Summary
घ्राण बल्ब की वयस्क जन्मे न्यूरॉन्स optogenetically Channelrhodopsin2 व्यक्त lentiviral इंजेक्शन विजय - स्तम्भ प्रवासी और एक प्रत्यारोपित लघु के साथ पुरानी photostimulation धारा में एलईडी का उपयोग कर नियंत्रित कर सकते हैं.
Abstract
स्थानीय interneurons लगातार वयस्क 1-3 कृन्तकों की घ्राण बल्ब में पुनर्जीवित कर रहे हैं. इस प्रक्रिया में, वयस्क neurogenesis कहा जाता है, पार्श्व वेंट्रिकल की दीवारों में तंत्रिका स्टेम कोशिकाओं neuroblasts है कि विजय - स्तम्भ प्रवासी धारा (आरएमएस) तक पहुँचने के लिए और घ्राण बल्ब में शामिल के साथ कई मिलीमीटर के लिए विस्थापित को जन्म दे. विभिन्न चरणों और घ्राण सर्किट preexisting में वयस्क जन्म न्यूरॉन एकीकरण के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए, यह करने के लिए चुनिंदा लेबल और न्यूरॉन्स के इस विशिष्ट जनसंख्या की गतिविधि में हेरफेर करने के लिए आवश्यक है. optogenetic प्रौद्योगिकियों के हाल ही के विकास के प्रकाश का उपयोग करने के लिए ठीक आसपास न्यूरॉन्स 4,5 को प्रभावित किए बिना न्यूरॉन्स के इस विशिष्ट काउहोट सक्रिय करने का अवसर प्रदान करता है. यहाँ, हम आरएमएस में neuroblasts की एक अस्थायी प्रतिबंधित काउहोट में मौजूद virally व्यक्त Channelrhodopsin2 करने के लिए प्रक्रियाओं की एक श्रृंखला (ChR2) YFP से पहले वे घ्राण बल्ब तक पहुँचने और वयस्क जन्म बन पूर्वोत्तरurons. इसके अलावा, हम बताते हैं कैसे प्रत्यारोपण और एक ChR2 व्यक्त न्यूरॉन्स के vivo उत्तेजना में जीर्ण के लिए एलईडी लघु जांचना .
Protocol
1. Stereotaxic इंजेक्शन
- इन प्रयोगों में इस्तेमाल वायरस एक प्रतिकृति की कमी lentiviral वेक्टर एचआईवी वायरस के आधार पर Channelrhodopsine2 YFP (पीले फ्लोरोसेंट प्रोटीन) व्यक्त संलयन निर्माण synapsin 6 प्रमोटर द्वारा संचालित. प्लाज्मिड उदारता लालकृष्ण 'Deisseroth अनुसंधान समूह (द्वारा प्रदान की गई थी http://www.stanford.edu/group/dlab/optogenetics/index.html ). Lentiviruses वाणिज्यिक स्रोतों से प्राप्त किया जा सकता है है या उत्पादित प्रयोगशाला में स्थापित 7 प्रोटोकॉल के अनुसार . औसत वेक्टर titers 10 10 पारगमन इकाइयों / मिलीलीटर के क्रम में थे. वायरल aliquots -80 ° C पर संग्रहीत कर रहे हैं और विंदुक लोड हो रहा है बस से पहले thawed होना चाहिए. एकाधिक / फ्रीज पिघलना चक्र से बचा जाना चाहिए. वायरस कभी जोखिम सीधे सूखी बर्फ हल.
- कांच मानक विंदुक डांड़ी (Sutter पी पर borosilicate ग्लास capillaries का उपयोग pipettes तैयार-97 विंदुक डांड़ी). खींच सेटिंग ठीक करने के लिए एक लंबी और कठोर विंदुक उपज कैलिब्रेटेड चाहिए. अगला, कैंची की एक जोड़ी का उपयोग करने के लिए व्यास में 30-40 सुक्ष्ममापी की एक टिप प्राप्त विंदुक की नोक काटा. स्टोर एक धूल मुक्त बॉक्स में pipettes खींच लिया.
- 50 NL के प्रसव के लिए निर्माता के निर्देशों के साथ Nanoject द्वितीय microinjector सेटअप. खनिज तेल के साथ पीठ - भरने के द्वारा इंजेक्शन विंदुक तैयार microinjector सवार सम्मिलित हैं. एक stereotaxic फ्रेम पर microinjector संलग्न. पहले वायरस समाधान के साथ भरने ग्लास विंदुक से आंशिक रूप से खाली तेल
- एक micropipette के साथ, Parafilm की एक बाँझ टुकड़ा पर वायरस समाधान के 2 μl हस्तांतरण. धीरे वायरस समाधान के ड्रॉप में ग्लास विंदुक कम और 1-2 μl के साथ विंदुक भरने. सुनिश्चित करें कि वहाँ पिपेट में कोई हवाई बुलबुले हैं.
- 100 Ketamine मिलीग्राम / किग्रा और 10 मिलीग्राम / किग्रा, Xylazine बाँझ खारा में पतला के साथ एक माउस anesthetize. की खोपड़ी से बालों को निकालेंका उपयोग पशु कृंतक कतरनी, रेजर, कैंची, या रासायनिक depilitory एजेंट. 70% इथेनॉल और betadine बारी के तीन अनुप्रयोगों के साथ खोपड़ी कीटाणुरहित. सभी शल्य चिकित्सा उपकरणों और autoclaved भी होना चाहिए तो 70% इथेनॉल के साथ कीटाणुरहित. कान सलाखों और नाक पट्टी के साथ stereotaxic फ्रेम में पशु प्लेस, आश्वस्त है कि सिर सुरक्षित है. नजर मरहम लागू corneas के सुखाने को रोकने के लिए.
- एक स्केलपेल के साथ, आंखों के बीच से कान के बीच खोपड़ी में कटौती. खोपड़ी बेनकाब और clamps के एक जोड़ी के साथ त्वचा लंगर त्वचा तरफ खींचो. खोपड़ी की सतह को साफ करें. stereotaxic तंत्र ब्रैग्मा ग्लास विंदुक टिप के साथ चुना है. फिर टिप इंजेक्शन साइट (Medio पार्श्व, क्रमशः ± दाएँ और बाएँ दोनों गोलार्द्धों के लिए 0.82, Antero पोस्टीरियर, 3.30) पर तैनात है. नाक पट्टी की स्थिति stereotaxic निर्देशांक की गणना के अनुसार समायोजित किया जा है. हमारे प्रयोग में, नाक बार यू निकाला जाता हैntil ब्रैग्मा और इंजेक्शन साइट में एक ही ऊंचाई के लिए गठबंधन कर रहे हैं.
- इंजेक्शन स्थल को पहचानें. एक उच्च गति शल्य चिकित्सा ड्रिल का प्रयोग, ध्यान से खोपड़ी छेद ड्रिल. तुला सिरिंज सुई नोक पर झुका के साथ, पतली हड्डी के अवशेष को हटाने के लिए dura मेटर का पर्दाफाश. जाँच करें कि छेद सही स्थिति में केंद्रित है. टूटना रक्त वाहिकाओं के लिए ड्रिलिंग जबकि मस्तिष्क की सतह पर परवाह नहीं है ले लो. यदि रक्त वाहिकाओं उठी हैं, एक छोटे से कपास या कली ऊतक के साथ कई सेकंड के लिए मस्तिष्क की सतह पर धीरे दबाएँ जब तक रक्त का प्रवाह रुक जाता है है.
- विंदुक निचले और जब विंदुक की नोक मस्तिष्क की सतह को छू Dorso-ventral ऊंचाई शून्य. फिर, सही ventral-Dorso गहराई (Dorso-ventral, मस्तिष्क की सतह से 2.9) के लिए कम और दबाव संतुलन के लिए 30 सेकंड प्रतीक्षा है. 200 nl की कुल के लिए 4 बार वायरस के 50 nl इंजेक्षन. प्रत्येक इंजेक्शन के बीच 30 सेकंड रुको.
- एक मिनट, पिछले इंजेक्शन के बाद धीरे धीरे पाइप वापस लेनेtte. दोहराएँ दूसरे गोलार्द्ध के लिए 1.6-1.8 अंक. Stereotaxic तंत्र से पशु निकालें, चीरा और सिलाई कटौती शल्य धागे का उपयोग त्वचा को साफ. पशु वार्मिंग पैड पर पिंजरे लौटने से पहले ठीक करने के लिए अनुमति दें. इसके अतिरिक्त, पशुओं के तुरंत बाद एक गैर स्टेरायडल विरोधी भड़काऊ एनाल्जेसिक (जैसे, Carprofen 4mg/kg) दिया जा सकता है और 3 दिन सर्जरी के बाद.
2. घ्राण बल्ब में लगातार vivo optogenetic उत्तेजना में के लिए एलईडी आरोपण
- Lentiviral कणों के साथ इंजेक्शन पशु द्विपक्षीय अगले लंबे समय से एक लघु नीले एलईडी (Osram, एलईडी सीएमएस 4.6W नीले) के साथ प्रत्यारोपित कर रहे हैं. मिलाप एक महिला लघु बिजली संबंधक करने के लिए एलईडी पिन ताकि कनेक्टर एलईडी के विपरीत पक्ष पर तैनात है. जाँच करें कि वहाँ कोई बिजली के शॉर्ट कट है और सकारात्मक और नकारात्मक पिन संबंधक पर पहचान. यह एक उचित केबल हालांकि एलईडी के लिए एक मौजूदा नियंत्रक को जोड़ने के द्वारा एलईडी टेस्ट.
- मापने के लिए और / या एलईडी पूर्ण प्रकाश सत्ता स्थापित माउंट, एक micromanipulator और स्थिति पर 470 एनएम चोटी प्रकाश की तीव्रता का एक बिजली मीटर के photodetector के साथ सीधे संपर्क में एलईडी एलईडी. एक अपारदर्शी पीवीसी बोर्ड में 3 मिमी व्यास के एक pinhole ड्रिल. प्रत्यय बिजली मीटर करने के लिए इस pinhole और ऑप्टिकल शक्ति बनाम वर्तमान इनपुट 2 मिमी के अनुसार बिजली की गणना के एक मानक वक्र का निर्माण.
- मस्तिष्क के माध्यम से प्रकाश के प्रसार को मापने के लिए, 300 के ताजा मस्तिष्क के ऊतकों के ब्लॉक, 500, 1000, 1500 और 2500 0-4 में सुक्ष्ममापी मोटाई · सी ACSF vibratome 14 का उपयोग कर में कटौती. एलईडी के तहत रहते हैं चूहों में प्रदर्शन एक समान कपाल - उच्छेदन के साथ खोपड़ी का एक टुकड़ा रखें. सबसे पहले, एलईडी पर केंद्रित ऊतकों के बिना प्रकाश की शक्ति को मापने. फिर, एलईडी और बिजली मीटर के photodetector के बीच ऊतक के प्रत्येक ब्लॉक जगह है, और शक्ति को मापने. ऊतक मोटाई बनाम रिश्तेदार संचरण अंश अनुपात के रूप में गणना की एक वक्र बनाएँऊतकों के माध्यम से ऊतक के बिना मापा सत्ता के बीच.
- 100 Ketamine मिलीग्राम / किग्रा और 10 मिलीग्राम / किग्रा, Xylazine बाँझ खारा में पतला के साथ एक माउस anesthetize. स्वच्छ और 70% इथेनॉल के साथ एलईडी कीटाणुरहित. जानवर की खोपड़ी से बालों को निकालें और 70% इथेनॉल और betadine बारी के तीन अनुप्रयोगों के साथ खोपड़ी कीटाणुरहित. फिर stereotaxic फ्रेम में जानवरों की जगह है. नजर मरहम लागू corneas के सुखाने को रोकने के लिए. एक stereotaxic धारक को संबंधक संलग्न. नाक पट्टी की स्थिति जब तक घ्राण बल्ब के ऊपर खोपड़ी की सतह पूरी तरह से क्षैतिज और लघु की सतह एलईडी के समानांतर है समायोजित किया जाना चाहिए.
- एक स्केलपेल के साथ, 3 पूर्वकाल आँखों में कानों को पीछे 3 मिमी मिमी से खोपड़ी में कटौती. त्वचा तरफ खींचो और clamps के एक जोड़ी के साथ लंगर. एक रेजर ब्लेड का उपयोग कर खोपड़ी की सतह पर दूर परिमार्जन झिल्ली. साफ और सूखी खोपड़ी. Cyanoacrylate चिपकने के एक पतली कवर को लागू करने के लिए बाद विज्ञापन की अनुमतिदंत एक्रिलिक के hesion.
- घ्राण बल्ब पर, एक उच्च गति शल्य चिकित्सा ड्रिल का प्रयोग, एक आयताकार कपाल - उच्छेदन प्रदर्शन (5.1 मिमी दुम का पर केंद्रित, ब्रैग्मा से 0 पार्श्व मिमी 1 लांगुलिय मिमी और 3 पार्श्व मिमी). ऐसा करने के लिए, ध्यान से पतली खोपड़ी तक केवल हड्डी की एक पतली परत बनी हुई है. ध्यान से एक तुला सिरिंज सुई की मदद से शेष हड्डी को हटा दें. विशेष देखभाल dura बात puncturing प्रमुख रक्त वाहिकाओं है कि दो गोलार्द्धों के बीच घ्राण बल्ब की दुम का सीमा में झूठ rupturing से बचने के लिए रखा जाना चाहिए. रक्त और मस्तिष्क की सतह पर संचय जमावट ऊतक में इष्टतम प्रकाश पैठ precludes. कपाल - उच्छेदन और बाँझ खारा के साथ मस्तिष्क की सतह कुल्ला और फिर खोपड़ी शुष्क.
- संबंधक करने के लिए एलईडी संलग्न लघु. घ्राण बल्ब के शीर्ष पर एलईडी लघु लोअर. लघु एलईडी के मुख्य अक्ष माउस की दुम का अक्ष विजय - स्तम्भ के समानांतर होना, बाँझ खारा और घ के साथ साफ़ चाहिएry खोपड़ी. फिर सुरक्षित एक्रिलिक की पहली परत (यानी, polycarboxylate सीमेंट), दंत चिकित्सा एक्रिलिक की दूसरी परत द्वारा पीछा के साथ खोपड़ी के लिए एलईडी . दो छोटे screws के अलावा एलईडी ठीक करने के लिए आवश्यक हो सकता है. शिकंजा खोपड़ी पर सम्मिलित किया जाना चाहिए (एलईडी स्थिति पोस्टीरियर) और दोनों acrylics के साथ कवर किया. जबकि अभी भी एक्रिलिक तरल है, वापस खींच और गोंद दंत एक्रिलिक की सतह पर खोपड़ी के मुक्त किनारों. संबंधक पर किसी भी एक्रिलिक लागू नहीं ख्याल रखना. एक्रिलिक के बाद कठोर है, stereotaxic तंत्र से पशुओं को हटाने और पिंजरे में लौटने से पहले इसे एक वार्मिंग पैड पर ठीक है. पशु अलग उनके लिए कम से कम सात दिनों के लिए सर्जरी से उबरने के लिए पिंजरे में छोड़ दिया जाता है. इसके अतिरिक्त, पशुओं के तुरंत बाद एक गैर स्टेरायडल विरोधी भड़काऊ एनाल्जेसिक (जैसे, Carprofen 4mg/kg) दिया जा सकता है और 3 दिन सर्जरी के बाद. एल ई डी आरोपण पहले और समाप्ति के बाद प्रयोगों परीक्षण किया जाना चाहिए.
- एक प्रकाश बिजलीकैलोरी केबल एलईडी के लिए एक मौजूदा नियंत्रक एक पल्स जनरेटर (मास्टर 8) के लिए मिलकर समय और एलईडी की तीव्रता को नियंत्रित करने के लिए जानवर पगहा के लिए प्रयोग किया जाता है. पतली केबल आंदोलन की पूरी स्वतंत्रता के लिए अनुमति देता है. ख्याल रखना संबंधक के polarity सम्मान. Inverting polarity एलईडी तोड़ सकता है.
3. प्रतिनिधि परिणाम:
ChR2 YFP इंजेक्शन के बाद लगभग 48 घंटे transduced न्यूरॉन्स में व्यक्त की है, और कई 7 महीने के लिए स्थिर बनी हुई है. चित्रा 1 के एक paraformaldehyde निर्धारित 15 दिनों के बाद इंजेक्शन जानवर के एक बाण के समान खंड के एक प्रतिनिधि तस्वीर है. घने लेबलिंग और आरएमएस में इंजेक्शन साइट के आकार पर ध्यान दें. नवजात कोशिकाओं की एक बड़ी संख्या के RMS के साथ चले गए हैं घ्राण बल्ब (1 छवि) के विभिन्न परतों का उपनिवेश. संलयन प्रोटीन सोम, dendrites, और कांटा सहित सभी न्यूरॉन डिब्बों, में व्यक्त किया है.
लघु एलईडी impla ntation बड़े पैमाने पर है और ब्याज की एक व्यापक क्षेत्र के सस्ती ऑप्टिकल उत्तेजना देता है. जानवर एक प्रकाश बिजली केबल है कि आंदोलन के एक पूर्ण स्वतंत्रता की अनुमति देता है के साथ एलईडी नियंत्रक करने के लिए सीमित है. मस्तिष्क के ऊतकों और ChR2 सक्रियण की दहलीज में प्रकाश प्रसार निस्र्पक करके, हम अनुमान है कि ऑप्टिकल सक्रियण ~ 2mm (2A छवि) के एलईडी की सतह के नीचे की गहराई में चालू किया जा सकता है. के कार्यात्मक सक्रियण की निगरानी करने के लिए ChR2-व्यक्त vivo में न्यूरॉन्स, ग Fos, neuronal गतिविधि के एक मार्कर, की अभिव्यक्ति दोहराव प्रकाश उत्तेजना (छवि 2B) के बाद विश्लेषण किया जा सकता है. एक विकल्प के रूप में 14 ChR2 व्यक्त फोकल प्रकाश उत्तेजना के लिए मिलकर न्यूरॉन्स की इन विट्रो electrophysiological रिकॉर्डिंग प्रदर्शन किया जा सकता है . अंत में, दो photon लक्षित ढीले पैच रिकॉर्डिंग करने के लिए इसी तरह 9 vivo में एलईडी लघु ChR2 cortical न्यूरॉन्स व्यक्त की कार्यात्मक सक्रियण अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया गया है.
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चित्रा 1. विजय - स्तम्भ प्रवासी धारा में lentiviral इंजेक्शन से अभिव्यक्ति ChR2 YFP. विजय - स्तम्भ आरएमएस में एक lentivirus के इंजेक्शन के बाद 15 दिनों के एक माउस के घ्राण बल्ब की saggital वर्गों के प्रतिनिधि confocal छवियों . बिखरे हुए YFP नवजात आरएमएस के अंत से ओबी के विभिन्न परतों के लिए पलायन न्यूरॉन्स की उपस्थिति ध्यान दें. नवजात कोशिकाओं (95%) के अधिकांश ग्रेन्युल कोशिकाओं, जो ग्रेन्युल सेल परत (GCL) और dendrites में सोम झूठ बाहरी उलझन - रूप लेयर (ईपीएल) में arborize हैं. ओबी का सबसे सतही परत, glomerular परत में (जीएल) नवजात शिशु न्यूरॉन्स की एक छोटी सी आबादी पलायन. स्केल पट्टी, 100μm. इनसेट, एक नवजात ग्रेन्युल कोशिका के उच्च बढ़ाई, dendrites में के रूप में के रूप में अच्छी तरह से कांटा में ChR2 YFP की झिल्ली अभिव्यक्ति दिखा. स्केल पट्टी, 20μm.
चित्रा 2. के आरेख प्रत्यारोपित घ्राण बल्ब और ChR2 YFP में प्रकाश पैदा ग FOS अभिव्यक्ति नए ग्रेन्युल कोशिकाओं को व्यक्त करने के शीर्ष पर एलईडी.
ए, घ्राण बल्ब ऊपर प्रत्यारोपित एलईडी की योजनाबद्ध ड्राइंग.
बी, प्रतिनिधि confocal दिखा छवियों डबल लेबल ChR2 YFP + ग - FOS + घ्राण बल्ब के प्रकाश उत्तेजना के बाद एक घंटे ग्रेन्युल कोशिकाओं. सी FOS अभिव्यक्ति एक खरगोश विरोधी c-Fos प्राथमिक (Calbiochem, 1:5000) एंटीबॉडी और A568-संयुग्मित विरोधी खरगोश माध्यमिक एंटीबॉडी (Invitrogen, 1:1000) का उपयोग करने के लिए पता चला है. स्केल पट्टी, 10μm.
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Discussion
Optogenetic उपकरण हाल ही में चयनात्मक घ्राण प्रणाली में वयस्क जन्म न्यूरॉन्स सहित neuronal आबादी पर हमारे नियंत्रण में वृद्धि हुई है. यहाँ हम वर्णन कैसे एक lentiviral वेक्टर वयस्क जन्मे न्यूरॉन्स की एक विशिष्ट जनसंख्या में ChR2 YFP व्यक्त की stereotaxic इंजेक्शन प्रदर्शन करने के लिए. ध्यान से इंजेक्शन के बाद की अवधि की निगरानी करके, हम करने के लिए विश्लेषण और एक रिश्तेदार सजातीय उम्र के साथ वयस्क में जन्मे न्यूरॉन्स की एक पलटन की गतिविधि में हेरफेर करने में सक्षम हैं.
क्योंकि उनके कम प्रसार प्रसार, उनके उच्च पारगमन दक्षता और आरएमएस के neuroblasts के लिए उनके रिश्तेदार अच्छा tropism की, lentiviral वैक्टर रेट्रोवायरस या एडिनो - जुड़े वायरस (AAV) जैसे दूसरों को वायरल vectors की तुलना में इष्ट होना चाहिए. क्योंकि वे चुनिंदा स्टेम कोशिकाओं या progenitors के रूप में विभाजित कोशिकाओं, को संक्रमित, retrovirus वैक्टर subventricular क्षेत्र में इंजेक्शन होना चाहिए और नवजात न्यूरॉन्स की एक छोटी आबादी transduce. Lentiviral ध् की तुलना मेंectors, AAV वैक्टर संक्रमण का एक बहुत उच्च प्रसार प्रदान करते हैं. हालांकि, आरएमएस में neuroblasts के AAV पारगमन जैसे गौण घ्राण नाभिक, एक क्षेत्र है कि परियोजनाओं घ्राण बल्ब में वापस axons आसपास संरचनाओं के पारगमन की वजह से बचा जाना चाहिए. अन्त में, प्रत्यारोपित एल ई डी के उपयोग cortical क्षेत्रों में ChR2 अभिव्यक्ति वायरल vectors के माध्यम से न्यूरॉन्स की विशिष्ट आबादी में या एक ट्रांसजेनिक माउस 10 लाइन के माध्यम से संचालित है जैसे मस्तिष्क के अन्य सतही संरचनाओं को लागू किया जा सकता है.
एलईडी आरोपण के साथ, हम पुरानी जाग बर्ताव पशुओं में घ्राण बल्ब वयस्क neurogenesis की कार्यात्मक भूमिका का अध्ययन ऑप्टिकल उत्तेजना लागू करने में सक्षम हैं. यह सरल प्रकाश स्रोत / एल ई डी की गति बंद आंतरिक रूप से तेजी से प्रकाश धन्यवाद की एक तेजी से अस्थायी नियंत्रण प्रदान करता है. सस्ती होने के अलावा, एक लघु एलईडी प्रकाश स्रोत ChR2 सक्रियण के लिए पर्याप्त (100mW ~) मस्तिष्क की एक बड़ी मात्रा में बिजली का उत्पादन11 ऊतक, घ्राण बल्ब के मामले में भी द्विपक्षीय. यह जहां महत्वपूर्ण घावों गंध गुणवत्ता घ्राण उपकला 12 से आदानों में अतिरेक के एक उच्च डिग्री करने के लिए कारण धारणा पर प्रभाव के बिना हो सकता है इस क्षेत्र मस्तिष्क में विशेष रूप से महत्वपूर्ण है. अपनी शक्ति और अपनी वर्णक्रमीय बैंडविड्थ (25nm) के लिए धन्यवाद, इन लघु एल ई डी प्रकाश पैदा ChR2 के रूप में के रूप में अच्छी तरह से ChETA जैसे channelrhodopsins पकड़ने या दूसरों के संस्करणों का उपयोग कर उत्तेजना के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. लघु (597nm) पीला और (624 या 637nm) लाल एल ई डी halorhodopsin और VChR1 13 जैसे लाल स्थानांतरित rhodopsins के लिए इस्तेमाल किया जा के लिए उपलब्ध हैं.
लघु एल ई डी भी सीमाओं दिखा. मस्तिष्क हीटिंग से बचने के लिए, स्पंद अवधि, नाड़ी आवृत्ति, और प्रकाश की तीव्रता के बीच एक समझौता पाया होना चाहिए. उदाहरण के लिए, 5 मिसे से कम प्रकाश दालों उच्च आवृत्तियों (20Hz>) और 100 मेगावाट की रोशनी की तीव्रता में सिफारिश कर रहे हैं. इस अवधि के ऊपर, एक significआसपास के ऊतकों में तापमान (~ 1-4 डिग्री सेल्सियस) के चींटी ऊंचाई को मापा जा सकता है. इस पैरामीटर अब प्रकाश दालों (5ms>) या लगातार प्रकाश उत्तेजना के लिए खाते में ले लिया होना चाहिए प्रकाश पैदा halorhodopsin का उपयोग hyperpolarization के मामले में विशेष रूप से. इसके अलावा, एलईडी की आपूर्ति वर्तमान मजबूत बिजली विरूपण साक्ष्य के, जो vivo में electrophysiological रिकॉर्डिंग में रोकता है जब एलईडी ऊतक के साथ सीधा संपर्क में है हो सकता है प्रदान करता है. ऑप्टिक फाइबर एक संभावित विकल्प का गठन, एक छोटे और अधिक प्रतिबंधित ऑप्टिकल उत्तेजना की अनुमति लेजर मिलकर. हालांकि, ऑप्टिक फाइबर की कठोरता कुछ व्यवहार के साथ हस्तक्षेप कर सकते हैं.
प्रकाश पैठ और प्रकाश द्वारा न्यूरॉन्स की कार्यात्मक उत्तेजना के निस्र्पक के बाद, vivo में ऑप्टिकल उत्तेजना में व्यवहार प्रयोगों के साथ संयोजन में शुरू किया जा सकता है है. विशेष देखभाल उत्तेजना के समय के बारे में लिया जाना चाहिए. Photostimu के तुल्यकालनएक विशिष्ट व्यवहार या व्यवहार तंत्र में कार्य, operant कंडीशनिंग के दौरान विशेष रूप से, के साथ आबादी सेल सक्रियण और व्यवहार के बीच एक कारण लिंक स्थापित करने के लिए निर्णायक हो सकता है.
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Disclosures
ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.
Acknowledgments
इस काम का जीवन बीमा कंपनी नोवालिस Taitbout "इकोले डेस न्यूरोसाइंसेस डी पेरिस (ENP), Nationale डे ला Recherche" ANR-09-NEUR-004 "Agence से" युग - NET न्यूरॉन "के फ्रेम में समर्थित किया गया यूरोपीय आयोग द्वारा FP7 कार्यक्रम "फाउंडेशन डालना ला Recherche MEDICALE", Letten फाउंडेशन और पाश्चर फाउंडेशन.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ketamine | Merial | Imalgène 1000 | |
| Xylazine | Bayer AG | Rompum 0.2% | |
| Pipette Puller | Sutter Instrument Co. | P-97 | |
| Glass Capillaries (3.5") | Drummond Scientific | 3-000-203-G/X | |
| Nanoject II Microinjector | Drummond Scientific | 3-000-204 | |
| High speed surgical drill | Fine Science Tools | 18000-17 | |
| Micro Drill Steel Burrs 0.7mm tip diameter | Fine Science Tools | 19008-07 | |
| LED CMS blue 4.6 W | OSRAM | LBW5SN | |
| Female electrical connector (2.54 mm) | Fisher Scientific | BL5.36Z | |
| Current controller for LED (max: 1A) | A1W Electronik | HKO-KL50-1000 | |
| Pulse generator | AMPI | Master-8 | |
| Optical power meter | Thorlabs Inc. | PM100 | |
| Cyanoacrylate adhesive | Loctite | 454 | |
| Polycarboxylate cement (first layer cement) | Septodont | Selfast (#0068Q) | |
| Methacrylate cement (second layer cement) | GC International | Unifast Trad – Liquid (#339292) Unifast Trad – Powder (#339114) | |
| Carprofen | Pfizer Pharma GmbH | Rimadyl |
References
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