Summary
Взрослый происхождения нейроны обонятельной луковицы можно управлять с помощью optogenetically Channelrhodopsin2 экспрессией лентивирусов инъекций в ростральной миграционных потоков и хронических фотостимуляции с имплантированным миниатюрный светодиод.
Abstract
Местное интернейронов постоянно регенерируются в обонятельной луковице взрослого грызунов 1-3. В ходе этого процесса, называемого взрослого нейрогенеза, нервные стволовые клетки в стенках бокового желудочка приводит к нейробластов, которые мигрируют на несколько миллиметров по ростральной миграционных потоков (RMS), чтобы достичь и включить в обонятельной луковице. Для изучения различных этапов и влияния взрослых родился нейронов интеграция в существующий обонятельных схем, необходимо выборочно этикетки и манипулировать деятельности этой специфической популяции нейронов. Недавнее развитие optogenetic технологий дает возможность использовать свет, чтобы активировать именно этой конкретной когорты нейронов, не затрагивая окружающих нейронов 4,5. Здесь, мы представляем ряд процедур, чтобы выразить вирусно Channelrhodopsin2 (ChR2)-в YFP временно запрещен когорте нейробластов в RMS, не дожив до обонятельной луковицы и стать взрослым родился пеurons. Кроме того, мы покажем, как имплантат и калибровки миниатюрный светодиод в естественных условиях хронической стимуляции ChR2-экспрессирующих нейронов.
Protocol
1. Стереотаксической инъекции
- Вирус, используемый в этих опытах репликации с дефицитом лентивирусов вектора на основе вируса ВИЧ, чтобы выразить Channelrhodopsine2-YFP (желтый флуоресцентный белок) слияние построить обусловлен промоутер synapsin 6. Плазмида была любезно предоставлена К. Дейссерот "с исследовательской группой ( http://www.stanford.edu/group/dlab/optogenetics/index.html ). Лентивирусов могут быть получены из коммерческих источников или произведенных в лаборатории в соответствии с установленными протоколами 7. Средний титр вектора были в порядке 10 10 трансдукции ед / мл. Вирусный аликвоты хранятся при температуре -80 ° С и должны быть талая непосредственно перед загрузкой пипетки. Несколько циклов замораживания / оттаивания следует избегать. Никогда воздействия вируса решение непосредственно в сухой лед.
- Подготовка стеклянной пипетки использованием боросиликатного стекла капилляров на стандартной пипетки съемник (Sutter P-97 Пипетки съемник). Потянув параметр должен быть правильно откалиброван для получения длинных и жестких пипетки. Затем вырезать кончиком пипетки с помощью пары ножниц для получения кончика 30-40 мкм в диаметре. Магазин потянул пипетки в пыли коробке.
- Установка Nanoject II microinjector с инструкциями изготовителя на поставку 50 NL. Подготовка инъекции пипетки спиной заполнения с минеральным маслом и вставить его к microinjector поршень. Прикрепить microinjector на стереотаксической рамы. Частично пустой нефти из стеклянной пипетки перед заполнением вирус решение
- С микропипетки, передачу 2 мкл вируса раствор на стерильной кусок парафильмом. Осторожно опустите стеклянную пипетку в капле вирус решение и заполнить пипетку с 1-2 мкл. Убедитесь в том, что Есть нет пузырьков воздуха в пипетку.
- Анестезию мыши с 100 мг / кг кетамина и 10 мг / кг Ксилазин, разводят в стерильном физиологическом растворе. Удалить волосы от скальпживотных использованием грызунов ножницы, бритвы, ножницы, или химического агента depilitory. Лечить кожи головы с тремя приложениями переменного 70% этанола и бетадин. Все хирургические инструменты должны быть автоклаве, а затем дезинфицируют 70% этанола. Место животных в стереотаксической раме с ухом баров и нос бар, заверив, что голова является безопасным. Применение глазной мази, чтобы предотвратить высыхание роговицы.
- С помощью скальпеля, разрезать кожу головы от между глазами между ушей. Потяните кожу в сторону, чтобы подвергать черепа и якорь кожи с парой зажимов. Очистите поверхность черепа. Стереотаксического аппарата обнуляется с кончик стеклянной пипетки на темя. Затем конец находится в месте инъекции (передне-заднем, 3.30; Медио-Боковой, ± 0,82, как для правого и левого полушарий, соответственно). Положение носа бар должен быть скорректирован в зависимости от расчета стереотаксической координат. В нашем эксперименте нос бар регулируется Until брегмы и месте инъекции выровнены по той же высоте.
- Определите место инъекции. Использование высокоскоростных хирургической дрель, просверлить отверстия в черепе. С изогнутой иглой шприца крючковатый на конце, удалить остатки тонкие кости, чтобы разоблачить твердой мозговой оболочки. Убедитесь, что отверстие с центром в правильном положении. Будьте осторожны, не применяется к судам разрыв крови на поверхности мозга в процессе бурения. Если кровеносные сосуды разрываются, слегка нажмите на поверхность мозга с небольшой бутон хлопка или ткани в течение нескольких секунд, пока поток крови прекращается.
- Нижняя пипетки и нулевой дорзо-вентральные высоты, когда кончик пипетки коснется поверхности мозга. Затем, ниже на правильный дорзо-вентральные глубина (дорзо-вентральные, 2,9 от поверхности мозга) и подождите 30 секунд, равновесное давление. Inject 4 раза 50 п вируса в общей сложности 200 NL. Подождите 30 секунд между каждой инъекции.
- Через минуту после последней инъекции, медленно вывести трубуна один. Повторите точки 1.6-1.8 для другого полушария. Удалить животное от стереотаксического аппарата, чистый разрез и шов разреза кожи с использованием хирургических нитей. Разрешить животных для восстановления по утеплению площадку перед возвращением в клетку. Кроме того, животные могут быть даны нестероидные противовоспалительные обезболивающее (например, Carprofen 4mg/kg) сразу после и 3 дня после операции.
2. Хронический светодиодной имплантация в стимуляции optogenetic естественных условиях в обонятельной луковице
- Животных, которым вводили лентивирусов частиц двусторонней находятся рядом хронически имплантировали миниатюрную синий светодиод (Osram, светодиодные CMS 4.6W синий). Припой светодиодной булавки для женщин миниатюрного электрический разъем, так что разъем питания установлен на противоположной стороне от светодиода. Убедитесь, что нет электрической короткую стрижку и выявить положительные и отрицательные контактных разъема. Испытание светодиодные, подключив его к текущей контроллер для светодиодных хотя подходящий кабель.
- Для измерения и / или установить абсолютной власти света светодиода, крепление светодиода на микроманипулятор и положение светодиод в прямом контакте с фотоприемник измеритель мощности пика интенсивности света в 470 нм. Дрель отверстие диаметром 3 мм в непрозрачной из ПВХ. Прикрепите это отверстие, чтобы измеритель мощности и построить стандартную кривую оптической мощности от входного тока для расчета мощности на 2 мм.
- Для измерения распространения света через мозг, вырезать блоки свежей ткани мозга 300, 500, 1000, 1500 и 2500 мкм толщиной в 0-4 ° С ACSF использованием vibratome 14. Место кусок черепа с краниотомии идентична той, осуществляется в живых мышей под светодиод. Во-первых, измерить световой мощности без тканей сосредоточено на светодиод. Затем, место каждого блока ткани между светодиодом и фотоприемником из измерителя мощности, и измерять силы. Построить кривую толщина ткани по сравнению с относительной доли передачи, рассчитываемый как отношениемежду властью измеряется с помощью ткани и без ткани.
- Анестезию мыши с 100 мг / кг кетамина и 10 мг / кг Ксилазин, разводят в стерильном физиологическом растворе. Вымыть и продезинфицировать светодиод с 70% этанола. Удалить волосы с головы животного и дезинфицировать кожу головы с тремя приложениями переменного 70% этанола и бетадин. Затем поместите животное в стереотаксической раме. Применение глазной мази, чтобы предотвратить высыхание роговицы. Присоединить разъем для стереотаксической держателя. Положение носа бара должна быть скорректирована до поверхности черепа над обонятельной луковице идеально горизонтальным и параллельным поверхности миниатюрный светодиод.
- С помощью скальпеля, разрезать кожу головы от 3 мм кпереди от глаз до 3 мм сзади ушей. Потяните кожу в сторону, и якорь его с парой зажимами. Очистите от мембраны на поверхности черепа использованием лезвия бритвы. Чистый и сухой череп. Нанесите тонкий обложке цианакрилатного клея для осуществления последующих этапов объявлениеадгезии зубного акрила.
- Использование высокоскоростных хирургической дрели, выполняют прямоугольной трепанации черепа (1 мм хвостовой и 3 мм бокового; сосредоточены на 5,1 мм хвостового, 0 мм от боковых брегмы) над обонятельной луковицы. Для этого тщательно тонкий череп, пока только тонким слоем костных останков. Осторожно удалите оставшиеся кости с помощью изогнутых иглы шприца. Особое внимание должны быть приняты, чтобы избежать проколов оболочки и вещество разрывом крупных кровеносных сосудов, которые лежат между двумя полушариями, а в хвостовой граница обонятельной луковицы. Накопление крови и коагуляции на поверхности мозга исключает оптимального проникновения света в ткани. Промыть краниотомии и поверхностью мозга стерильным физиологическим раствором, а затем сухой череп.
- Прикрепить миниатюрный светодиод разъема. Нижняя миниатюрный светодиод на верхней части обонятельных луковиц. Главной оси миниатюрный светодиодный должны быть параллельны ростральной-каудальной оси мыши, чистый стерильным физиологическим раствором и гры черепа. Затем зафиксируйте светодиод черепа с первым слоем акрила (т.е. поликарбоксилатные цемента), а затем второй слой зубной акрила. Помимо двух небольших винтов может потребоваться исправить светодиод. Винты должны быть вставлены на черепе (сзади светодиодные положением) и покрыты как акрил. В то время как акриловые все еще жидкость, отступить и клей свободные края волосистой части головы на поверхности зубной акрила. Будьте осторожны, не применять любые акриловые на разъеме. После акриловые затвердеет, удалить животное из стереотаксического аппарата и дайте ему восстановиться на потепление площадку перед возвращением в клетку. Животные остаются изолированными в их клетке, чтобы оправиться от операции, по крайней мере за семь дней. Кроме того, животные могут быть даны нестероидные противовоспалительные обезболивающее (например, Carprofen 4mg/kg) сразу после и 3 дня после операции. Светодиоды должны быть проверены перед имплантацией и после прекращения экспериментов.
- Электрический светкал кабель используется для троса животное текущий контроллер для светодиодных соединен с генератором импульсов (мастер-8), чтобы контролировать время и интенсивность светодиодов. Тонкий кабель обеспечивает полную свободу передвижения. Позаботьтесь уважать полярность разъема. Инверсия полярности может привести к поломке светодиода.
3. Представитель Результаты:
ChR2-YFP выражается в трансдуцированных нейронов примерно 48 часов после инъекции, и остается стабильным в течение нескольких месяцев 7. На рисунке 1 репрезентативную картину сагиттальной разделе параформальдегид фиксированной животных через 15 дней после инъекции. Обратите внимание на маркировку и плотные размер инъекции в RMS. Большое количество новорожденных клетки мигрировали вдоль RMS для колонизации различных слоях обонятельной луковицы (рис. 1). Гибридный белок экспрессируется во всех отсеках нейрон, в том числе сома, дендритов и шипами.
Миниатюрный светодиодный impla ntation позволяет крупном масштабе и недорогие оптические стимулирование широкой областью интересов. Животное привязанным к светодиодный контроллер свет электрический кабель, который позволяет полную свободу передвижения. По характеризующие рассеивание света в ткани головного мозга и порог ChR2 активации, по нашим оценкам, оптической активации может быть вызван на глубине около 2 мм ниже поверхности светодиода (рис. 2). Для контроля за функциональным активации ChR2 экспрессирующих нейронов в живом организме, выражения с-FOS, маркером активности нейронов, могут быть проанализированы после повторяющихся световой стимуляции (рис. 2В). В качестве альтернативы, в пробирке электрофизиологических записей ChR2-экспрессирующих нейронов связаны с координационным световой стимуляции могут быть выполнены 14. Наконец, двухфотонного целевых свободную патч записи были использованы для изучения функциональной активации ChR2-экспрессирующих нейронов коры аналогичными миниатюрный светодиод в естественных условиях 9.
ntent ">
Рисунок 1. ChR2-YFP выражение из лентивирусов инъекции в ростральной миграционных потоков. Представителю конфокальной изображения сагиттальной участки обонятельной луковицы мыши через 15 дней после инъекции лентивирус в ростральной RMS. Обратите внимание на наличие рассеянного YFP новорожденного нейроны мигрируют из конца RMS для разных слоев OB. Большинство новорожденных клеток (95%) зернистых клеток, которые сомы лежат в слое гранул Cell (ГКЛ) и дендритов ветвиться во внешнем слое Plexiform (EPL). Небольшая популяция новорожденного нейроны мигрировать до самого поверхностного слоя Б., в клубочковой слоя (GL). Шкала бар, 100 мкм. Врезка, высокая увеличение новорожденных ячейки гранул, показывая мембраны выражение ChR2-YFP в дендритов, а также в колючки. Шкала бар, 20 мкм.
Рисунок 2. Схема имплантированных светодиод на верхней части обонятельной луковице и легких вызывал С-FOS выражение в ChR2-YFP выражения нового ЗК.
, Схематическое изображение имплантирован индикатор над обонятельной луковицы.
B, представитель конфокальной изображения, показывающие двойное меченных ChR2-YFP + С-FOS + ЗК через час после света для стимуляции обонятельной луковице. C-FOS выражение выявили, кролика анти-с-FOS первичного антитела (Calbiochem, 1:5000) и A568-сопряженных анти-заяц вторичными антителами (Invitrogen, 1:1000). Шкала бар, 10 мкм.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Optogenetic инструментов в последнее время увеличили контроль над селективные нейронных популяций, в том числе взрослых родился нейроны обонятельной системы. Здесь мы опишем, как выполнять стереотаксической инъекции лентивирусов вектор выражения ChR2-YFP в конкретной популяции взрослых родился нейронов. Тщательный мониторинг период после инъекции, мы имеем возможность анализировать и управлять деятельностью когорте взрослых родился нейронов с относительной однородной возраста.
Из-за их низкого распространения диффузии, их высокую эффективность трансдукции и их относительного добра тропизм к нейробластов из RMS, лентивирусов векторы должны быть предпочтительны по сравнению с другими вирусными векторами, такие как ретровирусов или адено-ассоциированные вирусы (ААВ). Потому что они выборочно инфицировать делящиеся клетки, например, стволовые клетки или прародителей, ретровирус векторы должны быть введены в субвентрикулярной зоны и преобразовывать меньшую численность населения новорожденных нейронов. По сравнению с лентивирусов Vectors, AAV векторов обеспечивают гораздо выше, распространение инфекции. Тем не менее, AAV трансдукции нейробластов в RMS следует избегать из-за трансдукции окружающих структур, таких как аксессуар обонятельные ядра, региона, что проекты, аксоны обратно в обонятельной луковице. И наконец, использование имплантировали светодиоды могут быть применены в других поверхностных структур головного мозга, таких как зоны коры головного мозга, в котором ChR2 выражения приводится в конкретных популяций нейронов посредством вирусных векторов или с помощью трансгенной линии мышей 10.
С помощью светодиодной имплантации, мы можем применить хронических оптической стимуляции для изучения функциональной роли обонятельных нервных клеток взрослого лампочка у бодрствующих животных поведение. Этот простой источник света обеспечивает быстрый временной управления светом благодаря внутренне быстрого включения / выключения скорости светодиодов. Помимо того, что недорогой, миниатюрный светодиодный источник света дает достаточную мощность (~ 100 мВт) для ChR2 активации в большой объем мозгаткани 11, даже на двусторонней основе в случае обонятельных луковиц. Это особенно важно в этой области мозга, где значительные повреждения могут быть без влияния на качество восприятия запаха в связи с высокой степенью избыточности вклад обонятельного эпителия 12. Благодаря своей мощности и его спектральной полосы пропускания (25nm), эти миниатюрные светодиоды могут быть использованы для легких вызвало возбуждение использованием ChR2, а также другие версии, такие как channelrhodopsins Чета или поймать. Миниатюрные желтого (597nm) и красный (624 или 637nm) светодиоды доступны для использования в красное смещение rhodopsins таких как halorhodopsin и VChR1 13.
Миниатюрные светодиоды показывают также ограничения. Для того чтобы избежать нагрева мозга, компромисс должен быть найден между длительностью импульса, частота пульса и интенсивность света. Например, короткие световые импульсы из 5 миллисекунд, рекомендуется на высоких частотах (> 20 Гц) и интенсивности света в 100 мВт. Над этой длительности, significМуравей повышением температуры (~ 1-4 ° С) в окружающие ткани могут быть измерены. Этот параметр должен быть приняты во внимание для более длинных световых импульсов (> 5 мс) или непрерывной стимуляции светом, особенно в случае легких, вызванных использованием halorhodopsin гиперполяризации. Кроме того, текущие поставки светодиод обеспечивает сильный электрический артефакт, который может препятствовать в естественных условиях электрофизиологической записи, когда индикатор находится в прямом контакте с тканью. Лазерная связь оптических волокон представляют собой возможную альтернативу, позволяя меньше и более ограниченным оптической стимуляции. Тем не менее, жесткость оптических волокон могут помешать определенным поведением.
После характеристики проникновения света и функциональной стимуляции нейронов на свет, в естественных условиях оптической стимуляции могут быть вызваны в сочетании с поведенческими экспериментами. Особое внимание должно быть принято в отношении сроков стимуляции. Синхронизация photostimulation с особенностями поведения или задачи в поведенческих аппарата, особенно во время оперантного обусловливания, могут иметь решающее значение для установления причинно-следственной связи между активацией клеток и поведения.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Нет конфликта интересов объявлены.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана компания по страхованию жизни "Новалис-Тетбу", Школе нейронаук Парижской (ЕПС), Национальное агентство по La Recherche "ANR-09-NEUR-004" в рамках "ERA-NET нейрона" из FP7 программы Европейской комиссии ", Фонд залить La Recherche Medicale", Letten фонда и Фонда Пастера.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ketamine | Merial | Imalgène 1000 | |
| Xylazine | Bayer AG | Rompum 0.2% | |
| Pipette Puller | Sutter Instrument Co. | P-97 | |
| Glass Capillaries (3.5") | Drummond Scientific | 3-000-203-G/X | |
| Nanoject II Microinjector | Drummond Scientific | 3-000-204 | |
| High speed surgical drill | Fine Science Tools | 18000-17 | |
| Micro Drill Steel Burrs 0.7mm tip diameter | Fine Science Tools | 19008-07 | |
| LED CMS blue 4.6 W | OSRAM | LBW5SN | |
| Female electrical connector (2.54 mm) | Fisher Scientific | BL5.36Z | |
| Current controller for LED (max: 1A) | A1W Electronik | HKO-KL50-1000 | |
| Pulse generator | AMPI | Master-8 | |
| Optical power meter | Thorlabs Inc. | PM100 | |
| Cyanoacrylate adhesive | Loctite | 454 | |
| Polycarboxylate cement (first layer cement) | Septodont | Selfast (#0068Q) | |
| Methacrylate cement (second layer cement) | GC International | Unifast Trad – Liquid (#339292) Unifast Trad – Powder (#339114) | |
| Carprofen | Pfizer Pharma GmbH | Rimadyl |
References
- Lledo, P. M. Adult neurogenesis and functional plasticity in neuronal circuits. Nat. Rev. Neurosci. 7, 179-193 (2006).
- Alonso, M. Turning astrocytes from the rostral migratory stream into neurons: a role for the olfactory sensory organ. J. Neurosci. 28, 11089-11102 (2008).
- Mouret, A. Learning and survival of newly generated neurons: when time matters. J. Neurosci. 28, 11511-11516 (2008).
- Bardy, C. How, when, and where new inhibitory neurons release neurotransmitters in the adult olfactory bulb. J. Neurosci. 30, 17023-17034 (2010).
- Haubensak, W. Genetic dissection of an amygdala microcircuit that gates conditioned fear. Nature. 468, 270-276 (2010).
- Zhang, F. Multimodal fast optical interrogation of neural circuitry. Nature. 446, 633-639 (2007).
- Wang, X., McManus, M. Lentivirus Production. J. Vis. Exp. (32), e1499-e1499 (2009).
- Cardin, J. A. Targeted optogenetic stimulation and recording of neurons in vivo using cell-type-specific expression of Channelrhodopsin-2. Nature protocols. 5, 247-254 (2010).
- Huber, D. Sparse optical microstimulation in barrel cortex drives learned behaviour in freely moving mice. Nature. 451, 61-64 (2010).
- Arenkiel, B. R. In vivo light-induced activation of neural circuitry in transgenic mice expressing channelrhodopsin-2. Neuron. 54, 205-218 Forthcoming.
- Albeanu, D. F. LED arrays as cost effective and efficient light sources for widefield microscopy. PLoS ONE. 3, 2146-2146 (2008).
- Slotnick, B., Bodyak, N. Odor Discrimination and Odor Quality Perception in Rats with Disruption of Connections between the Olfactory Epithelium and Olfactory Bulbs. J. Neurosci. 22, 4205-4216 (2002).
- Gradinaru, V. Molecular and cellular approaches for diversifying and extending optogenetics. Cell. 141, 154-165 (2010).
- Valley, M., Wagner, S., Gallarda, B. W., Lledo, P. Using Affordable LED Arrays for Photo-Stimulation of Neurons. J. Vis. Exp. (57), e3379-e3379 (2011).
