Summary
成人出生在嗅球的神经元可optogenetically控制使用Channelrhodopsin2表达慢病毒注射在延髓的迁徙流和植入微型慢性photostimulation的LED。
Abstract
当地interneurons不断再生1-3成年啮齿动物的嗅球。在这个过程中，被称为成年神经发生，神经干细胞在侧脑室壁引起神经母细胞迁移沿喙迁徙流（RMS）达到并纳入到嗅球几毫米。为了研究不同的步骤和成人出生的神经元整合到预先存在的嗅觉电路的影响，这是必要的选择性标签和操纵的这种神经元的具体人口的活动。 optogenetic技术最近的发展提供了机遇，利用光，正是这个特定的神经元激活，而不会影响周围神经元 4,5队列。在这里，我们目前在神经母细胞的时间限制在RMS队列一个维拉利表达Channelrhodopsin2系列程序（ChR2）YFP的，在他们到达嗅球之前，成为成人出生NEurons。此外，我们将展示如何植入和校准为慢性LED 在体内刺激的ChR2表达神经元的一个缩影。
Protocol
1。立体定向注射
- 在这些实验中使用的病毒是一个艾滋病毒的复制缺陷型慢病毒载体来表达Channelrhodopsine2 - YFP（黄色荧光蛋白）融合构建一个突触子 6驱动。质粒是慷慨提供K. Deisseroth的研究组（ http://www.stanford.edu/group/dlab/optogenetics/index.html ）。慢病毒可以从商业渠道获得，或在实验室中根据既定协议 7 。平均载体滴度均在10转导单位/ ml的顺序。病毒分装储存于-80 ° C和移液器装载前应解冻。应避免多个冻结/解冻周期。从未曝光的病毒解决方案，直接干冰。
- 准备玻璃移液器使用标准移液器拉马（萨特P硼硅玻璃毛细管-97吸管拉马）。拉动设置应正确校准，以产生长期的和僵化的的吸管。接下来，将使用一把剪刀，获得了直径30-40微米的尖端吸管尖。存放在无尘箱拉移液管。
- 安装与制造商的指示交付50 NL Nanoject二微量。准备回填土与矿物油的注射针，并把它插入到微量柱塞。连接到一个立体框架的微量。从玻璃吸管填充病毒解决方案之前，部分空油
- 随着微，转移到一个封口膜无菌，2μL病毒解决方案。轻轻地降低到病毒解决方案中的玻璃吸管，并填写1-2μL移液器。确保有移液器无气泡。
- 100毫克/公斤氯胺酮和10毫克/公斤甲苯噻嗪，在无菌生理盐水稀释麻醉鼠标。删除从头皮的头发动物用老鼠的快船，剃刀，剪刀，或化学depilitory剂。头皮消毒三交70％的乙醇和优碘的申请。所有手术器械也应进行高压灭菌，然后用70％乙醇消毒。放置在动物耳朵酒吧和鼻子吧的立体框架，确保头部安全。应用眼膏，防止角膜干燥。
- 用手术刀，切开头皮，眼睛之间的两耳之间。一边拉扯皮肤暴露的头骨和一双夹具锚皮肤。清洁表面的头骨。前囟门玻璃吸管提示立体定位仪是零。然后提示是定位在注射部位（安特罗后路，3.30;德尔梅迪奥侧面，± 0.82，左，右半球，分别）。鼻栏的位置进行调整，根据立体坐标的计算。在我们的实验中，鼻栏调整üntil前囟及注射部位对齐到相同的高度。
- 确定注射部位。使用高速的手术钻，小心地钻入颅骨的孔。迷上尖端弯曲的注射器针，瘦骨取出残余，暴露硬脑膜。检查该洞是在正确的位置为中心。在钻井过程中大脑的表面不小心破裂的血管。如果血管破裂，轻轻按到用小棉签或组织几秒钟的大脑表面，直到血液流动停止。
- 下移液器和零背腹的高度时，吸管尖触及大脑表面。然后，降低到正确的背腹深（背腹，脑表面2.9），并等待30秒，压力平衡。注资共200 NL病毒的4倍50 NL。等待30秒之间的每次注射。
- 一分钟最后一次注射后，慢慢退出管TTE。另一半球的重复点1.6-1.8。从立体定位仪中取出的动物，清洁切口和缝合切开皮肤，用手术线程。让动物恢复变暖垫，然后再返回到笼。此外，动物可以后立即给予非甾体类消炎镇痛药（如卡洛芬4mg/kg），手术后3天。
2。慢性LED植入体内 optogenetic刺激嗅球
- 与慢病毒颗粒注射动物双边未来长期植入了微型蓝色LED（OSRAM LED CMS 4.6W蓝色）。焊接的LED引脚，一个女的微型电机连接，使连接器上的LED对面定位。检查有没有电的捷径，并确定连接器上的正面和负面的的引脚。通过它连接到一个电流控制器LED虽然是正确的电缆测试的LED。
- 为了测量和/或设置绝对光功率的LED，装入一个显微和位置上的LED的LED与功率计的一个峰值在470 nm的光强度的光探测器直接接触。钻在一个不透明的PVC板3毫米直径的针孔。贴上这个针孔功率计和建设标准曲线的光功率与输入电流来计算每平方毫米的电源。
- 要通过大脑的测量光的传播，减少新鲜脑组织300块，500，1000，1500和2500在0-4 ° C学联使用一个vibratome 14微米厚度。放置一个开颅手术在活体小鼠下的LED相同的一块头骨。首先，没有对LED为中心的组织测量光功率。然后，将每个组织块之间的LED和功率计的光电探测器，并测量功率。建立一个组织厚度与相对传输分数的曲线，按比例计算通过组织和无组织所测得的功率之间。
- 100毫克/公斤氯胺酮和10毫克/公斤甲苯噻嗪，在无菌生理盐水稀释麻醉鼠标。清洗和消毒用70％乙醇的LED。取出头发从头皮的动物和消毒头皮有三个交70％的乙醇和优碘的申请。在立体框架，然后将动物。应用眼膏，防止角膜干燥。将连接器连接到一个立体的持有人。嗅球以上的头骨表面，直到完全水平和平行于表面的微型LED，鼻栏的位置应调整。
- 用手术刀，切开头皮，从3毫米前到3毫米，后耳朵眼睛。一边拉扯皮肤和一双夹具锚。刮膜，在使用刀片的头骨表面。清洁和干燥的头骨。应用氰基丙烯酸酯胶粘剂的薄盖，以便随后的广告粘附的牙齿丙烯酸。
- 使用一个高速的手术演练，执行一个长方形的开颅手术在嗅球（尾椎1毫米和3毫米的横向5.1毫米尾鳍为本，从囟外侧为0毫米）。要做到这一点，仔细薄的头骨，直到只有一层薄薄的骨遗骸。小心取出剩余的骨弯曲的注射器针头的帮助。应采取特别小心，以避免刺破硬脊膜问题和破裂在于两个半球之间的嗅球的尾部边界的主要血管。在大脑表面的积血和凝血排除最佳的光线穿透进入组织。冲洗开颅手术，并用无菌生理盐水的大脑表面，然后干的头骨。
- 将LED连接器的缩影。下顶部的嗅球上的微型LED。微型LED的主轴线应鼠标喙尾椎轴平行，用无菌生理盐水和D清洁RY的头骨。然后安全的LED头骨，第二层的牙科丙烯酸与丙烯酸的第一层（即，聚羧酸水泥） 。另外两个小螺丝，可能需要修复的LED。螺丝应插在颅骨（后LED的位置）和两项丙烯酸涵盖。虽然丙烯酸仍然是液体，拉回来和胶水牙科丙烯酸表面上的自由边缘的头皮。注意不要将连接器适用于任何丙烯酸。丙烯酸硬化后，删除从立体定位仪上的动物，让恢复变暖垫，然后再返回到笼。动物离开隔离笼从手术中恢复过来，至少7天。此外，动物可以后立即给予非甾体类消炎镇痛药（如卡洛芬4mg/kg），手术后3天。 LED应终止后，植入前和实验测试。
- 光电气CAL电缆是用来系绳的动物加上一个脉冲发生器（主8）控制的时间和强度的LED为LED电流控制器。细缆允许完全的行动自由。照顾方面的连接器的极性。反相极性可能打破LED。
3。代表性的成果：
ChR2 - YFP转约48小时后注射神经元表示，和几个连续7个月保持稳定。图1是一个代表了一个多聚甲醛固定的动物，15天注射后矢状切面画面。注意茂密的标签和注射部位在RMS的大小。大量的新生细胞迁移沿RMS拓殖嗅球的不同层次（图1）。融合蛋白表达在所有的神经细胞车厢，包括胞体，树突棘。
小型的LED impla ntation允许大规模和廉价的一个兴趣广泛的区域的光刺激。动物是拴在光电缆，允许完全的行动自由的LED控制器。通过描绘在脑组织和ChR2激活阈值的光扩散，我们估计，光活化可触发〜2毫米低于LED的表面（图2A）的深度。要监视功能的激活，表达ChR2的神经元在体内表达的c - fos，神经元活动的标志，可以分析重复性的光刺激后（图2B）。作为一种替代方法， 在体外表达ChR2，再加上焦光刺激神经 元的电生理记录可以执行 14 。最后，双光子针对性的宽松的补丁录音已被用于研究ChR2表达皮层神经元功能激活 体内 9 LED类似的缩影。
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图1。 ChR2 - YFP的表达慢病毒注射到延髓的迁徙流 。鼠标在喙RMS的慢病毒注射后15天嗅球一个矢状部分代表共聚焦图像。注意分散YFP的新生神经元迁移的RMS年底OB的不同层次的存在。大多数（95％），新生细胞颗粒细胞，它在颗粒细胞层（GCL）和树突的SOMA在于外部网状层（EPL）的arborize。一个新生神经元的小的人口迁移OB的最表面的一层，小球层，（GL）。比例尺，100微米。插图，高倍率新生儿的颗粒细胞，树突以及在刺膜表达ChR2 - YFP。比例尺，20μm的。
图2。图植入嗅觉灯泡和ChR2 - YFP光诱发c - fos表达，表达新的颗粒细胞的顶部的LED。
一个示意图上述嗅球植入LED。
B，双标ChR2 - YFP的代表共聚焦图像显示+ c - fos的一小时后，光刺激嗅球颗粒细胞。 c - fos表达显露使用兔抗- c - fos基因抗体（Calbiochem，1:5000）和A568标记的抗兔二抗（Invitrogen公司，1:1000）。比例尺为10μm。
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Discussion
Optogenetic工具最近增加了我们对选择性的神经元的人群，包括出生于成人的嗅觉系统神经元的控制。在这里，我们描述了如何执行的慢病毒载体表达ChR2 - YFP的成人出生的神经元的具体人口的立体注射。通过仔细监测期间注射后，我们能够分析和处理出生于一个相对同质化时代的成人神经元群活动。
由于他们的低扩散蔓延，其高转导效率，其相对良好的RMS神经母细胞向性，慢病毒载体应比其他病毒载体如逆转录病毒或腺相关病毒（AAV）的青睐。因为他们选择性地感染分裂的细胞，例如干细胞或祖细胞，逆转录病毒载体，必须注入脑室下区和转导的新生神经元的人口较少。相比慢病毒vectors，AAV载体提供高得多的感染传播。但是，腺相关病毒转导神经母细胞在RMS应避免因为周围结构如附件嗅核，一个地区，项目的轴突到嗅球传导。最后，使用植入的LED可以应用到其他表面结构，如ChR2表达的是在特定人群的神经元通过病毒载体或通过转基因小鼠10号线驱动的脑皮层区域。
随着LED的注入，我们都能够适用于慢性光刺激研究嗅球成年神经发生在清醒的行为动物的职能作用。这个简单的光源提供了一种快速的光感谢本质的LED开/关速度迅速的时间控制。除了价格低廉，微型LED光源产生足够的权力ChR2激活在脑的体积大（〜100mW的）组织11，甚至双侧嗅球。在这一大脑区域显著病变可能没有对气味质量的感知，由于在嗅上皮 12的投入高度的冗余的影响，这一点尤为重要。由于其功率和光谱带宽（25纳米），这些微型发光二极管可用于光诱发的使用ChR2以及其他版本如ChETA或赶上channelrhodopsins激发。微型黄色（597nm）和红色（624或637nm）发光二极管可用于红移视紫质，如halorhodopsin和VChR1 13 。
微型发光二极管也表现出局限性。为了避免加热的大脑，必须找到一种妥协，脉冲频率，脉冲持续时间和光照强度。例如，5毫秒的短的光脉冲，建议在高频率（20HZ），光照强度为100 mW。超过这个期限，一个signific蚂蚁的海拔在周围组织的温度（1-4℃），可以衡量的。光脉冲（毫秒）或连续光刺激，特别是在光诱发halorhodopsin极化的情况下，应考虑此参数。此外，目前提供的LED提供强电神器，这可能排除体内的电生理记录，当LED与组织直接接触。激光耦合光纤构成了一个可行的办法，允许更小，更受限制的光刺激。然而，光纤的刚性可能会干扰某些行为。
特征光的穿透力和功能的神经元的光刺激后， 体内的光刺激可以触发行为实验相结合。应特别注意采取的刺激的时机。同步的photostimulation一个特定的行为或任务，特别是在操作性条件反射行为的仪器，可以建立细胞活化和行为之间的因果关系的决定性因素。
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Disclosures
没有利益冲突的声明。
Acknowledgments
“ERA - NET神经元”的框架，这项工作是由寿险公司“诺瓦利斯Taitbout”，巴黎高等DES神经科学（ENP），法新社国立德拉Recherche“的ANR - 09 - NEUR - 004”的支持由欧洲委员会第七框架计划，“基金会争取RECHERCHE Medicale”，Letten基金会和巴斯德基金会。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ketamine | Merial | Imalgène 1000 | |
| Xylazine | Bayer AG | Rompum 0.2% | |
| Pipette Puller | Sutter Instrument Co. | P-97 | |
| Glass Capillaries (3.5") | Drummond Scientific | 3-000-203-G/X | |
| Nanoject II Microinjector | Drummond Scientific | 3-000-204 | |
| High speed surgical drill | Fine Science Tools | 18000-17 | |
| Micro Drill Steel Burrs 0.7mm tip diameter | Fine Science Tools | 19008-07 | |
| LED CMS blue 4.6 W | OSRAM | LBW5SN | |
| Female electrical connector (2.54 mm) | Fisher Scientific | BL5.36Z | |
| Current controller for LED (max: 1A) | A1W Electronik | HKO-KL50-1000 | |
| Pulse generator | AMPI | Master-8 | |
| Optical power meter | Thorlabs Inc. | PM100 | |
| Cyanoacrylate adhesive | Loctite | 454 | |
| Polycarboxylate cement (first layer cement) | Septodont | Selfast (#0068Q) | |
| Methacrylate cement (second layer cement) | GC International | Unifast Trad – Liquid (#339292) Unifast Trad – Powder (#339114) | |
| Carprofen | Pfizer Pharma GmbH | Rimadyl |
References
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