Summary
후각 망울의 성인에서 태어난 뉴런은 optogenetically Channelrhodopsin2 - 표현 이식 미니어처와 함께 주동이의 철새 스트림과 만성 photostimulation에서 lentiviral 주사를 LED를 사용하여 조절할 수 있습니다.
Abstract
지역 interneurons는 지속적으로 1-3 성인 설치류의 후각 망울에서 생성됩니다. 이 과정에서 측면 뇌실의 벽에서 신경 줄기 세포는 후각 망울에 도달하고 통합할 수있는 주동이의 철새 스트림 (RMS)을 따라 몇 밀리미터에 대한 마이 그 레이션 neuroblasts을 일으키다, 성인 neurogenesis했다. 다른 단계와 후각 회로 전부터으로 성인에서 태어난 뉴런 통합의 영향을 연구하기 위해서는 선택적으로 라벨과 뉴런의 특정 인구의 활동을 조작하는 것이 필요합니다. optogenetic 기술의 최근 발전은 정확하게 주위의 뉴런은 4,5 영향을주지 않고 뉴런의 특정 일대를 활성화하기 위해 조명을 사용하는 기회를 제공합니다. 여기, 우리들은 후각 망울에 도달하기 전에 RMS의 neuroblasts의 temporally 제한 일대에서 virally 표현 Channelrhodopsin2 절차의 시리즈 (ChR2) YFP를 제시하고 NE 성인 탄생이 될urons. 또한, 우리는 ChR2 - 표현 뉴런의 생체내 자극에 만성위한 LED 미니 이식해서 보정하는 방법을 보여줍니다.
Protocol
1. Stereotaxic 주사
- 이러한 실험에 사용되는 바이러스는 Channelrhodopsine2 - YFP (노란색 형광 단백질)을 표현할 수있는 HIV 바이러스에 따라 복제 - 결함 lentiviral 벡터는 퓨전 synapsin업자 6 기반 구축. 플라스미드는 넉넉한 K. Deisseroth의 연구 그룹 (에서 제공한 http://www.stanford.edu/group/dlab/optogenetics/index.html ). Lentiviruses 설립 프로토콜 7에 따라 실험실에서 상용 소스에서 얻은 또는 생산 수 있습니다. 평균 벡터 titers은 10 10 도입 단위 / ML의 순서에 있었다. 바이러스성 aliquots는 -80 ° C에서 저장하고 피펫로드하기 전에 해동해야합니다. 복수 동결 / 해동 사이클은 피해야한다. 직접 드라이 아이스에 결코 노출 바이러스 솔루션입니다.
- 표준 피펫 풀러 (셔터 P에 borosilicate 유리 모세관을 사용하여 유리 pipettes 준비-97 피펫 풀러). 당기 설정이 제대로 길고 까다로운 피펫을 양보하도록 조정해야합니다. 다음, 직경 30-40 μm의의 팁을 얻기 위해 가위를 사용하여 피펫의 끝을 잘라. 저장소가 먼지 무료 상자에 pipettes를 추출.
- 50 NL의 제공을위한 제조 업체의 지침 Nanoject II microinjector를 설치합니다. 미네랄 오일과 함께 백업 작성하여 사출 피펫을 준비하고 microinjector 플런저에 그것을 넣습니다. stereotaxic 프레임에 microinjector을 첨부합니다. 바이러스 솔루션을 작성하기 전에 유리 피펫에서 부분적으로 비어있는 기름
- micropipette으로 Parafilm의 살균 조각에 바이러스 솔루션 2 μl를 전송합니다. 부드럽게 바이러스 솔루션의 드롭에 유리 피펫을 절감하고 1-2 μl로 피펫을 채울. 피펫에 기포가 없는지 확인합니다.
- 100 MG / kg 케타민을 및 무균 식염수에 희석 10 밀리그램 / kg Xylazine와 마우스를 마취. 의 두피에서 머리카락을 제거쥐 면도기, 면도날, 가위, 또는 화학 depilitory 에이전트를 사용하여 동물. 70 % 에탄올과 betadine을 교대 세 응용 프로그램과 두피를 소독. 모든 수술 악기도 autoclaved하고 다음 70 % 에탄올로 소독한다. 머리가 안전하다는 확보, 귀 바 코 표시줄 stereotaxic 프레임에있는 동물을 놓습니다. 각막의 건조 방지하기 위해 눈 연고를 적용합니다.
- 메스와 눈 사이에서 귀 사이에 두피를 잘라. 두개골을 노출하고 클램프 한 쌍의로 피부를 앵커에 따로 피부를 당겨. 두개골의 표면을 청소합니다. stereotaxic 장치는 bregma에 유리 피펫의 끝에와 제로입니다. 다음 팁은 사출 사이트 (; 메디오 - 측면 모두 오른쪽과 왼쪽 반구에 대한 ± 0.82, 각각 Antero - 후부, 3.30)에 배치됩니다. 코 표시줄의 위치는 stereotaxic 좌표의 계산에 따라 조정되어야합니다. 우리의 실험에서, 코 표시줄이 U를 조정됩니다한패 bregma 및 사출 사이트는 동일한 높이로 정렬됩니다.
- 사출 사이트를 식별합니다. 고속 수술 드릴을 사용하여 조심스럽게 두개골에 구멍을 드릴. 끝에서 만났 구부러진 주사기 바늘로, 경질의 mater을 폭로 얇은 뼈의 잔존물을 제거합니다. 구멍이 올바른 위치에 중심 있는지 확인합니다. 시추하는 동안 두뇌의 표면에 파열에 혈관 않도록 조심해. 혈관이 파열하는 경우에는 혈액의 흐름이 멈출 때까지, 부드럽게 몇 초 동안 작은 목화 꽃봉오리 또는 조직과 두뇌의 표면에 누르십시오.
- 피펫을 절감하고 피펫의 끝이 두뇌의 표면을 접촉 때 Dorso - 복부 높이를 제로. 그런 다음 올바른 Dorso - 복부 깊이 (뇌 표면에서 2.9, Dorso - 복부)에 낮은 및 압력 평형 30 초 정도 기다리십시오. 200 NL 총 바이러스 4 회 50 NL 주사. 각 분사 사이에 30 초 정도 기다립니다.
- 마지막 주사 후, 천천히 파이프를 철회 한 분TTE. 반복 다른 반구에 대한 1.6-1.8을 가리 킵니다. , stereotaxic 장치에서 동물을 제거 절개와 봉합 수술 스레드를 사용하여 자른 피부를 청소하십시오. 동물이 케이지로 돌아오기 전에 온난 패드에 복구할 수 있습니다. 또한, 동물은 즉시 비 steroidal 항염증성 진통제 (예 : Carprofen 4mg/kg)을 부여하고 3 일 수술을 다음 수 있습니다.
2. 후각 망울의 생체내의 optogenetic의 자극에 대한 만성 LED 주입
- lentiviral 입자로 주입 동물은 양자 다음 만성 소형 블루 LED (Osram, LED CMS 4.6W 청색)을 심어됩니다. 커넥터는 LED의 반대쪽에 위치되도록 여성 소형 전기 커넥터 솔더는 LED 핀. 어떤 전기 지름길이 없다는 것을 확인하고 커넥터에 대한 긍정과 부정 핀 식별합니다. 적절한 케이블하지만 LED를위한 전류 컨트롤러에 연결하여 LED를 테스트합니다.
- 측정 및 / 또는 LED의 절대 조명 전원을 설정하려면, 마운트 micromanipulator과 위치에 LED가 470 NM에서 최고 빛의 강도의 전원 측정기의 광검출기과 직접 접촉 하였다. 불투명한 PVC 보드에 3mm 직경의 핀홀을 드릴. 부착이 전원 미터에 핀홀 및 광학 전력 대 mm 2 당 전력을 계산하기 위해 전류 입력의 표준 곡선을 빌드합니다.
- 두뇌를 통해 빛의 전파를 측정하기 위해 300 신선한 뇌 조직의 블록, 500, 1000, 1500 및 0-4에서 2,500 μm의 두께 ° C ACSF가 vibratome 14를 사용하여 잘라. LED 아래에 사는 생쥐에서 수행한 것과 동일한 craniotomy과 두개골 조각을 넣으십시오. 첫째, LED 중심 조직없이 빛을 전력을 측정합니다. 그렇다면 LED와 전원 측정기의 광검출기 사이의 조직의 각 블록을 배치하고, 전원을 측정합니다. 비율로 계산 조직의 두께 비교 상대 전송 분율의 곡선을 작성조직을 통하여 조직 않고 측정 전원 사이.
- 100 MG / kg 케타민을 및 무균 식염수에 희석 10 밀리그램 / kg Xylazine와 마우스를 마취. 깨끗하고 70 % 에탄올로 LED를 소독. 동물의 두피에서 머리카락을 제거하고 70 % 에탄올과 betadine을 교대 세 응용 프로그램과 두피를 소독. 다음 stereotaxic 프레임에 동물을 배치. 각막의 건조 방지하기 위해 눈 연고를 적용합니다. stereotaxic 홀더에 커넥터를 연결합니다. 후각 망울 위에있는 두개골의 표면이 완벽하게 수평과 미니어처의 표면에 평행하게 LED 때까지 코 막대의 위치가 조정되어야합니다.
- 메스를 사용하면 귀가 사후 3mm로 눈 앞쪽에 3mm에서 두피를 잘라. 이외에도 피부를 당겨와 클램프의 한 쌍의로 앵커. 면도날을 사용하여 두개골의 표면에있는 세포막을 떨어져 다쳤어요. 청소와 두개골을 건조. 후속 광고를 허용하는 cyanoacrylate 접착제의 얇은 커버를 적용치과 아크릴의 hesion.
- 후각 전구를 통해, 고속 수술 드릴을 사용하여 사각형 craniotomy (5.1 mm 꼬리를 중심으로, bregma에서 측면 0mm 꼬리 1mm과 측면 3mm)을 수행합니다. 신중하게 얇은 두개골,이 작업을 수행하려면 뼈를만을 얇은 레이어는 유지까지. 조심스럽게 구부러진 주사 바늘의 도움으로 남은 뼈를 제거합니다. 특별한주의가 경질 물질을 펑쳐링 두 반구 사이 후각 구근의 꼬리 국경에서 거짓말의 주요 혈관을 rupturing 않도록 주의해야한다. 뇌 표면에 혈액 축적과 응고 조직에 최적의 조명 침투하는 걸로. craniotomy 및 멸균 식염수에 두뇌의 표면을 씻어 다음 두개골을 건조.
- 커넥터 LED 모형을 연결합니다. 후각 전구의 상단에있는 LED 모형을 낮춥니다. 미니어처 LED의 주요 축은, 살균 염분 및 D와 클린 마우스의 주동이의 - 꼬리 축에 평행해야스피 두개골. 그런 다음 보안 치과 아크릴의 두 번째 레이어에 이어 아크릴의 첫 번째 계층 (즉, polycarboxylate 시멘트)와 두개골되었다. 이 작은 나사의 추가는 LED를 수정해야 할 수 있습니다. 나사는 두개골에 삽입 (LED 위치 후부)와 두 acrylics으로 덮여 있어야합니다. 아크릴 여전히 액체이지만, 치과 아크릴의 표면에있는 두피의 자유 모서리를 뒤로 당겨 및 접착제. 커넥터에 대한 아크릴을 적용 안됩니다. 아크릴이 강화된 후 stereotaxic 장치에서 동물을 제거하고 케이지로 돌아오기 전에 그것이 온난 패드를 복구하자. 동물은 적어도 7 일 동안 수술에서 회복하기 위해 자신의 새장에 격리 남아 있습니다. 또한, 동물은 즉시 비 steroidal 항염증성 진통제 (예 : Carprofen 4mg/kg)을 부여하고 3 일 수술을 다음 수 있습니다. LED가 실험 주입 전 및 종료 후 테스트해야합니다.
- 가벼운 electri칼 케이블은 LED의 타이밍과 강도를 제어하는 펄스 발생기 (석사 - 8)에 결합하여 LED를위한 전류 컨트롤러에 밧줄 동물을하는 데 사용됩니다. 얇은 케이블은 운동의 완전한 자유를 허용합니다. 커넥터의 극성을 존중 조심해. 반전 극성은 LED을 깰 수 있습니다.
3. 대표 결과 :
ChR2 - YFP은 약 48 시간이 주사 후 신경을 transduced로 표현하고, 몇 개월 7 안정 유지됩니다. 그림 1은 15 일 이후 사출 paraformaldehyde - 고정 동물의 화살 섹션의 대표 사진입니다. 밀도 라벨 및 RMS에 주입 사이트의 크기를합니다. 신생아의 세포 다수의 후각 망울 (그림 1)의 서로 다른 레이어를 식민지로 RMS 따라 마이 그 레이션했습니다. 융합 단백질은 소마, dendrites, 그리고 쪽이 포함한 모든 신경 세포의 구획에 표시됩니다.
미니어처 LED impla ntation 큰 규모와 관심의 광범위한 지역의 저렴한 광학 자극 수 있습니다. 동물은 운동의 완전한 자유를 허용하는 가벼운 전기 케이블로 LED 컨트롤러에 곁에 있습니다. 두뇌 조직 및 ChR2 활성화의 문턱에서 빛을 확산을 특성화하여, 우리는 그 광학 활성이 LED의 표면 아래에 ~ 2mm (그림 2A)의 깊이에서 발생 될 수 예상하고있다. 의 기능 활성화를 모니터링하려면 ChR2은 - 표현 생체내에 신경을 C - fos,의 연결 활동의 마커의 표현은 반복적인 가벼운 자극 (그림 2B) 이후 분석하실 수 있습니다. 대안으로, 초점 가벼운 자극에 결합 ChR2 - 표현 뉴런의 체외 electrophysiological 녹음에 14을 수행할 수 있습니다. 마지막으로, 두 광자 대상 느슨한 - 패치 녹음은 생체내 9 LED 유사한 모형에 의한 ChR2 - 표현 대뇌 피질의 뉴런의 기능 활성화를 연구하는 데 사용되었습니다.
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그림 1. 십오일 주동이의 RMS에 lentivirus의 주사 후 마우스의 후각 망울의 saggital 섹션 ChR2 - YFP 주동이의 철새 스트림에 lentiviral 주사의 표현. 대표 공촛점 이미지. RMS의 마지막에서 OB의 다른 레이어로 마이 그 레이션 흩어져 YFP 신생아 뉴런의 존재를합니다. 신생아 세포 (95 %)의 대부분은 과립 세포 레이어 (GCL)와 dendrites에서 소마의 거짓말은 외부 Plexiform 층 (EPL)에서 arborize 과립 세포입니다. 신생아 뉴런의 작은 인구 사구체 층에있는 OB의 가장 표면 계층 (GL)까지 마이 그 레이션. 스케일 바, 100μm. dendrites에서뿐만 아니라 쪽이에서 ChR2 - YFP의 멤브레인 표현을 보여주는 신생아 과립 세포의 삽입, 높은 배율. 스케일 바, 20μm.
그림 2. 다이어그램의 새로운 과립 세포를 표현 ChR2 - YFP의 후각 망울 가벼운 - evoked C - fos 표현의 상단에 LED 심어.
이식 후각 전구 위의 LED의, 도식 그림.
B, 보여주는 대표 공촛점 이미지를 두 번 표시 ChR2 - YFP + C - fos 일시간 후각 망울의 빛 자극 후 + 과립 세포. C - fos 표현은 토끼 반 C - fos 차 항체 (Calbiochem, 1:5000)와 A568 - 복합 백신 토끼 항체를 보조 (Invitrogen, 1:1000)를 사용하여 드러났습니다. 스케일 바, 10μm.
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Discussion
Optogenetic 도구는 최근 후각 시스템에서 성인 태어난 뉴런의 연결을 포함하는 선택적 인구, 이상 우리의 통제를 증가하고있다. 여기 성인 태어난 뉴런의 특정 인구 ChR2 - YFP을 표현하는 lentiviral 벡터의 stereotaxic 주사를 수행하는 방법에 대해 설명합니다. 조심스럽게 기간 후 주사를 모니터링함으로써, 우리는 상대적으로 균일한 나이가 성인에서 태어난 뉴런의 일대의 활동을 분석하고 조작하실 수 있습니다.
때문에 그들의 낮은 확산 보급, 높은 전달 효율과 RMS의 neuroblasts을 위해 상대적으로 좋은 tropism의 lentiviral 벡터는 같은 retroviruses 또는 adeno - 관련 바이러스 (AAV)와 같은 다른 바이러스 벡터에 비해 선호되어야합니다. 그들이 선택적으로 같은 줄기 세포 또는 progenitors로 나누어 세포를 감염하기 때문에, 레트로 바이러스 벡터는 subventricular 영역에 주입 및 신생아 뉴런의 작은 인구를 transduce해야합니다. lentiviral V에 비해ectors는 AAV 벡터는 감염 훨씬 높은 분산을 제공합니다. 그러나, RMS의 neuroblasts의 AAV의 도입 때문에 같은 액세서리 후각 핵, 프로젝트는 후각 망울로 다시 axons있는 지역으로 주변 구조의 도입을 피해야한다. 마지막으로, 이러한 ChR2 표현이 바이러스성 벡터를 통해 뉴런의 특정 인구 또는 유전자 변형 마우스 라인 10을 통해 구동되는 피질 영역으로 두뇌의 다른 표면 구조에 적용할 수있는 이식 LED가 중 하나를 사용하십시오.
LED 이식을 통해, 우리는 깨어있는 행동 동물의 후각 망울의 성인 neurogenesis의 기능 역할을 연구 만성 광학 자극을 적용할 수 있습니다. 이 간단한 광원은 ON / LED가 속도에서 본질적으로 급속한에 빛을 감사의 빠른 시간적 제어를 제공합니다. 저렴하고 이외에 소형 LED 광원은 두뇌의 큰 볼륨에서 ChR2 활성화를위한 충분한 전력 (~ 100mW)를 생산티슈 11도 좌우 대칭으로 후각 전구의 경우 인치 이것은 중요한 병변은 후각 상피의 12 입력의 중복 높은 수준의로 인해 악취 품질 인식에 영향없이 수 있습니다이 두뇌 지역에서 특히 중요합니다. 의 전력 스펙트럼과 대역폭 (25nm) 덕분에, 이러한 초소형 LED가 ChR2뿐만 아니라 ChETA 또는 캐치 channelrhodopsins의 다른 버전을 사용하여 가벼운 evoked 여기에 사용할 수 있습니다. 미니 노란색 (597nm)과 빨간색 (624 혹은 637nm) LED가 같은 halorhodopsin 및 VChR1 13와 같은 빨간 이동 rhodopsins 사용할 수 있습니다.
미니어처의 LED는 또한 한계를 보여줍니다. 머리를 가열 방지하기 위해, 타협은 펄스 지속 시간, 펄스 주파수, 가벼운 강도 사이에서 찾을 수 있어야합니다. 예를 들어, 5 밀리초의 짧은 광 펄스는 높은 주파수 (> 20Hz)과 100 MW의 빛의 강도에 좋습니다. 이 기간보다도, signific주변 조직의 온도 (~ 1-4 ° C)의 개미 상승을 측정할 수 있습니다. 이 매개 변수는 특히 halorhodopsin를 사용하여 가벼운 evoked hyperpolarization의 경우, 더 이상 빛을 펄스 (> 5ms) 또는 지속적인 가벼운 자극에 대한 고려되어야합니다. 또한, LED를 공급 전류는 LED가 조직과 직접 접촉되었을 때 생체내 electrophysiological 녹음에서 배제 수도 있습니다 강한 전기 유물을 제공합니다. 광학 섬유는 더 작고 제한된 광학 자극을 허용, 가능한 대안을 구성하는 레이저 - 결합. 그러나, 광학 섬유의 강성는 특정 행동을 방해할 수 있습니다.
빛의 침투와 빛의 의한 뉴런의 기능 자극의 특성화 후, 생체내 광학 자극의 행동 실험과 연계하여 실행하실 수 있습니다. 특별한주의는 자극의 타이밍에 관한 주의해야한다. photostimu의 동기화특히 operant 에어컨 동안 행동 기기의 특정 행동이나 작업,와 lation는 세포 활성화와 행동 사이의 인과 관계 링크를 설립 결정 수 있습니다.
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Disclosures
관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.
Acknowledgments
이 작품은의 "ERA - NET 뉴런 '의 프레임에있는 생명 보험 회사"Novalis - Taitbout "가르슈 DES Neurosciences 드 파리 (ENP), 회사 직원 Nationale 드 라 공들인"ANR - 09 - NEUR - 004 "에 의해 지원되었다 유럽위원회에 의해 FP7 프로그램, "재단 부어 라 공들인 Medicale"Letten 재단과 파스퇴르 재단.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ketamine | Merial | Imalgène 1000 | |
| Xylazine | Bayer AG | Rompum 0.2% | |
| Pipette Puller | Sutter Instrument Co. | P-97 | |
| Glass Capillaries (3.5") | Drummond Scientific | 3-000-203-G/X | |
| Nanoject II Microinjector | Drummond Scientific | 3-000-204 | |
| High speed surgical drill | Fine Science Tools | 18000-17 | |
| Micro Drill Steel Burrs 0.7mm tip diameter | Fine Science Tools | 19008-07 | |
| LED CMS blue 4.6 W | OSRAM | LBW5SN | |
| Female electrical connector (2.54 mm) | Fisher Scientific | BL5.36Z | |
| Current controller for LED (max: 1A) | A1W Electronik | HKO-KL50-1000 | |
| Pulse generator | AMPI | Master-8 | |
| Optical power meter | Thorlabs Inc. | PM100 | |
| Cyanoacrylate adhesive | Loctite | 454 | |
| Polycarboxylate cement (first layer cement) | Septodont | Selfast (#0068Q) | |
| Methacrylate cement (second layer cement) | GC International | Unifast Trad – Liquid (#339292) Unifast Trad – Powder (#339114) | |
| Carprofen | Pfizer Pharma GmbH | Rimadyl |
References
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