙の薄い組織は、他の深さで視野絞りの焦点像を可視化するために、投影するスクリーンとして機能することができます。
- 不透明な材料で知られている直径のピンホールの一連のドリル。光パワーメータのセンサー上でこれらの小さなピンホールは1を置きます。それが最大の読みを与えるまで、単純にパワーメータを移動することにより、視野絞りの焦点画像の上に試料ステージと中央電力計の電力計を置きます。この位置に貼ってパワーメータ。
- 完全にすべての開口部（アパーチャ絞りを開いて、視野絞り）。体系的に光学的光パスに接続されたスライスチャンバー/パワーメータの相対的に移動し、照射領域内の光パワーの均一性を計算する。お使いのシステムのための均一性のプロットを構築する。顕微鏡を正しく客観的の焦点を中心とするケーラー照明と設定されている場合、最大電力は、直接目的の下でなければ、そしてこの焦点の外側の領域は、現在、均一性のプロットに基づいて電力の既知量を受信する必要があります。
- ピンホールの各サイズについては、光パワー対ピンホールの表面積の標準曲線を構築する。 LEDアレイへの入力電流を調整することによって、複数のパワーレベルでこの曲線を生成し、それぞれの曲線からmm2当たりの電力を計算する。 LEDアレイは、パッチの光学系に使用する場合、パッチを適用する照明の下で送信されるどのくらいの光を知るためにパッチを適用するために必要な光学素子を（コンデンサ、ピンホールおよびフィルタ）を導入することを確認してください。
- パワーメータを反転水銀ランプがオンになっているときに客観的に直面し、470nmでの照度を計算する。
- チャンバーにライブスライスを追加し、散乱の脳組織を透過した光パワーを決定するための標準曲線を再構築する。
2。スライシング手続きと電気生理学
パート：スライス標本
- 麻酔（60 mg / kgのケタミンとキシラジン2mg/kg）とマウスを刎ねる。の混合物でバブリング時〜310mOsm、pH7.4の、124のNaCl、3のKCl、1.3 MgSO 4を用い 、26のNaHCO 3、1.25 NaHPO 4、20グルコース、2のCaCl 2：MMの人工脳脊髄液（ACSF、に脳を解剖する嗅球を損傷しないように注意しながら95％O2、5％CO 2 5,1）、。一方のエッジ（水平方向のセクションの）でさえ腹側表面に寒天上の2つの半球と場所を区切ります。
- 接着剤vibrに寒天と各半球皮質の背側表面atomeチャック、そしてゆっくりと氷冷ACSFでお風呂を埋める。 300μm以下のセクションでは腹側表面からスライス、彼らが30〜45分で回復できるように、温めておいた（34-36 ° C）と酸素ACSFに各セクションを転送する。
パートB：スパイクのしきい値のルースパッチの測定
- 30分間室温にスライスをもたらすの後、静かに酸素ACSFの一定灌流下で顕微鏡のチャンバーの記録室内のスライスを配置します。
過度にChR2感染した神経細胞を刺激するの危険にさらされ、EYFP - ChR2の存在は、落射蛍光（図2A）で確認することができます - ピペットプラー（サッターP - 97）上にガラス電極を引き抜きます。 ACSFでこの電極を埋める。 ACSF槽内に配置するときにチップ抵抗は7-10 Mohmを間でなければなりません。
- 蛍光灯照明下では、スライスで成熟した形態を持つ健康なChR2 - EYFPニューロンを探します。また、パッチの光学系では、このニューロンの細胞体を探します。
- 電極の先端を通過した光の正圧と、特定された蛍光ニューロンに向かってパッチ電極を下げる。膜の接触が行われると、すぐに正圧を解放し、チップを通して吸引の小さいと簡単に金額を適用します。ギガオームシールは、原形質膜とパッチ電極の壁の間になされるべきである。
- 場合であっても電極が活動をスパイク蛍光ニューロンに十分に近い場合ギガシールは、測定可能な局所電場電位を生成するか、形成されていません。光の異なる投与量を点滅させることで、このニューロンのChR2をアクティブにします。光用量は、電源LEDと持続時間の両方の関数であるため、多くの光が複数の力と持続時間（図2B）で活動電位を喚起する必要があるか計算する。スパイクは、水銀灯の照明下で発生したどの程度も観察。
3。代表的な結果：
私たちの顕微鏡（オリンパスBX51WI）で、私たちのLEDは私です2開口と集光レンズとn個のライン、このように工場出荷時にインストールアークランプのオリジナルの光パスを維持する。視野絞りとアパーチャ横隔膜の両方を閉じることで、我々は、パッチクランプ記録（ 図1B）のための十分な明コントラストを実現することができます。すべてのダイヤフラムで完全に我々はchannelrhodopsin活性化（ 図1A）の最大光パワーにスライスを公開開きます。私たちの顕微鏡では、このパッチの設定は（4.1μW/ mm 2の対6.88 MW / mm 2）の最大のフルフィールドの密度より大きさの約3桁小さい光密度を生成します。
独身の成人生まれChR2 - EYFPは顆粒細胞を表現することを示して私たちは、吻側渡り鳥ストリーム（ 図2A）から疎パッチ録音で神経芽細胞の移行のレンチウイルス感染後の成人生まれの嗅球の顆粒と糸球体ニューロンの数週間の堅牢な標識を参照してください。格言で5ミリ秒の刺激UM電力（6.88 mWの/ MM 2）スパイク（ 図2B）を呼び起こすのに十分です。発現レベルが細胞の間で変化するので、スパイクにしきい値を通過する光の量は変わるし、関心の各セルのタイプのために統計的に記述する必要があります。
フルフィールド光刺激とパッチクランプ法スライスの電気生理学1。LEDアレイのセットアップ図 。 channelrhodopsinを有効にするには（ChR2）我々は、オープンバックの開口部とコンデンサー光学系（）を介して平行ビームを投影する。この設定は、完全に視野絞りと視野絞りの変調幅（b）を閉じることにより、高コントラストのパッチの光学系に変更することができます。略語：A.ファン、B.ヒートシンク、C. LEDの配列、D.コリメータレンズ、E.ミラー、F.の視野絞り、G.開口絞り、H.コンデンサーレンズ、I. SAmpleステージ、J.目標。
図2パッチクランプと全体のフィールド光刺激のための嗅球の300μmの水平スライス（）のイメージ。 ChR2 - EYFPの発現Lentivirally感染した成人生まれの顆粒細胞は、嗅球の中心から放射状に見ることができます。スパイクを呼び起こすために必要な光用量は、LEDフラッシュ（B）の持続時間を増加させることによって見つけることができます。この顆粒細胞のしきい値は、完全なLEDの輝度（2.43mW/mm 2）で5msのだ。 （B）= 50msので=500μm、スケール（）でスケール。
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Discussion
近年は神経科学研究6 optogeneticツールの人気が爆発的に見てきました。その結果、これらの新しいツールを使用し始めることを希望するラボのエントリの障壁を低くすることがますます重要です。ここではそれがchannelrhodopsin発現ニューロンのフルフィールド光刺激を行うことができるように、従来のパッチクランプリグのシンプルで低コストの改修とキャリブレーションを実施する方法について説明します。特に、我々は特に光と新たに生まれた神経細胞を制御するために、嗅球の成体の神経新生の研究にこの手法を適用する。
我々は、LED光源は、ChR2活性化のための十分な電力を生成するかどうかを判断する方法を示しています、そしてLEDの速度のオン/オフ本質的に急速に容易に神経細胞に与えられる光の量を調節することができる方法を示しています。私たちの研究室では正常にこのテクニックを使用している一方で、光の各wの制御された投与量にニューロンを公開するための代替方法があります。i番目の独自の利点と欠点。
より多くの光パワーが必要な場合は、多くの水銀ランプは、LEDアレイよりもかなり多くの光が生成されます、そして顕微鏡の目的とフィルターセットは、すでにサンプルの上に、所望の波長を集中することが提示されています。しかし、このソリューションでパワーも曝露期間のいずれも容易に制御することができる。露出の長さは、外部シャッタによって制御される必要があり、これらは多くの場合、LEDアレイよりも高価です、そして電力は光路にNDフィルターを追加することによって減衰させる必要があるでしょう - 減少させる振動を引き起こす危険性がパッチクランプ実験の成功率。
我々の実装はまた、困難な照明の空間的範囲を制御できるようになります。スポット照明がChR2表現する神経細胞の特定のグループをターゲットにする必要な場合は、1つの解決策は、別にgalvometer走査ミラーを用いてレーザスポットを走査することです。スライス上の位置。この時点で、しかし、顕微鏡は、複雑さとコストの両方で、従来の共焦点顕微鏡に似せて始めます。最近開発された代替手段は、試料7上に、マイクロLEDアレイのイメージを集中すること、またはデジタルマイクロミラーデバイス8と励起の一様な電界を形成することです。
LEDアレイは、それらを一意にchannelrhodopsinの刺激に最適な、明確な利点を持っている。彼らのオン/オフ速度はナノ秒の時間スケールで発生し、したがって、この速度は細かく生体組織への光照射の期間を調整するために使用することができます。さらに、LEDの色は、フィルタリングを必要とせずに、特定の励起バンドに合わせて選択することができます。赤方偏移channelrhodopsin変異体の出現により、それが個々に神経細胞の二つの異なる集団を励起するために異なる色の二つのLEDを使用するのは簡単だろう。また、白色LEDアレイ - 青組み合わせたこのレポートで使用されているような（測定波長：450nmのpEAK）と緑色（550nmのピーク）、窒化ガリウムダイオードは - 調査員の励起帯域の広い範囲を対象とする自由を与える広域スペクトルです。
光学的キャリブレーション後、channelrhodopsinを表現する各セルのタイプは、多くの光が活動電位を呼び起こすために必要とされる方法を決定するために特徴付けされている必要があります。我々は、ピペット溶液で変化する細胞の内部ダイナミクスを回避するという利点があるルーズパッチ法を、使用して簡単な電気生理学的特性を説明します。しかし、完全な研究で、細胞全体の記録は、光が脱分極の一定量を生産量を決定するために必要であり、時間の経過とともに、これらの誘発電位の安定性。残念なことに光用量に活動をスパイクの感度は実験コントロールの外側のパラメータの数に依存します。これらは、ChR2発現のレベルを（構造体コピー数の機能とウイルスPROMの発達調節含まれていますoter）、およびニューロン9の本質的な生物物理学的特性。
ChR2 - EYFPの融合の蛍光強度は、光の量がしきい値にニューロンをもたらすために必要とされる方法を示すインジケータがあります。しかし、チャネルの内部化凝集によって、そしてスパイクの開始ゾーンに遠位のチャネルを活性化することによって引き起こされるコンダクタンスをシャントすることによって引き起こされる見積もりは、この種の非線形性があります。最終的に、ニューロンのあらゆるタイプの人口の統計的な特性評価がなされる必要があります。これは薄暗い蛍光細胞がパッチに困難であり、そのウイルスの構造は、体細胞10に制限されている追加の蛍光標識の恩恵を受ける可能性があることを警告のために苦しんでいる。
それは、光がそのスパイク活動を制御するために使用することができればChR2感染したニューロンにパッチを適用するために明らかに冗長です。 - in vitroで optogeneticsの有効活用はoptogeneticallyのシナプス接続を調査することである回路の他のメンバーと人口を対象とした。私たちの手で、我々はこれら2種類の細胞型4の間に新たに形成されたシナプスの特性を測定するための僧帽細胞からパッチクランプ記録を持つChR2成人生まれの顆粒細胞の完全な電界の刺激を結合している。単一顆粒と僧帽細胞間の接続性の確率は非常に低いため、私たちの実験は多くの何百ChR2を発現する顆粒細胞の同時活性化によってのみ可能でした。新しい遺伝子マーカーや特定の神経集団を標識するために新たなウイルス送達方法の今後の発見は、異なるシステムでのin vitro optogeneticsの有用性が増加します。特に、この手法は理想的には予想外の神経細胞サブセット11,12の間に疎が強いつながりを発見するのに適しています。このテクニックのための種々の用途が増加すると、 試験管内のスライスの上に納入光を制御するためのシンプルで低コストのハードウェアのために必要となります。
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Disclosures
利害の衝突は宣言されません。
Acknowledgments
この作品は、生命保険会社"AG2Rラ-モンディアル"、エコールデ神経科学パリ（ENP）、"ERA - NET NEURONのフレームでアジャンス国立デラルシェルシュ"ANR - 09 - neuro -の異形004"によってサポートされていました"欧州委員会、およびパスツール財団によるFP7のプログラムの。セバスチャンワグナーはLetten財団によってサポートされていました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ketamine | Imalgène 1000 | 100 mg/ml | |
| Xylazine | Rompun | 2% | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S5886 | &nbps; |
| KCl | Sigma-Aldrich | P5405 | |
| MgSO4 | Sigma-Aldrich | M1880 | |
| NaHCO3 | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| NaHPO4 | Sigma-Aldrich | S5011 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G7021 | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C7902 | |
| Agarose | Sigma-Aldrich | A9539 | |
| Pipette Puller | Sutter Instrument Co. | P-97 | |
| Glass Capillaries | Harvard Apparatus | GC150T-10 | 1.5 mm O.D./1.17 mm I.D. |
| LED array | Bridgelux | BXRA-C2000 | |
| Collimating lens | Thorlabs Inc. | LEDC1 | 40 mm beam diameter |
| Power supply | A1W Electronik | HKO2800 | 2.8 amp |
| Optical power meter | Thorlabs Inc. | PM 100 | |
| Heatsink | Thermaltake | A1838 | Silent Boost K8 |
| Fan | Thermaltake | A1838 | Silent Boost K8 |
| Vibratome | Leica Microsystems | VT1200S |
References
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