Summary
Взрослый родившихся нейронов выражения ChR2 можно манипулировать в ломтик электрофизиологических подготовку для того, чтобы изучить их вклад в функцию обонятельных нейронных цепей.
Abstract
Стандартный электрофизиологии срез позволил исследователям зонда отдельных компонентов нервной системы путем записи электрических ответов одиночных клеток в ответ на электрические или фармакологических 1,2 манипуляций. С изобретением методов оптического контроля генетически целевых нейронов (optogenetics), исследователи теперь имеют беспрецедентный уровень контроля над конкретными группами нейронов в стандартной подготовки срез. В частности, светочувствительной channelrhodopsin-2 (ChR2) позволяет исследователям для активации нейронов с 3,4 свет. Объединив осторожны калибровки светодиодных фотостимуляцией ChR2 со стандартными электрофизиологии ломтик, мы в состоянии зонд с более подробно роль взрослого родился интернейронов в обонятельной луковице, первый центральный реле обонятельной системы. Использование вирусного выражение ChR2-YFP специально у взрослых родившихся нейронов, мы можем выборочно контролировать молодых взрослых родился нейронов в среде старыхг зрелых нейронов. Наши оптические управления использует простые и недорогие светодиодные системы, и мы покажем, как эта система может быть откалиброван, чтобы понять, сколько света необходимо, чтобы вызвать пики активности в отдельных нейронов. Таким образом, короткие вспышки голубого света могут удаленно контролировать стрельбу структуры ChR2-трансдуцированных новорожденных клеток.
Protocol
1. Оптический калибровки: измерение LED Power
- Прикрепить светодиодов на радиатор с активным охлаждением с помощью вентилятора и закрепить этот светодиод / радиатор aparatus к коллимирующей линзы.
- Замените лампы, используемые в светлое освещение с LED / радиатор / вентилятор / объектив аппарата. Этот аппарат должен быть тщательно расположены так, чтобы коллимированный светодиодный луч движется по прямой оптический путь к конденсатора линзы. Убедитесь, что радиатор / вентилятор заземлена на массу системы.
- Диск светодиодов с источником питания, который может дать быстрый и прямоугольных импульсов тока. Этот блок питания может управляться 5V TTL импульса, происходящих из генератора импульсов.
- Центр коллимированного пучка вдоль пути света определяются между диафрагмой поля и конденсатор линзы. В идеале, светодиодный луч немного переполнения полностью открыт полевой диафрагмой. Как правило, более плотно коллимированного светодиодных луча заполнить это отверстие меньше, и будет производить морэлектронной власти за счет однородности. В нашей установке мы увеличили свет единообразия, выбрав коллимирующей линзы, что прогнозируемые слегка расширены образ светодиодов на ее сопряженная плоскость в consenser диафрагмы.
- Достижение Колер освещения, сосредоточив внимание конденсатора так, чтобы образ полевой диафрагмы (диафрагма ближе всего к источнику света) ориентирована на срез камеры (рис. 1). Тонкая ткань линзы бумаги могут выступать в качестве проекционного экрана для визуализации сфокусированного изображения полевой диафрагмы на других глубинах.
- Дрель серии отверстий известного диаметра в непрозрачный материал. Разместите один из этих маленьких отверстий по датчик оптической мощности-метра. Место измеритель мощности на сцене и в центре образца измерителя мощности более сфокусированного изображения полевой диафрагмы, просто перемещая измеритель мощности, пока она дает максимальное показание. Прикрепите измеритель мощности в этом положении.
- Полностью открыть все отверстия (диафрагмы и aperatureполевой диафрагмы). Систематически двигаться прилагается часть камеры / измеритель мощности по отношению к оптической оптический путь и рассчитать равномерность оптической мощности в освещенную зону. Сборка единообразия сюжет для вашей системы. Если микроскоп правильность установки с подсветкой Келера с центром в фокусе цель; максимальная мощность должна быть непосредственно под цели и регионов за пределами этого внимание должно теперь получают известное количество энергии в соответствии с однородностью сюжет.
- Для каждого размера отверстия, построить стандартную кривую оптической мощности от области обскуры поверхности. Регулируя входного тока для светодиодов, производство этой кривой при различных уровнях мощности, а с каждой кривой расчета мощности на мм2. Если светодиод массив, который будет использоваться для ямочного ремонта оптики, убедитесь, что введение оптических элементов, необходимых для ямочного ремонта (конденсаторы, проколов и фильтры), чтобы знать, сколько света передается под исправления освещения.
- Подавать измеритель мощности дляЛицо цель, рассчитать интенсивность освещения на 470nm, когда ртутная лампа включена.
- Добавить живой срез на камеру, и восстановить стандартные кривые для определения силы света, прошедшего через ткани мозга рассеяния.
2. Процедура нарезки и электрофизиологии
Часть: Slice подготовка
- Обезболить (60 мг / кг кетамина и 2mg/kg Ксилазин) и обезглавить мыши. Рассеките мозга в искусственной спинномозговой жидкости (ACSF, мм: 124 NaCl, KCl 3, 1,3 4 MgSO, 26 3 NaHCO, 1,25 NaHPO 4, 20 глюкозы, 2 CaCl 2; ~ 310mOsm, рН 7,4, когда пропускают со смесью 95% О2 и 5% CO 2, 5,1), заботясь, чтобы не повредить обонятельные луковицы. Отдельные два полушария и место на агар с вентральной поверхности даже с одним ребром (для горизонтальных участков).
- Клей агар и спинной поверхности каждого полушария коры vibrAtome патрон, и медленно заполнить ванну с ледяной ACSF. Фрагмент из вентральной поверхности в 300 мкм разделы, передавая каждый раздел нагревается (34-36 ° С) и кислородом ACSF, что позволяет им восстановиться в течение 30-45 минут.
Часть B: Свободные Измерение патч для Порог для Спайка
- После чего ломтики до комнатной температуры в течение 30 минут, осторожно положите ломтик в записи камеры микроскопа камере при постоянной перфузии кислородом ACSF.
В группе риска чрезмерно стимулирующее ChR2 инфицированных нейронов, наличие EYFP-ChR2 может быть подтверждено при epifluorescence (рис. 2а) - Потяните стеклянных электродов на пипетку съемник (Sutter P-97). Заполните этот электрод с ACSF. При помещении в ванной ACSF наконечник сопротивление должно быть в пределах 7-10 МОм.
- Под флуоресцентным освещением, найдите в срезе здорового ChR2-EYFP нейрона со зрелыми морфологии. Также найти сома этого нейрона под исправления оптики.
- С легкой положительным давлением пропускается через электрод, нижний электрод патч к определены флуоресцентные нейрона. Когда мембрана контакт установлен, быстро отпустите положительным давлением и нанесите небольшое количество и краткие всасывания через кончик. Гига-ом уплотнение должно быть сделано между плазматической мембраной и стены патч электрода.
- Даже если гига-печать не образуется, если электрод достаточно близко к флуоресцентным нейрона пики активности должны давать измеримые местных потенциальном поле. Активировать ChR2 в этот нейрон миганием различные дозы света. Потому что свет дозой является функцией как индикатор мощности и продолжительности, подсчитать, сколько света необходимо, чтобы вызвать потенциал действия на нескольких держав и длительности (рис. 2б). Также обратите внимание, сколько пики происходит при освещении ртутной лампой.
3. Представитель Результаты:
На нашем микроскоп (Olympus BX51WI), наш индикатор ян линию с 2-мя отверстиями и конденсатор объектив, тем самым сохраняя оригинальный оптический путь от заводской установки дуговой лампы. При закрытии и диафрагмы поля и aperature диафрагмы, мы сможем добиться светлого контраста достаточным для исправления записей зажим (рис. 1б). Со всеми полностью открытой диафрагмы мы выставляем ломтик максимальной мощности света для channelrhodopsin активации (рис. 1а). На нашем микроскоп, это исправление конфигурации производит свет плотности, что составляет примерно три порядка ниже, чем максимально полного поля плотности (4,1 мкВт / мм 2 по сравнению с 6,88 мВт / мм 2).
Мы видим, надежная маркировка взрослых родился обонятельной луковицы и гранулы periglomerular нейронов недели после инфекции лентивирусов мигрирующих нейробластов в ростральной миграционных потоков (рис. 2а) свободную патч записи с одним взрослым родился ChR2-EYFP выразить ЗК указывает, что 5 мс стимуляции максимемкм мощности (6,88 мВт / мм 2) достаточно, чтобы вызвать пики (рис. 2б). Поскольку выражение уровня колеблется в пределах клетки, количество света, проходящего порог шип будет меняться и должно быть описано статистически для каждого типа клеток, представляющих интерес.
Рисунок 1. Светодиодов установка для всего месторождения фотостимуляции и патч-зажим ломтик электрофизиологии. Для активации channelrhodopsin (ChR2) мы проектируем коллимированного пучка через открытые отверстия назад и конденсатор оптики (). Эта конфигурация может быть изменена в высокую контрастность оптики исправления путем полного закрытия области диафрагмы и модуляции ширина полевой диафрагмы (б). Сокращения: а вентилятор, радиатор б, г. светодиодов, д. коллимирующей линзы, д. зеркало, f. полевой диафрагмой, г. диафрагма, д. конденсатора линзы, И. С.mple этапе j. цели.
Рисунок 2. Изображение 300μm горизонтальный срез обонятельной луковице для зажима патч и целые поля фотостимуляции (а). Lentivirally инфицированных взрослых родился гранул клеток, экспрессирующих ChR2-EYFP можно увидеть, исходящих из ядра обонятельной луковице. Световых дозы, необходимой, чтобы вызвать пики могут быть найдены за счет увеличения продолжительности светодиодной вспышкой (б). Порог для этой ЗК была 5 мс при полной светодиодной интенсивности (2.43mW/mm 2). Шкала в () = 500 мкм, масштаб в (б) = 50 мс.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
В последние годы наблюдается взрыв популярности инструментов optogenetic в области нейронаук 6. В результате, становится все более важным снизить барьер входа для лабораторий, желающих, чтобы начать использовать эти новые инструменты. Здесь мы опишем, как проводить простую и низкой стоимостью модернизации и калибровки обычным патч-зажим установки, так что он может сделать полный оптическая стимуляция channelrhodopsin-экспрессирующих нейронов. В частности, мы применяем этот метод для исследования обонятельных нервных клеток взрослого лампы специально для контроля новорожденных нейронов со светом.
Мы показываем, как определить, если светодиодный источник света дает достаточную мощность для ChR2 активации, и продемонстрировать, как внутренне быстрого включения / выключения скорости светодиоды могут легко регулировать дозировку света, переданное нейронов. Хотя наша лаборатория успешно использовал эту технику, Есть альтернативные способы выявления нейронов контролируемых дозах света каждом дого, собственные преимущества и недостатки.
Если более оптических питания не требуется, многие ртутные лампы будет производить значительно больше света, чем светодиодов, а объективные и наборы фильтров микроскопа уже присутствуют сосредоточиться желаемого длин волн на образец. Тем не менее, с помощью этого решения ни силы, ни продолжительность воздействия можно легко регулировать. Длина экспозиции должны находиться под контролем внешнего затвора, и они часто дороже, чем светодиодов, и власти должны быть ослаблены, добавив фильтры нейтральной плотности светового луча - в риске причинения вибрации, что позволит снизить Успешность патч-зажим экспериментов.
Наша реализация также делает его трудно контролировать пространственные масштабы освещения. Если пятно освещенности желательно ориентироваться на конкретные группы нейронов ChR2 выражения, одно из решений состоит в сканировании лазерного пятна с зеркалом galvometer сканирование в различныхместах на срез. На данный момент, однако, микроскоп начинает напоминать обычные конфокальной микроскопии в обоих сложность и стоимость. Недавно был разработан альтернативный является концентрация внимания образ микро-главе массива на образец 7, или формировать однородное поле возбуждения с цифровым устройствам микрозеркальным 8.
Светодиодные массивы имеют явные преимущества, которые делают их уникальными возможностями для стимуляции channelrhodopsin. Их включение / выключение скорости происходит на наносекунды временные рамки и поэтому эта скорость может быть использован для точной настройки длительности воздействия света на биологические ткани. Кроме того, цвет светодиодов может быть выбрана с учетом конкретных полос возбуждения без необходимости фильтрации. С появлением красное смещение мутантов channelrhodopsin, это было бы простым в использовании двух светодиодов разного цвета, чтобы индивидуально возбуждают двух различных популяций нейронов. Кроме того, белый светодиод массивы - как тот, используемые в настоящем докладе, который сочетает в себе синий (450 нм рЕАК) и зеленый (550 нм пик) галлия Нитрид диоды - это широкий спектр, который дает следователю свободу целевой широкий спектр возбуждения полосы.
После калибровки оптических, каждый тип клеток, который выражает channelrhodopsin должны характеризоваться, чтобы определить, сколько света необходимо, чтобы вызвать потенциал действия. Мы описываем простые электрофизиологических характеристик использования свободно-патч метод, который имеет то преимущество, избежать изменения внутренней ячейки динамики с пипеткой решение. Однако в полное исследование целых клеток записи необходимы, чтобы определить, сколько света производит определенное количество деполяризации, и стабильность этих вызванных потенциалов с течением времени. К сожалению, чувствительность пики активности на свет доза зависит от ряда параметров за пределы экспериментального контроля. К ним относятся уровень ChR2 выражения (функции построить числа копий и развития регулирования вирусных выпускного вечераoter), а внутренняя биофизических свойств нейронов 9.
Интенсивность флуоресцентного ChR2-EYFP слияние может быть показателем того, сколько света необходимо, чтобы принести нейрона к порогу. Однако Есть нелинейности в такого рода оценки вызванных внутренним агрегатов канала, и путем шунтирования проводимостей вызвана активацией каналов дистальнее зоны шип посвящения. В конечном счете, для каждого типа нейрона статистических характеристик населения должны быть сделаны. Это страдает за оговоркой, что смутно флуоресцентные клетки трудно патч, и так вирусных конструкций могут получить выгоду от дополнительной флуоресцентной метки, которые соматически ограничено 10.
Очевидно, излишне патч ChR2 инфицированных нейронов, если свет может быть использован для управления своей пики активности. Лучше использовать optogenetics в пробирке является исследование синаптические связи в optogeneticallyцелевых групп населения с другими членами цепи. В наших руках, мы связаны полной стимуляции области ChR2 взрослых родился зернистых клеток с записями патч зажим митральной клетки для измерения свойств новообразованных синапсов между этими двумя типами клеток 4. Потому что вероятность связи между одной грануле и митрального клетка очень мала, наш эксперимент можно было только путем одновременной активации многих сотен ChR2 выражения зернистых клеток. Будущие открытия новых генетических маркеров и новые вирусные методы доставки для обозначения конкретных нейронных популяций увеличит полезность в пробирке optogenetics в различных системах. В частности, этот метод идеально подходит для обнаружить редкие, но сильные связи между неожиданным нейронов подмножества 11,12. Как множество применений для этой техники растет, так что будет необходимо для простого и недорогого оборудования для управления светом доставлен на в пробирке ломтиками.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Нет конфликта интересов объявлены.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана компания по страхованию жизни "AG2R-La-Mondiale», Школе нейронаук Парижской (ЕПС), Национальное агентство по La Recherche "ANR-09-NEUR-004" в рамках "ERA-NET NEURON "7РП программы Европейской комиссии и Пастера Foundation. Себастьян Вагнера была поддержана Letten Foundation.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ketamine | Imalgène 1000 | 100 mg/ml | |
| Xylazine | Rompun | 2% | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S5886 | &nbps; |
| KCl | Sigma-Aldrich | P5405 | |
| MgSO4 | Sigma-Aldrich | M1880 | |
| NaHCO3 | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| NaHPO4 | Sigma-Aldrich | S5011 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G7021 | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C7902 | |
| Agarose | Sigma-Aldrich | A9539 | |
| Pipette Puller | Sutter Instrument Co. | P-97 | |
| Glass Capillaries | Harvard Apparatus | GC150T-10 | 1.5 mm O.D./1.17 mm I.D. |
| LED array | Bridgelux | BXRA-C2000 | |
| Collimating lens | Thorlabs Inc. | LEDC1 | 40 mm beam diameter |
| Power supply | A1W Electronik | HKO2800 | 2.8 amp |
| Optical power meter | Thorlabs Inc. | PM 100 | |
| Heatsink | Thermaltake | A1838 | Silent Boost K8 |
| Fan | Thermaltake | A1838 | Silent Boost K8 |
| Vibratome | Leica Microsystems | VT1200S |
References
- Nissant, A. Adult neurogenesis promotes synaptic plasticity in the olfactory bulb. Nature Neuroscience. 12, 728-730 (2009).
- Apicella, A. Pyramidal Cells in Piriform Cortex Receive Convergent Input from Distinct Olfactory Bulb Glomeruli. Journal of Neuroscience. 30, 14255-14260 (2010).
- Boyden, E. S. genetically targeted optical control of neural activity. Nature. 8, 1263-1263 (2005).
- Bardy, C. where new inhibitory neurons release neurotransmitters in the adult olfactory bulb. The Journal of Neuroscience. 30, 17023-17034 (2010).
- Grubb, M. S. Functional maturation of the first synapse in olfaction: development and adult neurogenesis. The Journal of neuroscience. 28, 2919-2932 (2008).
- Zhang, F. Circuit-breakers: optical technologies for probing neural signals and systems. Nature reviews. Neuroscience. 8, 577-581 (2007).
- Grossman, N. Multi-site optical excitation using ChR2 and micro-LED array. Journal of neural engineering. 7, 16004-16004 (2010).
- Dhawale, A. K. Non-redundant odor coding by sister mitral cells revealed by light addressable glomeruli in the mouse. Nature neuroscience. 13, 1404-1412 (2010).
- Weick, J. P. Functional control of transplantable human ESC-derived neurons via optogenetic targeting. Stem cells. 28, 2008-2016 (2010).
- Toni, N. Neurons born in the adult dentate gyrus form functional synapses with target cells. Nature Neuroscience. 11, 901-907 (2008).
- Grubb, M. S., Burrone, J. Channelrhodopsin-2 Localised to the Axon Initial Segment. PLoS ONE. 5, e13761-e13761 Forthcoming.
- Tye, K. M. Amygdala circuitry mediating reversible and bidirectional control of anxiety. Nature. 471, 358-362 (2011).
