Summary
Neurônios adultos-nascido do bulbo olfativo pode ser controlado usando optogenetically Channelrhodopsin2 expressando injeção lentiviral no fluxo migratório rostral e fotoestimulação crônica com uma miniatura implantado LED.
Abstract
Interneurônios locais são continuamente regeneradas no bulbo olfativo dos roedores adultos 1-3. Neste processo, chamado de neurogênese adulta, células-tronco neurais nas paredes do ventrículo lateral dão origem a neuroblastos que migram para vários milímetros ao longo do córrego migratório rostral (RMS) para alcançar e incorporar no bulbo olfatório. Para estudar as diferentes etapas e do impacto da educação de adultos-nascido integração neurônio em circuitos pré-existentes olfativa, é necessário para, seletivamente, rotular e manipular a atividade dessa população específica de neurônios. O desenvolvimento recente de tecnologias optogenetic oferece a oportunidade de usar a luz para ativar precisamente esta coorte específicos de neurônios, sem afetar os neurônios em torno de 4,5. Aqui, apresentamos uma série de procedimentos para virally expressar Channelrhodopsin2 (ChR2)-YFP em uma coorte temporalmente restrito de neuroblastos na RMS antes de chegar ao bulbo olfativo e tornar-se adulto-nascido neurons. Além disso, mostramos como implantar e calibrar uma miniatura LED para doenças crônicas na estimulação in vivo de ChR2-expressando neurônios.
Protocol
1. Estereotáxica injeções
- O vírus usado nesses experimentos é um vetor de replicação-deficiente lentiviral com base no vírus HIV para expressar Channelrhodopsine2-YFP (proteína fluorescente amarela) fusão construção conduzido por um promotor sinapsina 6. O plasmídeo foi generosamente fornecidos pelo grupo de pesquisa K. Deisseroth 's ( http://www.stanford.edu/group/dlab/optogenetics/index.html ). Lentivírus podem ser obtidas de fontes comerciais ou produzidos no laboratório de acordo com protocolos estabelecidos 7. Vector títulos médios foram da ordem de 10 10 unidades de transdução / ml. Alíquotas virais são armazenadas a -80 ° C e devem ser descongeladas apenas antes de carregá-pipeta. Múltiplas congelamento / descongelamento deve ser evitado. Nunca exposição solução o vírus diretamente para gelo seco.
- Prepare pipetas de vidro usando vidro borosilicato capilares no padrão pipeta extrator (Sutter P-97 Pipeta extrator). A configuração puxando deve ser devidamente calibrado para render uma pipeta longa e rígida. Em seguida, corte a ponta da pipeta usando uma tesoura para obter uma ponta de 30-40 mM de diâmetro. Loja puxado pipetas em uma caixa livre de poeira.
- Configurar o Nanoject II microinjetor com as instruções do fabricante para entrega de 50 nL. Prepare a pipeta de injeção por volta de enchimento com óleo mineral e inseri-lo para o êmbolo microinjetor. Anexar o microinjetor em um quadro estereotáxico. Óleo parcialmente vazias da pipeta de vidro antes de encher com a solução de vírus
- Com uma micropipeta, a transferência de 2 ml de solução de vírus em um pedaço estéril de Parafilm. Suavemente inferior a pipeta de vidro na gota de solução de vírus e encher a pipeta com 1-2 mL. Certifique-se que não há bolhas de ar na pipeta.
- Anestesiar um mouse com 100 Ketamina mg / kg e 10 Xilazina mg / kg, diluída em solução salina estéril. Remover os pêlos do couro cabeludo doanimal usando cortadores de roedor, navalha, tesoura, ou agente depilitory química. Desinfectar o couro cabeludo com três aplicações de alternância de etanol 70% e betadine. Todos os instrumentos cirúrgicos também devem ser autoclavados e depois desinfetados com álcool 70%. Colocar o animal no quadro estereotáxico com barras de orelha e nariz bar, assegurando que a cabeça está seguro. Aplicar pomada para evitar a secagem das córneas.
- Com um bisturi, cortou o couro cabeludo de entre os olhos para entre as orelhas. Puxe a pele de lado a expor o crânio e ancorar a pele com um par de pinças. Limpe a superfície do crânio. O aparelho estereotáxico é zerado com a ponta da pipeta de vidro na bregma. Então a dica é posicionado no local da injecção (ântero-posterior, 3,30; Medio-Lateral, ± 0,82, para ambos os hemisférios direito e esquerdo, respectivamente). A posição da barra de nariz tem que ser ajustada de acordo com o cálculo das coordenadas estereotáxica. Em nosso experimento, a barra de nariz é ajustado uté bregma e local da injeção são alinhados à mesma altura.
- Identificar o local da injeção. Usando uma broca de alta rotação cirúrgica, com cuidado faça furos no crânio. Com uma agulha de seringa dobrados enganchado na ponta, retire os restos de ossos finos para expor a dura-máter. Verifique se o buraco é centralizado na posição correta. Tome cuidado para não vasos sanguíneos ruptura na superfície do cérebro durante a perfuração. Se os vasos sanguíneos são rompidos, pressione suavemente na superfície do cérebro com um pequeno chumaço de algodão ou tecido por vários segundos até que o fluxo de sangue pára.
- Inferior a pipeta e zero a altura dorso-ventral, quando a ponta da pipeta toca a superfície do cérebro. Então, menor a profundidade correta Dorso-Ventral (Dorso-Ventral, 2,9 de superfície do cérebro) e aguarde 30 segundos para o equilíbrio de pressão. Injetar 4 vezes 50 nl de vírus para um total de 200 nl. Aguarde 30 segundos entre cada injeção.
- Um minuto após a última injecção, lentamente retirar o tubotte. Repita 1,6-1,8 pontos para outro hemisfério. Remover o animal do aparelho estereotáxico, limpe a incisão e costure a pele cortada com fios cirúrgicos. Permitir que o animal se recuperar na almofada de aquecimento antes de retornar a gaiola. Além disso, os animais podem ser dado um analgésico não-esteróides anti-inflamatórias (por exemplo, carprofeno 4mg/kg) imediatamente após e 3 dias após a cirurgia.
2. Implantação LED crônica para estimulação in vivo optogenetic no bulbo olfativo
- Animais injetados com partículas lentiviral bilateralmente estão próximos cronicamente implantados com um azul miniatura LED (Osram, LED 4.6W CMS azul). Soldar os pinos LED a um conector fêmea miniatura elétrica para que o conector é posicionado no lado oposto do LED. Verifique se não há nenhum corte curto elétrica e identificar o pino positivo e negativo do conector. Teste o LED ligando-o a um controlador de corrente para LED apesar de um cabo apropriado.
- Para medir e / ou define o poder absoluto da luz LED, montar o LED em um micromanipulador e posição do LED em contato direto com o fotodetector de um medidor de energia de um pico de intensidade da luz em 470 nm. Perfurar um furo de 3 mm de diâmetro em uma placa de PVC opaco. Apor pinhole isso para o medidor de energia e construir uma curva padrão de potência óptica contra entrada de corrente para calcular a potência por mm 2.
- Para medir a propagação da luz através do cérebro, cortar blocos de tecido cerebral fresco de 300, 500, 1000, 1500 e 2500 mM espessura em 0-4 ° C ACSF usando um 14 vibratome. Coloque um pedaço de crânio com uma craniotomia idêntico ao realizado em camundongos vivem sob o LED. Em primeiro lugar, medir a potência de luz sem tecido centrada em LED. Em seguida, coloque cada bloco de tecido entre o LED eo fotodetector do medidor de potência, e medir o poder. Construir uma curva de espessura do tecido contra fração de transmissão relativo, calculado como a razãoentre a potência medida através do tecido e sem tecido.
- Anestesiar um mouse com 100 Ketamina mg / kg e 10 Xilazina mg / kg, diluída em solução salina estéril. Limpar e desinfetar o LED com etanol 70%. Remover os pêlos do couro cabeludo do animal e desinfete o couro cabeludo com três aplicações de alternância de etanol 70% e betadine. Em seguida, colocar o animal no quadro estereotáxico. Aplicar pomada para evitar a secagem das córneas. Ligue o conector a um detentor estereotáxica. A posição da barra de nariz deve ser ajustado até que a superfície do crânio acima do bulbo olfativo é perfeitamente horizontal e paralela à superfície da miniatura LED.
- Com um bisturi, cortou o couro cabeludo de 3 mm anterior aos olhos a 3 mm posterior para os ouvidos. Puxe a pele de lado e ancorá-la com um par de pinças. Raspe a membrana na superfície do crânio usando uma lâmina de barbear. Limpe e seque o crânio. Aplique uma capa fina de cola de cianoacrilato para permitir ad subseqüenteshesion de acrílico dental.
- Usando uma broca de alta rotação cirúrgico, realizar uma craniotomia retangular (1 mm e 3 mm caudal lateral; centrada em 5,1 milímetros caudal, 0 mm lateral do bregma) ao longo dos bulbos olfatórios. Para fazer isso, com cuidado até o fina do crânio apenas uma fina camada de osso permanece. Remova cuidadosamente o osso remanescente com a ajuda de uma agulha de seringa dobrados. Cuidados especiais devem ser tomados para evitar a perfuração da matéria dura e ruptura dos vasos sanguíneos principais que se encontram entre os dois hemisférios e na borda caudal do bulbo olfatório. Acúmulo de sangue e coagulação na superfície do cérebro impede a penetração da luz ideal para o tecido. Lavar a craniotomia ea superfície do cérebro com solução salina estéril e, em seguida, secar o crânio.
- Anexar a miniatura de LED para o conector. Inferior a miniatura LED na parte superior do bulbo olfatório. O eixo principal do LED miniatura deve ser paralela ao eixo rostral-caudal do rato, limpa com solução salina estéril e dry o crânio. Então segura o LED para o crânio com uma primeira camada de acrílico (de cimento, ou seja, policarboxilato), seguido por uma segunda camada de acrílico dental. A adição de dois parafusos pequenos pode ser obrigado a corrigir o LED. Os parafusos devem ser inseridas no crânio (posterior à posição LED) e coberto com ambos os acrílicos. Enquanto o acrílico é ainda líquido, puxar para trás e cola as bordas livres do couro cabeludo na superfície do acrílico dental. Tome cuidado para não aplicar qualquer acrílico sobre o conector. Depois que o acrílico tem endurecido, retire o animal do aparelho estereotáxico e deixá-lo recuperar em uma almofada de aquecimento antes de retornar a gaiola. Animais fiquem isolados em sua gaiola para se recuperar da cirurgia para pelo menos sete dias. Além disso, os animais podem ser dado um analgésico não-esteróides anti-inflamatórias (por exemplo, carprofeno 4mg/kg) imediatamente após e 3 dias após a cirurgia. LEDs devem ser testados antes da implantação e após o término dos experimentos.
- A luz electrical cabo é utilizado para amarrar o animal a um controlador de corrente para LED acoplado a um gerador de pulsos (Master-8) para controlar o tempo e intensidade do LED. O cabo fino permite a completa liberdade de movimento. Tome o cuidado de respeitar a polaridade do conector. Invertendo a polaridade pode quebrar o LED.
3. Resultados representativos:
ChR2-YFP é expressa em neurônios transduzidas aproximadamente 48 horas após a injeção, e permanece estável por vários meses 7. A Figura 1 é uma imagem representativa de um corte sagital de um animal de paraformaldeído fixa 15 dias após a injecção. Observe a rotulagem denso eo tamanho do local de injecção na RMS. Um grande número de células recém-nascidas têm migrado ao longo da RMS para colonizar as diferentes camadas do bulbo olfatório (Fig. 1). A proteína de fusão é expressa em todos os compartimentos neurônio, incluindo a soma, os dendritos, e espinhas.
Miniature LED impla ntation permite em larga escala ea estimulação óptica barata de uma ampla região de interesse. O animal é amarrado ao controlador de LED com um cabo de luz elétrica que permite uma total liberdade de movimentos. Caracterizando a difusão da luz no tecido cerebral e no limiar de ativação ChR2, estima-se que a ativação óptica pode ser acionado a uma profundidade de 2 milímetros ~ abaixo da superfície do LED (Fig. 2A). Para monitorar a ativação funcional de ChR2-expressando neurônios in vivo, a expressão de c-fos, um marcador de atividade neuronal, podem ser analisados após a estimulação repetitiva de luz (Fig. 2B). Como alternativa, em gravações vitro eletrofisiológicas de neurônios expressando-ChR2 acoplado ao estímulo de luz focal pode ser realizada 14. Finalmente, dois fótons alvo solta-patch gravações têm sido usados para estudar a ativação funcional de ChR2-expressando neurônios corticais por LED miniatura similar in vivo 9.
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Figura 1. ChR2-YFP expressão da injeção lentiviral na corrente migratória rostral. Representante imagens confocal de seções sagital do bulbo olfativo de um rato de 15 dias após as injeções de um lentivírus na RMS rostral. Observe a presença de neurônios espalhados YFP migrando do recém-nascido no final do RMS para as diferentes camadas da OB. A maioria das células recém-nascidos (95%) são células granulares, que soma mentira na camada de célula granular (GCL) e dendritos arborize na camada plexiforme externa (EPL). A pequena população de neurônios recém-nascidos migram para a camada mais superficial da OB, na camada glomerular (GL). Barra de escala, 100μm. Ampliação, Inset alto de uma célula granular recém-nascido, mostrando a expressão membrana de ChR2-YFP nos dendritos, assim como em lombadas. Barra de escala, 20Hm.
Figura 2. Diagrama de implantado LED na parte superior do bulbo olfatório e luz evocadas expressão c-fos em ChR2-YFP expressando células granulares novas.
Um desenho esquemático do LED implantados acima do bulbo olfatório.
B, Representante imagens confocal mostrando duplo rotulados ChR2-YFP + c-fos células grânulo + uma hora após estimulação luminosa do bulbo olfatório. C-fos expressão é revelada através de um coelho de anticorpos anti-c-fos primária (Calbiochem, 1:5000) e A568-conjugados de anticorpos anti-coelho secundário (Invitrogen, 1:1000). Barra de escala, 10μm.
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Discussion
Ferramentas Optogenetic aumentaram recentemente o nosso controle sobre as populações neuronal seletiva, incluindo os neurônios adultos nascidos no sistema olfativo. Aqui nós descrevemos como executar uma injeção estereotáxica de um vetor lentiviral expressar ChR2-YFP em uma população específica de adultos-nascido neurônios. Através da monitorização cuidadosa do período pós-injeção, somos capazes de analisar e manipular a atividade de uma coorte de adultos-nascido neurônios com uma idade relativa homogênea.
Por causa da sua propagação baixa difusão, a sua eficiência de transdução de alta e seu tropismo relativa bom para neuroblastos da RMS, lentivirais deve ser favorecido em relação aos outros vetores virais, tais como retrovírus ou vírus adeno-associado (AAV). Porque seletivamente infectar células em divisão, como as células-tronco ou progenitoras, vetores retrovirais deve ser injetado na zona de subventricular e transdução de uma população menor de neurônios recém-nascido. Em comparação com lentiviral vectors, vetores AAV oferecer um spread muito mais elevado de infecção. No entanto, AAV transdução de neuroblastos na RMS devem ser evitados por causa da transdução de estruturas vizinhas, tais como o núcleo acessório olfativo, uma região que projetos de axônios de volta para o bulbo olfativo. Por fim, o uso de LEDs implantado pode ser aplicado a outras estruturas superficiais do cérebro, tais como regiões corticais em que ChR2 expressão é conduzido em populações específicas de neurônios por meio de vetores virais ou através de uma linha de camundongos transgênicos 10.
Com o implante de LED, que são capazes de aplicar a estimulação óptica crônica para estudar o papel funcional da neurogênese adulta em bulbo olfatório acordado animais se comportando. Esta fonte de luz simples, proporciona um controle rápido temporal da luz graças a rápida intrinsecamente ligado / desligado velocidade de LEDs. Além de ser barato, uma fonte de luz LED em miniatura produz energia suficiente (~ 100mW) para ChR2 ativação em um grande volume de cérebrotecido 11, mesmo a nível bilateral, no caso de bulbos olfatórios. Isto é particularmente importante nesta região do cérebro onde as lesões significativas podem ser sem efeito sobre a percepção do odor de qualidade devido a um alto grau de redundância nas entradas das 12 epitélio olfativo. Graças ao seu poder e sua largura de banda espectral (25nm), esses LEDs em miniatura pode ser usado para a excitação de luz evocada usando ChR2 bem como outras versões do channelrhodopsins como CHETA ou Catch. Miniatura amarelo (597nm) e vermelho (624 ou 637nm) LEDs estão disponíveis para ser usado para o vermelho-shifted rodopsinas como halorodopsina e VChR1 13.
LEDs em miniatura que também apresentam limitações. Para evitar o aquecimento do cérebro, um compromisso deve ser encontrada entre duração do pulso, freqüência de pulso e intensidade da luz. Por exemplo, pulsos curtos de luz de 5 milissegundos são recomendados em altas freqüências (> 20 Hz) e intensidade de luz de 100 mW. Acima deste período, uma significelevação da temperatura da formiga (~ 1-4 ° C) no tecido circundante pode ser medido. Este parâmetro deve ser tida em conta para mais pulsos de luz (> 5 ms) ou estimulação de luz contínua, nomeadamente no caso de hiperpolarização-luz evocada usando halorodopsina. Além disso, a corrente de abastecer o LED oferece artefato elétrica forte, que pode impedir in vivo gravações eletrofisiológicas quando o LED está em contato direto com o tecido. Laser-coupled fibras ópticas constituem uma alternativa possível, permitindo uma estimulação menor e mais restrito óptica. No entanto, a rigidez das fibras ópticas podem interferir com certos comportamentos.
Após a caracterização da penetração da luz e do estímulo funcional de neurônios pela luz, na estimulação óptica vivo pode ser acionado em combinação com experimentos comportamentais. Cuidados especiais devem ser tomados quanto ao momento da estimulação. Sincronização do photostimumento com um comportamento específico ou tarefa em um aparelho de comportamento, nomeadamente durante o condicionamento operante, poderia ser decisivo para estabelecer um nexo de causalidade entre a ativação celular e comportamento.
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Disclosures
Não há conflitos de interesse declarados.
Acknowledgments
Este trabalho foi financiado pela empresa de seguros de vida "Novalis-Taitbout", Ecole des Neurociências de Paris (PEV), a Agence Nationale de la Recherche "ANR-09-NEUR-004" no quadro de "NEURON ERA-NET" de FP7 programa pela Comissão Europeia, "Foundation pour la Recherche Medicale", a Fundação Letten ea Fundação Pasteur.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ketamine | Merial | Imalgène 1000 | |
| Xylazine | Bayer AG | Rompum 0.2% | |
| Pipette Puller | Sutter Instrument Co. | P-97 | |
| Glass Capillaries (3.5") | Drummond Scientific | 3-000-203-G/X | |
| Nanoject II Microinjector | Drummond Scientific | 3-000-204 | |
| High speed surgical drill | Fine Science Tools | 18000-17 | |
| Micro Drill Steel Burrs 0.7mm tip diameter | Fine Science Tools | 19008-07 | |
| LED CMS blue 4.6 W | OSRAM | LBW5SN | |
| Female electrical connector (2.54 mm) | Fisher Scientific | BL5.36Z | |
| Current controller for LED (max: 1A) | A1W Electronik | HKO-KL50-1000 | |
| Pulse generator | AMPI | Master-8 | |
| Optical power meter | Thorlabs Inc. | PM100 | |
| Cyanoacrylate adhesive | Loctite | 454 | |
| Polycarboxylate cement (first layer cement) | Septodont | Selfast (#0068Q) | |
| Methacrylate cement (second layer cement) | GC International | Unifast Trad – Liquid (#339292) Unifast Trad – Powder (#339114) | |
| Carprofen | Pfizer Pharma GmbH | Rimadyl |
References
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