Summary
Volwassen geboren neuronen van de bulbus olfactorius kan optogenetically worden gecontroleerd met behulp van Channelrhodopsin2 expressie lentivirale injectie in de rostrale migratie stroom en chronische fotostimulering met een geïmplanteerd miniatuur LED.
Abstract
Lokale interneuronen worden continu geregenereerd in de bulbus olfactorius van volwassen knaagdieren 1-3. In dit proces, de zogenaamde volwassen neurogenese, neurale stamcellen in de muren van de laterale ventrikel aanleiding geven tot neuroblasts die migreren van enkele millimeters langs de rostrale trekkende stroom (RMS) te bereiken en op te nemen in de bulbus olfactorius. De studie van de verschillende stappen en de impact van volwassen geboren neuron integratie in de reeds bestaande olfactorische circuits, is het noodzakelijk om selectief label en de activiteit van deze specifieke populatie van neuronen te manipuleren. De recente ontwikkeling van optogenetic technologieën biedt de mogelijkheid om licht te gebruiken om deze specifieke cohort van neuronen precies te activeren zonder dat dit invloed omliggende neuronen 4,5. Hier presenteren wij een reeks van procedures om viraal te uiten Channelrhodopsin2 (ChR2)-YFP in een tijdelijk beperkte cohort van neuroblasts in de RMS voordat ze de bulbus olfactorius en worden volwassen geboren neurons. Daarnaast hebben we laten zien hoe implantaat en kalibreren een miniatuur LED voor chronische in vivo stimulatie van ChR2-expressie neuronen.
Protocol
1. Stereotaxische injecties
- Het virus gebruikt in deze experimenten is een replicatie-deficiënte lentivirale vector op basis van het HIV-virus te Channelrhodopsine2-YFP (geel fluorescerend eiwit) te uiten fusieconstruct aangedreven door een synapsin promotor 6. Het plasmide werd royaal door K. Deisseroth 's onderzoeksgroep ( http://www.stanford.edu/group/dlab/optogenetics/index.html ). Lentivirussen kan worden verkregen uit commerciële bronnen of geproduceerd in het laboratorium op basis van vastgestelde protocollen 7. Gemiddelde vector titers waren in de orde van 10 10 transductie eenheden / ml. Virale porties worden bewaard bij -80 ° C en moet worden ontdooid vlak voor het pipet laden. Meerdere vries / dooi cycli moeten worden vermeden. Nooit de blootstelling van de virus-oplossing direct op droog ijs.
- Bereid glazen pipetten van borosilicaatglas haarvaten op standaard pipet trekker (Sutter P-97 Pipet trekker). Het trekken instelling moet goed worden afgestemd op een lange en starre pipet opbrengst. Daarna, snijd de punt van de pipet met behulp van een schaar om een fooi van 30-40 micrometer in diameter te verkrijgen. Bewaar getrokken pipetten in een stofvrije doos.
- Het instellen van de Nanoject II microinjector de instructies van de fabrikant voor de levering van 50 nL. Bereid de injectie pipet door de back-vullen met minerale olie en steek deze in de microinjector zuiger. Bevestig de microinjector op een stereotaxische frame. Gedeeltelijk lege olie uit de glazen pipet voor het vullen met het virus oplossing
- Met een micropipet, overdracht 2 pi van het virus oplossing op een steriel stuk van Parafilm. Laat het glazen pipet in de daling van het virus oplossing en vul de pipet met 1-2 pl. Zorg ervoor dat er geen luchtbellen in de pipet.
- Verdoof een muis met 100 mg / kg ketamine en 10 mg / kg Xylazine, verdund in een steriele zoutoplossing. Verwijder het haar van de hoofdhuid van dedier met behulp van knaagdier tondeuse, scheermes, schaar, of chemisch depilitory agent. Ontsmet de hoofdhuid met drie toepassingen van afwisselend 70% ethanol en betadine. Alle chirurgische instrumenten moeten ook worden geautoclaveerd en vervolgens gedesinfecteerd met 70% ethanol. Plaats het dier in de stereotaxisch frame met oor bars en neus bar, ervoor te zorgen dat de kop veilig is. Van toepassing oogzalf om uitdroging te voorkomen van het hoornvlies.
- Met een scalpel, snijd de hoofdhuid van tussen de ogen tot tussen de oren. Opzij te trekken van de huid op de schedel bloot te leggen en de huid anker met een paar klemmen. Reinig het oppervlak van de schedel. De stereotaxische apparaat is op nul gezet met de punt van de glazen pipet op bregma. Dan is de tip is gepositioneerd op de injectieplaats (Antero-Posterior, 3,30, medio-laterale, ± 0,82, voor zowel de rechter en linker hemisfeer, respectievelijk). De positie van de neus bar te worden aangepast aan de berekening van de stereotaxische coördinaten. In ons experiment, is de neus bar aangepaste uot bregma en de plaats van injectie zijn uitgelijnd op dezelfde hoogte.
- Identificeer de injectieplaats. Met behulp van een high-speed chirurgische boren, zorgvuldig boren gaten in de schedel. Met een gebogen naald van de spuit haak aan het uiteinde, verwijder de restanten van dunne bot om het dura mater bloot te leggen. Controleer dat het gat is gecentreerd op de juiste positie. Zorg ervoor dat u breuk bloedvaten op het oppervlak van de hersenen tijdens het boren. Als de bloedvaten zijn gescheurd, drukt u voorzichtig op het oppervlak van de hersenen met een klein wattenstaafje of tissue gedurende enkele seconden totdat de bloedstroom stopt.
- Laat de pipet en nul de Dorso-Ventraal hoogte wanneer de punt van de pipet raakt het oppervlak van de hersenen. Dan lager om de juiste Dorso-Ventraal diepte (Dorso-Ventraal, 2,9 van de hersenen oppervlak) en wacht 30 seconden voor druk evenwicht. Injecteren 4 maal 50 nl van het virus voor een totaal van 200 nl. Wacht 30 seconden tussen elke injectie.
- Een minuut na de laatste injectie, langzaam de pijp in te trekkentte. Herhaal de punten 1.6-1.8 voor de andere halfrond. Verwijder het dier uit stereotaxische apparaat, het reinigen van de incisie en steek de snede huid met behulp van chirurgische draden. Laat het dier op aarde pad te herstellen voordat u terugkeert naar kooi. Bovendien kunnen dieren worden gegeven een niet-steroïdale anti-inflammatoire analgetica (bijv. Carprofen 4mg/kg) onmiddellijk na en 3 dagen na de operatie.
2. Chronische LED-implantatie voor in vivo optogenetic stimulatie in de bulbus olfactorius
- Dieren geïnjecteerd met lentivirale deeltjes bilateraal naast chronisch geïmplanteerd met een miniatuur blauwe LED (Osram, LED 4.6W CMS blauw). Soldeer de LED pinnen om een vrouwelijke miniatuur elektrische connector, zodat de connector is geplaatst aan de andere kant van de LED. Controleer of er geen elektrische kort knippen en identificeren van de positieve en negatieve pin op de connector. Test de LED door aan te sluiten op een bestaande controller voor LED maar een juiste kabel.
- Voor het meten en / of stel de absolute lichtsterkte van de LED, monteert u de LED op een micromanipulator en de positie van de LED in direct contact met de fotodetector van een power meter van een piek lichtintensiteit bij 470 nm. Boor een gaatje van 3 mm diameter in een ondoorzichtige PVC bord. Bevestig dit gaatje om de kracht meter en bouwen een standaard curve van optische vermogen ten opzichte van de huidige ingang aan de kracht per mm 2 te berekenen.
- Voor het meten van de voortplanting van licht door de hersenen, op maat gesneden blokken van verse hersenweefsel van 300, 500, 1000, 1500 en 2500 micrometer dikte in 0-4 ° C ACSF met behulp van een vibratome 14. Leg een stukje van de schedel met een craniotomie identiek is aan de een uitgevoerd in levende muizen onder de LED. Eerste, het meten van de licht macht zonder weefsel gericht op LED. Plaats dan elk blok van weefsel tussen de LED en de fotodetector van de macht meter, en meet de macht. Bouw een curve van weefseldikte versus relatieve transmissie fractie, berekend als de verhoudingtussen het gemeten vermogen door middel van weefsel en zonder weefsel.
- Verdoof een muis met 100 mg / kg ketamine en 10 mg / kg Xylazine, verdund in een steriele zoutoplossing. Reinig en desinfecteer de LED met 70% ethanol. Verwijder het haar van de hoofdhuid van het dier en desinfecteren van de hoofdhuid met drie toepassingen van afwisselend 70% ethanol en betadine. Plaats dan het dier in de stereotaxisch frame. Van toepassing oogzalf om uitdroging te voorkomen van het hoornvlies. Bevestig de zender aan een stereotaxische houder. De positie van de neus balk moet worden aangepast totdat het oppervlak van de schedel boven de bulbus olfactorius is perfect horizontaal en evenwijdig aan het oppervlak van de miniatuur LED.
- Met een scalpel, snijd de hoofdhuid van 3 mm anterior voor de ogen tot 3 mm achter de oren. Opzij te trekken van de huid en voor anker liggen, met een paar klemmen. Schraap de membranen aan de oppervlakte van de schedel met behulp van een scheermesje. Reinig en droog de schedel. Breng een dun cover van cyanoacrylaat lijm aan op de volgende advertentie makenhesion van tandheelkundige acryl.
- Met behulp van een high-speed chirurgische boren, voert u een rechthoekige craniotomie (1 mm caudale en 3 mm laterale, gecentreerd op 5,1 mm staart, 0 mm lateraal van bregma) over de olfactorische bollen. Om dit te doen, voorzichtig dun de schedel tot er slechts een dunne laag van het bot blijft. Verwijder voorzichtig het resterende bot met behulp van een gebogen naald van de spuit. Speciale aandacht moet worden genomen om te voorkomen dat aanprikken van de dura materie en doorbreken van de grote bloedvaten die liggen tussen de twee hersenhelften en in de caudale rand van de olfactorische bollen. Bloed-accumulatie en coagulatie bij de hersenen oppervlak sluit een optimale lichtinval in het weefsel. Spoel de craniotomie en het oppervlak van de hersenen met een steriele zoutoplossing en droog de schedel.
- Bevestig de miniatuur LED aan op de connector. Laat de miniatuur LED aan de bovenkant van de olfactorische bollen. De hoofdas van de miniatuur LED moet worden parallel aan de rostrale-caudale as van de muis, schoon met steriele zoutoplossing en dry de schedel. Bevestig vervolgens de LED op de schedel met een eerste laag van acryl (dat wil zeggen, polycarboxylaatcement cement), gevolgd door een tweede laag van tandheelkundige acryl. De toevoeging van twee kleine schroeven kan nodig zijn om de LED te lossen. De schroeven moeten worden ingebracht op de schedel (achterste om de LED positie) en bedekt met beide acryl. Terwijl de acryl is nog vloeibaar, terug te trekken en lijm van de vrije randen van de hoofdhuid op het oppervlak van de tandheelkundige acryl. Zorg ervoor dat u geen acryl toe te passen op de connector. Nadat de acryl is uitgehard, verwijdert u het dier stereotaxische apparatuur en laat het terug op een warming pad voordat u terugkeert naar kooi. Dieren worden gelaten geïsoleerd in hun kooi om van de operatie terug voor ten minste zeven dagen. Bovendien kunnen dieren worden gegeven een niet-steroïdale anti-inflammatoire analgetica (bijv. Carprofen 4mg/kg) onmiddellijk na en 3 dagen na de operatie. LED's moet worden getest vóór de implantatie en na beëindiging van de experimenten.
- Een lichte elektrischecal-kabel wordt gebruikt om ketting het dier een huidige controller voor LED gekoppeld aan een pulsgenerator (Master-8) om de timing en de intensiteit van de LED te controleren. De dunne kabel zorgt voor volledige vrijheid van beweging. Zorg ervoor dat de polariteit van de connector te respecteren. Omkeren van de polariteit kan breken de LED.
3. Representatieve resultaten:
ChR2-YFP wordt uitgedrukt in getransduceerd neuronen ongeveer 48 uur na de injectie, en blijft stabiel gedurende enkele maanden 7. Figuur 1 is een representatief beeld van een sagittale doorsnede van een paraformaldehyde-vaste dieren 15 dagen na de injectie. Let op de dichte etikettering en de grootte van de plaats van injectie in de RMS. Een groot aantal van de pasgeboren cellen zijn gemigreerd langs de RMS om de verschillende lagen van de bulbus olfactorius (afb. 1) koloniseren. Het fusie-eiwit wordt uitgedrukt in alle neuron compartimenten, inclusief de soma, dendrieten, en stekels.
Miniatuur LED impla ntation maakt op grote schaal en goedkoop optische stimulatie van een brede regio van belang. Het dier is gebonden aan de LED controller met een lichte elektrische kabel die een volledige vrijheid van beweging mogelijk maakt. Door het karakteriseren van het licht diffusie in het hersenweefsel en de drempel van ChR2 activatie, schatten we dat optische activatie zou kunnen worden geactiveerd op een diepte van ~ 2 mm onder het oppervlak van de LED (Fig. 2A). Voor het bewaken van de functionele activering van neuronen ChR2-expressie in vivo, kan de expressie van c-fos, een marker van neuronale activiteit, worden geanalyseerd na repetitieve lichte stimulatie (Fig. 2B). Als alternatief, kan in vitro elektrofysiologische opnames van ChR2-expressie neuronen gekoppeld aan het licht focale stimulatie worden uitgevoerd 14. Tot slot zijn twee-foton gerichte loose-patch opnames is gebruikt om de functionele activering van ChR2-expressie corticale neuronen door vergelijkbare miniatuur LED-in-vivo-9 studie.
ntent ">
Figuur 1. ChR2-YFP expressie van lentivirale injectie in de rostrale trekkende stroom. Vertegenwoordiger confocale beelden van een saggital delen van de bulbus olfactorius van een muis 15 dagen na de injecties van een lentivirus in de rostrale RMS. Let op de aanwezigheid van verstrooide YFP pasgeboren neuronen migreren van het einde van de RMS om de verschillende lagen van de OB. De meeste van pasgeboren cellen (95%) zijn granule cellen, die soma liggen in de Korrel Cell Layer (GCL) en dendrieten arborize in de externe plexiform Layer (EPL). Een kleine populatie van de pasgeboren neuronen tot migreren naar de meest oppervlakkige laag van de OB, in de glomerulaire Layer (GL). Schaal bar, 100 urn. Inzet, hoge vergroting van een pasgeboren korrel cel, waarin het membraan expressie van ChR2-YFP in de dendrieten als in stekels. Schaalbalk, 20μm.
Figuur 2. Diagram van geïmplanteerde LED op de bovenkant van de bulbus olfactorius en licht opgewekte c-fos expressie in ChR2-YFP verwoorden van nieuwe granule cellen.
A, Schematische tekening van de geïmplanteerde-LED boven de olfactorische bollen.
B, vertegenwoordiger confocale beelden die dubbel-gelabeld ChR2-YFP + c-fos + granule cellen een uur na het licht stimulatie van de bulbus olfactorius. C-fos expressie is onthuld met behulp van een konijn anti-c-fos primaire antilichaam (Calbiochem, 1:5000) en de A568-geconjugeerd anti-konijn secundair antilichaam (Invitrogen, 1:1000). Schaalbalk, 10μm.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Optogenetic tools hebben onlangs gestegen onze controle over de selectieve neuronale populaties, met inbegrip van volwassen geboren neuronen in de olfactorische systeem. Hier beschrijven we hoe u een stereotaxische injectie van een lentivirale vector die ChR2-YFP in een specifieke populatie van volwassen geboren neuronen uit te voeren. Door zorgvuldig toezicht op de periode na de injectie, zijn we in staat om te analyseren en manipuleren van de activiteit van een cohort van volwassen geboren neuronen met een relatief homogene leeftijd.
Vanwege hun geringe verspreiding spreiden, hun hoge transductie-efficiëntie en hun relatieve goede tropisme voor neuroblasts van de RMS, moet lentivirale vectoren worden bevoordeeld ten opzichte van andere virale vectoren zoals retrovirussen of adeno-geassocieerde virussen (AAV). Omdat ze selectief infecteren delende cellen, zoals stamcellen of voorlopercellen, moet retrovirus vectoren worden geïnjecteerd in de subventriculaire zone en transduceren een kleinere bevolking van de pasgeboren neuronen. Vergeleken met lentiviraal vEctors, AAV vectoren geven een veel hogere verspreiding van de infectie. Toch moet AAV transductie van neuroblasts in de RMS worden vermeden vanwege de transductie van omliggende structuren, zoals het accessoire olfactorische kern, een regio die projecten weer axonen in de bulbus olfactorius. Ten slotte is het gebruik van LED's geïmplanteerd kan worden toegepast op andere oppervlakkige structuren van de hersenen, zoals corticale gebieden waar ChR2 uitdrukking wordt gedreven in specifieke populaties van neuronen via virale vectoren of via een transgene muis lijn 10.
Met LED-implantatie, zijn wij in staat om chronische optische stimulatie van de functionele rol van de bulbus olfactorius volwassen neurogenese in wakkere dieren gedragen studie toe te passen. Deze eenvoudige lichtbron zorgt voor een snelle tijdelijke controle van het licht dankzij de intrinsiek snel aan / uit-snelheid van de LED's. Naast het feit dat goedkoop, een miniatuur LED-lichtbron levert voldoende vermogen (~ 100mW) voor ChR2 activering in een groot volume van de hersenen11 weefsel, ook bilateraal in het geval van olfactorische lampen. Dit is vooral belangrijk in dit hersengebied waar significante laesies kunnen worden zonder effect op de geur kwaliteitsbeleving te wijten aan een hoge mate van redundantie in de ingangen van het reukepitheel 12. Dankzij de kracht en de spectrale bandbreedte (25Nm), kunnen deze miniatuur LED's worden gebruikt voor licht-excitatie opgeroepen met behulp van ChR2 evenals andere versies van channelrhodopsins zoals Cheta of te vangen. Miniatuur geel (597nm) en rood (624 of 637nm) LED's zijn beschikbaar om te worden gebruikt voor het rood verschoven rhodopsins zoals halorhodopsin en VChR1 13.
Miniatuur LED's tonen ook aan beperkingen. Om te voorkomen dat het verwarmen van de hersenen, moet een compromis worden gevonden tussen de pulsduur, pulsfrequentie, en lichtintensiteit. Zo zijn korte lichtpulsen van 5 milliseconden aanbevolen bij hoge frequenties (> 20 Hz) en de lichtsterkte van 100 mW. Boven deze duur, een significmier verhoging van de temperatuur (~ 1-4 ° C) in het omliggende weefsel kan worden gemeten. Deze parameter moet rekening worden gehouden voor langere lichtpulsen (> 5 ms) of continu licht stimulatie, met name in het geval van licht-hyperpolarisatie opgeroepen met behulp van halorhodopsin. Daarnaast is de huidige leveren van de LED zorgt voor een sterke elektrische artefact, die zich kan verzetten tegen in vivo elektrofysiologische-opnamen wanneer de LED is in direct contact met het weefsel. Laser-gekoppelde optische vezels vormen een mogelijk alternatief, waardoor een kleinere en meer beperkt optische stimulatie. Echter, de stijfheid van optische vezels interfereren met bepaalde gedragingen.
Na het karakteriseren van de lichtinval en de functionele stimulatie van neuronen door het licht, kan in vivo optische stimulatie worden geactiveerd in combinatie met gedragstherapie experimenten. Speciale aandacht moet worden genomen ten aanzien van de timing van de stimulatie. Synchronisatie van de photostimuning met een bepaald gedrag of een taak in een gedrags-apparaat, met name tijdens de operante conditionering, kan beslissend zijn voor het vaststellen van een causaal verband tussen de cel activatie en gedrag.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Geen belangenconflicten verklaard.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door het leven verzekeringsmaatschappij "Novalis-Taitbout", Ecole des Neurowetenschappen de Paris (ENB), het Agence Nationale de la Recherche "ANR-09-neur-004" in het kader van "ERA-NET NEURON" van KP7 programma door de Europese Commissie, "Stichting pour la Recherche Medicale", de Letten Foundation en de Stichting Pasteur.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ketamine | Merial | Imalgène 1000 | |
| Xylazine | Bayer AG | Rompum 0.2% | |
| Pipette Puller | Sutter Instrument Co. | P-97 | |
| Glass Capillaries (3.5") | Drummond Scientific | 3-000-203-G/X | |
| Nanoject II Microinjector | Drummond Scientific | 3-000-204 | |
| High speed surgical drill | Fine Science Tools | 18000-17 | |
| Micro Drill Steel Burrs 0.7mm tip diameter | Fine Science Tools | 19008-07 | |
| LED CMS blue 4.6 W | OSRAM | LBW5SN | |
| Female electrical connector (2.54 mm) | Fisher Scientific | BL5.36Z | |
| Current controller for LED (max: 1A) | A1W Electronik | HKO-KL50-1000 | |
| Pulse generator | AMPI | Master-8 | |
| Optical power meter | Thorlabs Inc. | PM100 | |
| Cyanoacrylate adhesive | Loctite | 454 | |
| Polycarboxylate cement (first layer cement) | Septodont | Selfast (#0068Q) | |
| Methacrylate cement (second layer cement) | GC International | Unifast Trad – Liquid (#339292) Unifast Trad – Powder (#339114) | |
| Carprofen | Pfizer Pharma GmbH | Rimadyl |
References
- Lledo, P. M. Adult neurogenesis and functional plasticity in neuronal circuits. Nat. Rev. Neurosci. 7, 179-193 (2006).
- Alonso, M. Turning astrocytes from the rostral migratory stream into neurons: a role for the olfactory sensory organ. J. Neurosci. 28, 11089-11102 (2008).
- Mouret, A. Learning and survival of newly generated neurons: when time matters. J. Neurosci. 28, 11511-11516 (2008).
- Bardy, C. How, when, and where new inhibitory neurons release neurotransmitters in the adult olfactory bulb. J. Neurosci. 30, 17023-17034 (2010).
- Haubensak, W. Genetic dissection of an amygdala microcircuit that gates conditioned fear. Nature. 468, 270-276 (2010).
- Zhang, F. Multimodal fast optical interrogation of neural circuitry. Nature. 446, 633-639 (2007).
- Wang, X., McManus, M. Lentivirus Production. J. Vis. Exp. (32), e1499-e1499 (2009).
- Cardin, J. A. Targeted optogenetic stimulation and recording of neurons in vivo using cell-type-specific expression of Channelrhodopsin-2. Nature protocols. 5, 247-254 (2010).
- Huber, D. Sparse optical microstimulation in barrel cortex drives learned behaviour in freely moving mice. Nature. 451, 61-64 (2010).
- Arenkiel, B. R. In vivo light-induced activation of neural circuitry in transgenic mice expressing channelrhodopsin-2. Neuron. 54, 205-218 Forthcoming.
- Albeanu, D. F. LED arrays as cost effective and efficient light sources for widefield microscopy. PLoS ONE. 3, 2146-2146 (2008).
- Slotnick, B., Bodyak, N. Odor Discrimination and Odor Quality Perception in Rats with Disruption of Connections between the Olfactory Epithelium and Olfactory Bulbs. J. Neurosci. 22, 4205-4216 (2002).
- Gradinaru, V. Molecular and cellular approaches for diversifying and extending optogenetics. Cell. 141, 154-165 (2010).
- Valley, M., Wagner, S., Gallarda, B. W., Lledo, P. Using Affordable LED Arrays for Photo-Stimulation of Neurons. J. Vis. Exp. (57), e3379-e3379 (2011).
