Summary
Voksen-fødte nevroner uttrykke ChR2 kan manipuleres i skive elektrofysiologiske forberedelser for å undersøke deres bidrag til funksjon olfactory nevrale kretser.
Abstract
Standard slice elektrofysiologi har tillatt forskere å undersøke enkelte komponentene i nevrale kretser ved å registrere elektriske reaksjoner fra enkeltceller i respons til elektriske eller farmakologisk manipulasjoner 1,2. Med oppfinnelsen av metoder for å optisk kontroll genetisk målrettede nevroner (optogenetics), forskere har nå en enestående grad av kontroll over bestemte grupper av nerveceller i standard skive forberedelse. Spesielt lar lysfølsomme channelrhodopsin-2 (ChR2) forskere for å aktivere nervecellene med lys 3,4. Ved å kombinere nøye kalibrering av LED-baserte photostimulation av ChR2 med standard slice elektrofysiologi, er vi i stand til å sondere med nærmere rollen som voksen født interneurons i luktelappen, den første sentrale stafett av luktesans. Ved hjelp av viral uttrykk for ChR2-YFP spesielt i voksen-født nevroner, kan vi selektivt styre ung voksen-født nevroner i et miljø av eldre end modne nerveceller. Våre optisk kontroll bruker en enkel og rimelig LED system, og vi viser hvordan dette systemet kan kalibreres til å forstå hvor mye lys som er nødvendig for å fremkalle spiking aktivitet i single nevroner. Derfor kan korte glimt av blått lys fjernstyre avfyring mønster av ChR2-transduced nyfødte celler.
Protocol
1. Optisk Kalibrering: Måle LED Strøm
- Fest en LED array til en heatsink aktivt avkjølt med en vifte og påføre denne LED / heatsink aparatus til en collimating linse.
- Skift lampe som brukes i lysfelt belysning med LED / heatsink / vifte / objektiv apparater. Dette apparatet må være nøye plasseres slik at collimated LED bjelke reiser langs en rett optisk bane mot kondensatoren linsen. Kontroller at heatsink / fan er skikkelig jordet til systemets felles plattform.
- Kjør LED array med en strømforsyning som kan gi raske og firkantet pulser av strøm. Denne strømforsyningen kan være styrt av en 5V TTL puls stammer fra en puls generator.
- Sentrer collimated strålen langs lysbanen definert mellom feltet mellomgulvet og kondensatormikrofon linsen. Ideelt sett vil LED strålen litt overfylle fullt åpnet feltet mellomgulvet. Vanligvis vil en tettere collimated LED beam fylle dette blenderåpning mindre, og vil produsere more makt på bekostning av ensartethet. I setup vår økte vi lys ensartethet ved å velge en collimating linse som projiseres en litt utvidet bilde av LED array på sitt konjugat flyet på den consenser mellomgulvet.
- Oppnå Kohler belysning ved å fokusere kondensatoren slik at bildet av feltet mellomgulvet (diafragma nærmest lyskilden) er fokusert på skive kammeret (fig. 1). En tynn vev av linse papir kan fungere som en projeksjon skjermen for å visualisere fokusert bilde av feltet mellomgulvet på andre dybder.
- Bor en serie knappenålshull på kjente diameter i en ugjennomsiktig materiale. Plasser en av disse små porer over sensoren på en optisk effekt-meter. Plasser strømmåleren på prøven scenen og sentrere makten meter over fokusert bilde av feltet mellomgulvet ved å flytte strømmåleren før det gir en maksimal lesing. Fest strømmåleren i denne posisjonen.
- Helt åpen alle åpninger (aperature membran ogfeltet diafragma). Systematisk flytte den vedlagte slice kammer / power meter i forhold til den optiske LightPath og beregne ensartethet av optiske makt innenfor det opplyste området. Bygg ensartethet tomten for systemet. Hvis mikroskopet er riktig oppsett med Kohler belysning sentrert ved målet fokus, bør maksimal kraft være rett under målet, og regioner utenfor dette fokus bør nå få en kjent mengde kraft i henhold til ensartethet plottet.
- For hver størrelse på pinhole, bygge en standardkurve av optisk styrke vs pinhole areal. Ved å justere input strømmen til LED-matrise, produserer denne kurven strømnivåer og fra hver kurve beregne kraften per mm2. Hvis LED array skal brukes for patching optikk, sørg for å introdusere optiske elementer som er nødvendige for patching (kondensatorer, pinholes og filtre) å vite hvor mye lys som overføres i henhold til patching belysning.
- Flipping kraften meter tilansikt målet, beregne intensiteten av belysning ved 470nm når kvikksølv lampen er slått på.
- Legg til en live-skive til kammeret, og gjenoppbygge standard kurver til å bestemme lyset kraften overført gjennom spredning hjernevev.
2. Slicing Prosedyre og Elektrofysiologi
Del A: Slice Forberedelse
- Anesthetize (60 mg / kg ketamin og 2mg/kg xylazin) og halshogge musen. Dissekere hjernen i kunstige cerebral spinal fluid (ACSF, i mm: 124 NaCl, 3 KCl, 1,3 4 MgSO, 26 3 NaHCO, 1.25 4 NaHPO, 20 glukose, 2 CaCl 2; ~ 310mOsm, 7,4 pH når det boblet med en blanding av 95% O2 og 5% CO 2 5,1), ta vare så du ikke skader olfactory pærer. Skille de to halvkuler og plass på agar med baksiden selv med en kant (for horisontale seksjoner).
- Lim agar og dorsal overflaten av hvert kortikale halvkule til vibratome chuck, og sakte fylle badekaret med iskaldt ACSF. Slice fra baksiden i 300 mikrometer seksjoner, overføre hver del til oppvarming (34-36 ° C) og oksygenrikt ACSF, som tillater dem å komme seg i 30-45 minutter.
Del B: Loose Patch Måling av terskel til Spike
- Etter bringe skivene til romtemperatur i 30 minutter, forsiktig plassere en skive i innspillingen kammer av mikroskopet kammeret under konstant perfusjon av oksygenert ACSF.
Ved fare for svært stimulerende ChR2 smittet nevroner, kan tilstedeværelsen av EYFP-ChR2 bli bekreftet i henhold epifluorescence (fig. 2a) - Trekk glass elektroder på en pipette puller (Sutter P-97). Fyll denne elektroden med ACSF. Når plassert i ACSF badekaret spissen motstanden skal være mellom 7-10 MOhms.
- Under fluorescerende belysning, finn i stykket en sunn ChR2-EYFP neuron med modne morfologi. Også finne denne nervecellen er soma henhold patching optikk.
- Med lys positivt trykk passerte gjennom elektroden spissen, lavere lappen elektrode mot identifiserte fluorescerende neuron. Når membranen kontakt er gjort, slipp raskt positivt trykk og påfør en liten og kort mengden av sug gjennom spissen. En giga-ohm forsegling bør gjøres mellom plasmamembranen og veggene av plasteret elektroden.
- Selv om en giga-forsegling ikke er dannet, dersom elektroden er nær nok til et fluorescerende nevron spiking aktivitet skal produsere en målbar lokale feltet potensial. Aktiver ChR2 i denne neuron ved å blinke forskjellige doser av lys. Fordi lys-dose er en funksjon av både LED kraft og varighet, beregne hvor mye lys er nødvendig for å fremkalle en handling potensial på flere krefter og varigheter (fig. 2b). Også observere hvor mye spiking forekommer under kvikksølvlampe belysning.
3. Representant Resultater:
På mikroskop vår (Olympus BX51WI), er vår LED in linje med 2 åpninger og en kondensator linse, og dermed opprettholde den opprinnelige LightPath av fabrikkinstallerte arc lampe. Ved å lukke både feltet mellomgulvet og aperature mellomgulvet, kan vi oppnå lysfelt kontrast tilstrekkelig for patch clamp opptak (fig. 1b). Med alle membraner fullt åpner vi utsette stykket til maksimal lys kraft for channelrhodopsin aktivering (fig. 1a). På mikroskop vår, produserer denne patching konfigurasjon light-tetthet som er omtrent tre størrelsesordener lavere enn den maksimale hele feltet tetthet (4.1 μW / mm 2 versus 6,88 mW / mm 2).
Vi ser robust merking av voksen-fødte luktelappen granule og periglomerular nevroner uker etter lentiviral infeksjon av trekkende neuroblasts i rostral vandrende stream (fig. 2a) En løs-patch opptak fra en singel voksen-født ChR2-EYFP uttrykke granulat celle indikerer at en 5 ms stimulering ved leveregelum strøm (6,88 mW / mm 2) er tilstrekkelig til å fremkalle spiking (fig. 2b). Siden uttrykket varierer mellom celler, vil mengden av lys som passerer terskelen til spike variere og skal beskrives statistisk for hver celle type interesse.
Figur 1. LED array oppsett for full-feltet photostimulation og patch-clamp slice elektrofysiologi. For å aktivere channelrhodopsin (ChR2) vi prosjektet en kollimert strålen gjennom åpne tilbake blenderåpninger og kondensator optikk (a). Denne konfigurasjonen kan endres til høy kontrast patching optikk ved lukking feltet membranen og modulerende bredden på feltet membranen (b). Forkortelser: a. fan, b. heatsink, c. LED array, d. collimating linse, e. speil, f. feltet mellomgulvet, g. blenderåpning, h. kondensator linse, I. SAmple scenen, j. objektiv.
Figur 2. Bilde av en 300μm horisontal skive luktelappen for patch clamp og hel-feltet photostimulation (a). Lentivirally smittet voksen-fødte granule celler uttrykker ChR2-EYFP kan sees som stråler ut fra kjernen i luktelappen. Lyset-dose som kreves for å fremkalle spiking kan finnes ved å øke varigheten av LED-blits (b). Terskelen for dette granule cellen ble 5ms på full LED intensitet (2.43mW/mm 2). Scale i (a) = 500μm, skala i (b) = 50ms.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Siste årene har sett en eksplosjon i populariteten av optogenetic verktøy for Neuroscience forskning seks. Som et resultat, er det stadig viktigere å senke barrieren for oppføring av laboratorier som ønsker å begynne å bruke disse nye verktøyene. Her vil vi beskrive hvordan å gjennomføre en enkel og lavpris ettermontering og kalibrering av en konvensjonell patch-clamp rigg, slik at den kan gjøre full-felt optisk stimulering av channelrhodopsin-uttrykke nevroner. Spesielt bruker vi denne teknikken til å studere luktelappen voksen neurogenesis å spesifikt kontroll nyfødte nerveceller med lys.
Vi viser hvordan du skal avgjøre om en LED lyskilde produserer nok strøm til ChR2 aktivering, og vise hvordan de egentlig raske on / off hastighet av lysdioder kan enkelt regulere dosen av lys gitt til nerveceller. Mens vår lab har med hell brukt denne teknikken finnes det alternative måter å utsette nerveceller til kontrollerte doser av lys hver wed sine egne fordeler og ulemper.
Hvis mer optisk styrke er nødvendig, vil mange kvikksølvlamper produsere betydelig mer lys enn en LED-matrise, og et mikroskop mål og filter sett er allerede til stede for å fokusere på ønsket bølgelengdene på prøven. Men med denne løsningen verken makt eller varigheten av eksponering kan enkelt kontrolleres. Lengde av eksponering ville trenge å bli kontrollert av en ekstern utløser, og disse er ofte dyrere enn en LED array, og makten måtte dempes ved å legge nøytral tetthet filter til lyset banen - i fare for å forårsake vibrasjoner som ville redusere suksessen rate av patch-clamp eksperimenter.
Vår implementering gjør det også vanskelig å kontrollere den romlige utstrekningen av belysning. Hvis flekk belysning er ønsket å målrette bestemte grupper av ChR2 uttrykke nerveceller, er en løsning for å skanne en laser spot med et galvometer skanning speil til forskjelligesteder på skive. På dette punktet, men begynner mikroskop for å ligne en konvensjonell confocal mikroskop i både kompleksitet og kostnader. En nylig utviklet alternativ er å fokusere bildet av en mikro-ledet array på prøven 7, eller for å forme en enhetlig felt av eksitasjon med en digital Micromirror enhet 8.
LED arrays har klare fordeler som gjør dem spesielt tilpasset channelrhodopsin stimulering. Deres on / off speed skjer på nanosekund tidsrammer og så denne hastigheten kan brukes til fint justere varigheten av lys eksponering for biologiske vev. I tillegg kan fargen på lysdioder bli valgt for å passe spesifikke excitation band uten behov for filtrering. Med framveksten av røde forskjøvet channelrhodopsin mutanter, ville det være enkelt å bruke to lysdioder i forskjellige farger til individuelt opphisse to forskjellige populasjoner av nerveceller. Alternativt, hvite LED arrays - som den som brukes i denne rapporten som kombinerer blå (450nm pEAK) og grønn (550nm peak) gallium nitride dioder - er bredspektret som gir etterforsker frihet til å målrette et bredt spekter av eksitasjon band.
Etter optisk kalibrering, må hver celletype som uttrykker channelrhodopsin karakteriseres å avgjøre hvor mye lys som er nødvendig for å fremkalle en handling potensial. Vi beskriver en enkel elektrofysiologisk karakterisering bruke løs-patch metoden, som har fordelen av å unngå å endre cellens indre dynamikk med pipetten løsningen. Men i en full undersøkelse hel-celle opptak er nødvendig for å avgjøre hvor mye lys som produserer en gitt mengde depolarisering, og stabiliteten av disse fremkalt potensialene over tid. Dessverre følsomheten spiking aktivitet i lyset dose er avhengig av en rekke parametere utenfor eksperimentell kontroll. Disse inkluderer nivået av ChR2 uttrykk (en funksjon av konstruere kopi nummer og utviklingsmessige regulering av viral skoleballoter), og den iboende biofysiske egenskapene av nervecellen 9.
Den fluoriserende intensiteten av ChR2-EYFP fusjon kan være en indikator på hvor mye lys som er nødvendig for å bringe nervecelle til terskelen. Det er imidlertid nonlinearities i denne type estimatet forårsaket av internalisert aggregater av kanalen, og ved skifting conductances forårsaket ved å aktivere kanaler distalt for spike innvielse sone. Til syvende og sist, for hver type nervecelle en statistisk karakterisering av befolkningen vil måtte gjøres. Dette lider for det forbeholdet at svakt fluoriserende cellene er vanskelige å patch, og så viral konstruerer kan ha nytte av en ekstra fluorescerende etiketten som er somatisk begrenset ti.
Det er åpenbart overflødig å lappe en ChR2 smittet nevron hvis lys kan brukes til å kontrollere sin spiking aktivitet. En bedre bruk av optogenetics in-vitro er å undersøke synaptiske tilkobling av en optogeneticallymålrettet befolkningen med andre medlemmer av kretsen. I våre hender, har vi kombinert fulle felt stimulering av ChR2 voksen-fødte granule celler med patch clamp opptak fra mitral celler for å måle egenskapene til den nydannede synapse mellom disse to celletypene fire. Fordi sannsynligheten for tilkobling mellom en enkelt granule og mitral celle er svært lav, var vår eksperimentere bare mulig ved samtidig aktivering av mange hundre ChR2 uttrykker granule celler. Future oppdagelsen av nye genetiske markører og nye viral levering metoder for å merke spesifikke nevronale populasjoner vil øke nytten av in-vitro optogenetics i ulike systemer. Spesielt er denne teknikken velegnet til å oppdage sparsom, men sterke forbindelser mellom uventede neuronal undergrupper 11,12. Som rekke bruksområder for denne teknikken vokser, så vil behovet for enkle og rimelige maskinvare for å kontrollere lyset levert på in-vitro skiver.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen interessekonflikter erklært.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av livsforsikringsselskap "Ag2r-La-Mondiale," Ecole des Neurosciences de Paris (ENP), den Agence Nationale de la Recherche "ANR-09-NEUR-004" i rammen av "ERA-NET Neuron "av FP7 program av Europakommisjonen, og Pasteur Foundation. Sebastien Wagner ble støttet av Letten Foundation.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ketamine | Imalgène 1000 | 100 mg/ml | |
| Xylazine | Rompun | 2% | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S5886 | &nbps; |
| KCl | Sigma-Aldrich | P5405 | |
| MgSO4 | Sigma-Aldrich | M1880 | |
| NaHCO3 | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| NaHPO4 | Sigma-Aldrich | S5011 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G7021 | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C7902 | |
| Agarose | Sigma-Aldrich | A9539 | |
| Pipette Puller | Sutter Instrument Co. | P-97 | |
| Glass Capillaries | Harvard Apparatus | GC150T-10 | 1.5 mm O.D./1.17 mm I.D. |
| LED array | Bridgelux | BXRA-C2000 | |
| Collimating lens | Thorlabs Inc. | LEDC1 | 40 mm beam diameter |
| Power supply | A1W Electronik | HKO2800 | 2.8 amp |
| Optical power meter | Thorlabs Inc. | PM 100 | |
| Heatsink | Thermaltake | A1838 | Silent Boost K8 |
| Fan | Thermaltake | A1838 | Silent Boost K8 |
| Vibratome | Leica Microsystems | VT1200S |
References
- Nissant, A. Adult neurogenesis promotes synaptic plasticity in the olfactory bulb. Nature Neuroscience. 12, 728-730 (2009).
- Apicella, A. Pyramidal Cells in Piriform Cortex Receive Convergent Input from Distinct Olfactory Bulb Glomeruli. Journal of Neuroscience. 30, 14255-14260 (2010).
- Boyden, E. S. genetically targeted optical control of neural activity. Nature. 8, 1263-1263 (2005).
- Bardy, C. where new inhibitory neurons release neurotransmitters in the adult olfactory bulb. The Journal of Neuroscience. 30, 17023-17034 (2010).
- Grubb, M. S. Functional maturation of the first synapse in olfaction: development and adult neurogenesis. The Journal of neuroscience. 28, 2919-2932 (2008).
- Zhang, F. Circuit-breakers: optical technologies for probing neural signals and systems. Nature reviews. Neuroscience. 8, 577-581 (2007).
- Grossman, N. Multi-site optical excitation using ChR2 and micro-LED array. Journal of neural engineering. 7, 16004-16004 (2010).
- Dhawale, A. K. Non-redundant odor coding by sister mitral cells revealed by light addressable glomeruli in the mouse. Nature neuroscience. 13, 1404-1412 (2010).
- Weick, J. P. Functional control of transplantable human ESC-derived neurons via optogenetic targeting. Stem cells. 28, 2008-2016 (2010).
- Toni, N. Neurons born in the adult dentate gyrus form functional synapses with target cells. Nature Neuroscience. 11, 901-907 (2008).
- Grubb, M. S., Burrone, J. Channelrhodopsin-2 Localised to the Axon Initial Segment. PLoS ONE. 5, e13761-e13761 Forthcoming.
- Tye, K. M. Amygdala circuitry mediating reversible and bidirectional control of anxiety. Nature. 471, 358-362 (2011).
