Summary
Vuxen-födda nervceller som uttrycker ChR2 kan manipuleras i slice elektrofysiologiska förberedelser för att undersöka deras bidrag till funktionen av luktsinnet neurala kretsar.
Abstract
Standard skiva elektrofysiologi har gjort det möjligt för forskare att sond enskilda komponenter av neurala kretsar genom att spela in elektriska svaren från enskilda celler som svar på elektriska eller farmakologiska manipulationer 1,2. Med uppfinningen av metoder för att optiskt kontrollera genetiskt riktade neuron (optogenetics), forskare har nu en oöverträffad nivå av kontroll över specifika grupper av nervceller i standarden skiva beredning. Framför allt låter ljuskänsliga channelrhodopsin-2 (ChR2) forskare att aktivera nervceller med ljus 3,4. Genom att kombinera noggrann kalibrering av LED-baserade photostimulation av ChR2 med vanlig skiva elektrofysiologi, kan vi sond med närmare rollen som vuxna födda interneuronen i luktloben, den första centrala relä av luktsinnet. Använda virala uttryck för ChR2-YFP specifikt hos vuxna födda nervceller, kan vi kontrollera selektivt unga vuxna födda nervceller i en miljö av äldre ettd mogna nervceller. Vår optisk kontroll använder en enkel och billig LED-system, och vi visar hur detta system kan kalibreras för att förstå hur mycket ljus som behövs för att framkalla tillsatta aktiviteten i enstaka nervceller. Därför kan korta blixtar av blått ljus fjärrstyra skottlossningen mönster ChR2-transduced nyfödda celler.
Protocol
1. Optisk Kalibrering: Mätning LED Power
- Bifoga en LED-array till en kylfläns aktivt kyls av en fläkt och sätta denna LED / kylfläns aparatus till en kollimerande lins.
- Byt lampa används i brightfield belysning med LED / kylfläns / fläkt / objektiv apparat. Denna apparat måste noggrant placeras så att kollimerad LED-strålen färdas längs en rak optisk väg mot kondensorn linsen. Se till kylfläns / fläkt är ordentligt jordad till systemets gemensamma jord.
- Kör lysdioder med en strömförsörjning som kan ge snabb och fyrkantig pulser av ström. Det här nätaggregatet kan kontrolleras genom en 5V TTL-puls från en pulsgenerator.
- Centrera kollimerad stråle längs ljusstrålen definieras mellan fältet membranet och kondensor lins. Helst ska de LED-strålen Fyll något helt öppen fältet membran. Vanligtvis kommer en tätare kollimerad LED-strålen fylla detta bländare mindre, och kommer att producera More makt på bekostnad av enhetlighet. I vår inställning ökade vi ljus enhetlighet genom att välja en kollimerande lins som projiceras en något större bild av lysdioder på dess konjugat plan på consenser membranet.
- Uppnå Kohler belysning genom att fokusera kondensorn så att bilden av området mellangärdet (diafragman närmast ljuskällan) är fokuserad på segmentets kammaren (fig. 1). En tunn vävnad av linspapper kan fungera som en filmduk för att visualisera den fokuserade bilden av fältet membranet på andra djup.
- Borra ett antal hål av kända diametern i ett ogenomskinligt material. Placera en av dessa små pinholes över sensorn av en optisk effekt-mätare. Placera wattmetern på provet scenen och mitt wattmetern över den fokuserade bilden av fältet membranet genom att helt enkelt flytta wattmetern tills den ger maximalt läsning. Fäst wattmetern i detta läge.
- Helt öppen alla öppningar (aperature membran ochfält membran). Systematiskt flytta bifogade slice kammaren / kraftmätare i förhållande till den optiska strålgång och beräkna enhetlighet av optiska makt inom det belysta området. Bygg enhetlighet tomten för ditt system. Om mikroskopet är korrekt installation med Kohler belysning centreras på målet fokus bör maximal effekt vara direkt under målet, och regioner utanför detta fokus bör nu få en känd mängd effekt enligt enhetlighet tomten.
- För varje storlek hål, bygga en standardkurva av optisk effekt kontra hål yta. Genom att justera in strömmen till LED-array, producera denna kurva på olika effektnivåer och från varje kurva beräkna effekt per mm2. Om lysdioder ska användas för lappning optik, se till att införa optiska element som behövs för lappning (kondensorer, hål och filter) för att veta hur mycket ljus som har översänts i enlighet lapp belysning.
- Vända wattmetern attansikte målet, beräkna intensiteten av belysning vid 470nm när kvicksilverlampa är påslagen.
- Lägg till en live-skiva till kammaren, och återuppbygga standardkurvor att bestämma ljuset kraften överförs via spridning hjärnvävnaden.
2. Skivning Förfarande och elektrofysiologi
Del A: Slice Förberedelser
- Bedöva (60 mg / kg ketamin och 2mg/kg Xylazine) och halshugga musen. Dissekera hjärnan i konstgjorda cerebrospinalvätska (ACSF, i mm: 124 NaCl, 3 KCl, 1,3 MgSO 4, 26 NaHCO 3, 1,25 NaHPO 4, 20 glukos, 2 CaCl 2, ~ 310mOsm, pH 7,4 vid bubblade med en blandning av 95% O2 och 5% CO 2 5,1) och var noga med att inte skada olfactory glödlampor. Separera de två halvkloten och placera på agar med den ventrala ytan även med en kant (för horisontella sektioner).
- Limma agar och dorsala ytan på varje kortikal halvklotet till Vibrationsfrekvensatome Chuck, och långsamt fylla badkaret med iskallt ACSF. Skiva från ventrala ytan 300 ìm sektioner, överföra varje avsnitt för att värma (34-36 ° C) och syresatt ACSF, ger dem möjlighet att återhämta sig i 30-45 minuter.
Del B: Lösa Patch Mätning av tröskeln till Spike
- Efter föra skivor till rumstemperatur i 30 minuter, försiktigt placera en bit i inspelningen kammare mikroskop kammaren under ständig perfusion av syresatt ACSF.
Vid risk för att alltför stimulerande ChR2 smittad nervceller, kan förekomsten av EYFP-ChR2 bekräftas i epifluorescence (fig. 2a) - Dra glas elektroderna på en pipett avdragare (Sutter P-97). Fyll denna elektrod med ACSF. När placeras i ACSF badet spetsen motståndet bör vara mellan 70-10 Mohm.
- Enligt fluorescensbelysning, leta i segmentet en hälsosam ChR2-EYFP neuron med mogna morfologi. Även hitta denna neuron är soma enligt lapp optik.
- Med lätt övertryck passerat elektrodspetsen, lägre plåstret elektroden mot de identifierade fluorescerande neuron. När membranet kontakt görs snabbt på övertryck och applicera en liten och kort mängd sug genom spetsen. En giga-ohm tätning ska göras mellan plasmamembranet och väggarna av plåstret elektroden.
- Även om en Giga-tätningen inte bildas, om elektroden är tillräckligt nära en fluorescerande neuron tillsatta aktivitet bör leda till en mätbar lokala fältet potential. Aktivera ChR2 i detta neuron genom att blinka olika doser av ljus. Eftersom ljus-dos är en funktion av både LED kraft och varaktighet, beräkna hur mycket ljus är nödvändigt för att framkalla en aktionspotential på flera befogenheter och löptider (fig. 2b). Observera också hur mycket tillsatta sker under kvicksilver lampa belysning.
3. Representativa resultat:
På vår mikroskop (Olympus BX51WI), är vårt ledde jagn linje med två öppningar och en kondensor lins, därmed upprätthålla den ursprungliga strålgång av fabriksinstallerade båge lampa. Genom att stänga både fältet membranet och aperature membran, kan vi uppnå brightfield kontrast räcker för inspelningar patch clamp (fig. 1b). Med alla membran helt öppna vi utsätter bit till maximalt ljus effekt för channelrhodopsin aktivering (fig. 1a). På våra mikroskop, producerar denna patchning konfiguration ljus densitet som är ungefär tre tiopotenser lägre än det högsta hela fältet densitet (4,1 μW / mm 2 kontra 6,88 mW / mm 2).
Vi ser robusta märkning av vuxna födda luktbulben granulat och nervceller periglomerular veckor efter Lentiviral infektion migrerar neuroblaster i rostralt flyttande bäcken (fig. 2a) En lös-patch inspelning från en enda vuxen födda ChR2-EYFP uttrycka granulat cell anger att en 5 ms stimulering på Maximum effekt (6,88 mW / mm 2) är tillräcklig för att framkalla tillsatta (fig. 2b). Eftersom uttrycket nivå varierar mellan celler, kommer mängden ljus som passerar tröskeln för att spika variera och bör beskrivas statistiskt för varje cell typ av intresse.
Figur 1. Lysdioder inställning för full-field photostimulation och patch-clamp slice elektrofysiologi. För att aktivera channelrhodopsin (ChR2) vi projektet en kollimerad stråle genom öppna upp öppningar och optik kondensorn (A). Denna konfiguration kan ändras till hög kontrast patchning optik genom att till fullo stänga fältet membranet och modulera bredden på fältet membranet (b). Förkortningar: a. fläkt, b. kylfläns, c. lysdioder, d. kollimerande lins, e. spegel, f. fältet membran, G. bländare, h. kondensor lins, i. SAmple skede, J. mål.
Figur 2. Bild på 300μm horisontell skiva luktbulben för patch clamp och hel-fältet photostimulation (a). Lentivirally infekterade vuxna födda granulat celler som uttrycker ChR2-EYFP kan ses som strålar ut från kärnan i luktbulben. Ljuset-dos som krävs för att framkalla tillsatta kan hittas genom att öka längden på LED-blixt (B). Tröskeln för detta granulat cellen var 5ms med full LED-intensitet (2.43mW/mm 2). Skala i (a) = 500μm, skala i (b) = 50ms.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De senaste åren har sett en explosion i popularitet optogenetic verktyg för neurovetenskaplig forskning 6. Som ett resultat, är det allt viktigare att sänka barriären för inresa för laboratorier som vill börja använda dessa nya verktyg. Här beskriver vi hur man genomför en enkel och billig installation i efterhand och kalibrering av en konventionell patch-clamp riggen så att den kan göra full-området optisk stimulering av channelrhodopsin-uttryckande nervceller. Framför allt använder vi denna teknik för studier av luktbulben vuxen neurogenes särskilt kan kontrollera nyfödda nervceller med ljus.
Vi visar hur du avgör om en LED-ljuskälla ger tillräckligt med kraft för ChR2 aktivering, och visa hur oupplösligt snabba på / av hastighet av lysdioder lätt kan reglera doseringen av ljus som ges till nervceller. Medan våra lab har framgångsrikt använt denna teknik, det finns alternativa sätt att utsätta nervceller kontrollerade doser av ljus varje wed sina egna fördelar och nackdelar.
Om fler optiska kraft behövs, kommer många kvicksilverlampor producerar betydligt mer ljus än en LED-array, och ett mikroskop mål och filter apparater finns redan för att fokusera på det önskade våglängder på provet. Men med denna lösning varken befogenhet eller exponeringstiden kan enkelt kontrolleras. Längd av exponering skulle behöva styras av en extern slutare, och dessa är ofta dyrare än en LED-array, och kraften skulle behöva dämpas genom att lägga till neutrala täthetsfilter mot ljusets väg - med risk för att orsaka vibrationer som skulle minska andelen framgångsrika patch-clamp experiment.
Vår tillämpning gör det också svårt att styra den geografiska omfattningen av belysning. Om spot belysning är önskvärt att inrikta sig på specifika grupper av ChR2 uttrycka nervceller, är en lösning för att skanna en laser plats med en galvometer scanning spegel till olikaplatser på skiva. Vid denna punkt, men börjar mikroskop för att likna en vanlig konfokalmikroskop i både komplexitet och kostnad. En nyligen utvecklad alternativ är att fokusera bilden av en mikro-lysdioder på prov 7, eller att forma ett enhetligt område excitation med en digital micromirror device 8.
LED-arrayer har tydliga fördelar som gör dem unikt lämpade för channelrhodopsin stimulering. Deras av / på fart uppstår på nanosekund tidsskalor och så denna hastighet kan användas för att finjustera hur länge ljuset exponeringen för biologisk vävnad. Dessutom kan färgen på lysdioderna väljas för att passa specifika excitation band utan behov av filtrering. Med tillkomsten av röda skiftade-channelrhodopsin mutanter, skulle det vara enkelt att använda två lysdioder i olika färger för att individuellt excitera två olika populationer av nervceller. Alternativt, vit LED arrayer - som den som används i denna rapport som kombinerar blått (450 nm pEAK) och grönt (550nm topp) galliumnitrid dioder - är brett spektrum som ger utredaren friheten att rikta ett stort utbud av excitation band.
Efter optisk kalibrering, måste varje celltyp som uttrycker channelrhodopsin karakteriseras att avgöra hur mycket ljus som krävs för att framkalla en aktionspotential. Vi beskriver en enkel elektrofysiologiska karaktärisering med hjälp av den lösa-patch-metoden, som har fördelen att man undviker att ändra cellens inre dynamik med pipetten lösningen. Men i en fullständig undersökning helcells-inspelningar är nödvändigt att bestämma hur mycket ljus som producerar en viss mängd depolarisation, och stabiliteten i dessa framkallade potentialer över tiden. Tyvärr känslighet tillsatta aktivitet för ljus dos är beror på ett antal parametrar utanför experimentell kontroll. Dessa inkluderar nivån ChR2 uttryck (en funktion av konstruktion antal kopior och utvecklande regleringen av viralt balenoter), och den inneboende biofysiska egenskaper neuron 9.
Den fluorescerande intensitet ChR2-EYFP fusion kan vara en indikator på hur mycket ljus som behövs för att neuron till tröskeln. Men det finns olinjäriteter i denna typ av uppskattning som orsakas av internaliserade aggregat av kanalen, och genom rangering conductances orsakas av att aktivera kanaler distalt spiken initiering zonen. Ytterst för alla typer av neuron en statistisk beskrivning av befolkningen kommer att behöva göras. Detta lider för det förbehållet att svagt fluorescerande celler är svåra att lappa och så virala konstruktioner kan dra nytta av ytterligare en fluorescerande etikett som somatiskt är begränsad 10.
Det är klart överflödigt att lappa en ChR2 infekterade neuron om ljus kan användas för att styra sin spiking aktivitet. Ett bättre utnyttjande av optogenetics in-vitro är att undersöka det synaptiska anslutning av en optogeneticallymålgrupperna med andra medlemmar i kretsen. I våra händer har vi tillsammans hela området stimulering av ChR2 vuxna födda granulat celler med inspelningar patch clamp från mitralceller att mäta egenskaperna hos det nybildade synapsen mellan dessa två celltyper 4. Eftersom sannolikheten för anslutning mellan en enda granulat och mitralcell är mycket låg, var vårt experiment endast möjligt genom samtidig aktivering av många hundra ChR2 uttrycka granule celler. Framtida upptäckten av nya genetiska markörer och nya virus leveransmetoder att märka specifika neuronpopulationer kommer att öka nyttan av in-vitro optogenetics i olika system. I synnerhet är denna teknik passar utmärkt för att upptäcka glesa men starka kopplingar mellan oväntade neuronala delmängder 11,12. Som många olika användningsområden för denna teknik ökar, så kommer behovet av enkel och billig hårdvara för att styra ljuset levereras på in vitro-skivor.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av livbolaget "AG2R-La-Mondiale", Ecole des Neurovetenskap de Paris (ENP), Agence Nationale de la Recherche "ANR-09-neur-004" inom ramen för "ERA-NET NEURON "i FP7-program från Europeiska kommissionen och Pasteur stiftelsen. Sebastien Wagner stöddes av Letten stiftelsen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ketamine | Imalgène 1000 | 100 mg/ml | |
| Xylazine | Rompun | 2% | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S5886 | &nbps; |
| KCl | Sigma-Aldrich | P5405 | |
| MgSO4 | Sigma-Aldrich | M1880 | |
| NaHCO3 | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| NaHPO4 | Sigma-Aldrich | S5011 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G7021 | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C7902 | |
| Agarose | Sigma-Aldrich | A9539 | |
| Pipette Puller | Sutter Instrument Co. | P-97 | |
| Glass Capillaries | Harvard Apparatus | GC150T-10 | 1.5 mm O.D./1.17 mm I.D. |
| LED array | Bridgelux | BXRA-C2000 | |
| Collimating lens | Thorlabs Inc. | LEDC1 | 40 mm beam diameter |
| Power supply | A1W Electronik | HKO2800 | 2.8 amp |
| Optical power meter | Thorlabs Inc. | PM 100 | |
| Heatsink | Thermaltake | A1838 | Silent Boost K8 |
| Fan | Thermaltake | A1838 | Silent Boost K8 |
| Vibratome | Leica Microsystems | VT1200S |
References
- Nissant, A. Adult neurogenesis promotes synaptic plasticity in the olfactory bulb. Nature Neuroscience. 12, 728-730 (2009).
- Apicella, A. Pyramidal Cells in Piriform Cortex Receive Convergent Input from Distinct Olfactory Bulb Glomeruli. Journal of Neuroscience. 30, 14255-14260 (2010).
- Boyden, E. S. genetically targeted optical control of neural activity. Nature. 8, 1263-1263 (2005).
- Bardy, C. where new inhibitory neurons release neurotransmitters in the adult olfactory bulb. The Journal of Neuroscience. 30, 17023-17034 (2010).
- Grubb, M. S. Functional maturation of the first synapse in olfaction: development and adult neurogenesis. The Journal of neuroscience. 28, 2919-2932 (2008).
- Zhang, F. Circuit-breakers: optical technologies for probing neural signals and systems. Nature reviews. Neuroscience. 8, 577-581 (2007).
- Grossman, N. Multi-site optical excitation using ChR2 and micro-LED array. Journal of neural engineering. 7, 16004-16004 (2010).
- Dhawale, A. K. Non-redundant odor coding by sister mitral cells revealed by light addressable glomeruli in the mouse. Nature neuroscience. 13, 1404-1412 (2010).
- Weick, J. P. Functional control of transplantable human ESC-derived neurons via optogenetic targeting. Stem cells. 28, 2008-2016 (2010).
- Toni, N. Neurons born in the adult dentate gyrus form functional synapses with target cells. Nature Neuroscience. 11, 901-907 (2008).
- Grubb, M. S., Burrone, J. Channelrhodopsin-2 Localised to the Axon Initial Segment. PLoS ONE. 5, e13761-e13761 Forthcoming.
- Tye, K. M. Amygdala circuitry mediating reversible and bidirectional control of anxiety. Nature. 471, 358-362 (2011).
