颅面间质细胞的电

Summary

颅面软骨发展与其他组织的密切联系和难以操作，在活的动物。我们使用的是电击期间提供的颅面骨骼生长的分子工具，而绕过早期胚胎的影响。这种方法将使我们能够有效地测试候选分子

Abstract

电穿孔是一种有效的方法，在精确的时间点的组织和确切地点提供DNA和其他带电的大分子。例如，电已经取得了巨大成功用于研究在爪蟾神经和视网膜发育，鸡和鼠标^1-10。然而，重要的是要注意，在所有这些研究中，研究者针对软组织。因为我们是在颅面发育有兴趣，我们适应目标面部间质的方法。

当我们进行文献检索，我们发现，给我们带来惊喜，很少有成功的基因转移到软骨组织的报告。这些研究大部分基因治疗研究，如siRNA或蛋白质传递到软骨细胞株，或关节炎的动物^模型 11-13 。在其他系统，如鸡或鼠标，电击面部间质已具有挑战性（个人COMMUNICAT离子，颅面发育，KCL部）。我们推测，到爪蟾 procartilaginous和软骨组织的电击可能更好地工作。 ，我们在我们的研究表明，有效的基因转移到面部软骨发生在早期阶段（28），面部原基仍是软组织组成，前软骨分化。

爪蟾是一个十分便利的分析颅面部发育的脊椎动物系统。颅面结构可见，在爪蟾更容易比其他任何脊椎动物模式，主要是因为非洲爪蟾胚胎受精的外部，允许的最早阶段的分析，并促进在单细胞分辨率的实时成像， ^以及重用的母亲14。 爪蟾在外部发展的脊椎动物模型，是更多有用的颅面分析比斑马鱼，爪蟾幼虫都较大，更容易DIssect，和面部区域的发展是更容易获得比在鱼相当于地区成像。此外， 非洲爪蟾是对人类进化上更接近比斑马鱼（〜100万年前接近^）15。最后，在这些阶段， 爪蟾蝌蚪是透明的，并发表达荧光蛋白或分子将允许开发软骨容易可视化。我们预计，这种做法将让我们能够迅速，高效地测试候选分子在体内模型系统。

Protocol

1A部分。设备

显微镜：直立的立体解剖与低功耗的目标范围

• 电压/脉冲发生器：BTX ECM 830方波电穿孔系统
• 移液器拉马：P - 87微管拖轮（萨特仪器公司，CA）
• 机械手：筹备工作粗糙，或合并的粗，细。
• 微管持有人：精细的科学工具
• 电极：自制
• 自制电穿孔室：

“L”形的电极：

1. 切8厘米高纯度的0.4毫米的钨丝（古德费洛）和中点处贴上一个1ml注射器，使用腻子（我们使用的Blu - TACK）。离开4厘米钨丝，从暴露成“L”形的注射器和弯尖的一角，从一端1厘米（图1A）。
2. 修剪提示，以便最终措施，长0.5毫米。 T他的提示是电极总站。
3. 过剩的钨丝平行运行注射器，并用它来连接电极的脉冲发生器。
4. 重复过程中，一对电极。
5. 方波脉冲发生器通过直流电缆连接电极。

电穿孔室

1. 线的底部为90毫米〜5毫米的非有毒橡皮菜。
2. 填写电击媒体的菜。
3. 使用5号制表钳刻出一个T形好（图2）。长以及应测量1〜2毫米x 2毫米× 10毫米，短1〜2毫米x 2毫米x 5毫米。可水洗的电盘和重用。

第1B部分。试剂

DNA或收取大分子

• 微量移液器：1毫米宽4“长高硼硅玻璃毛细管（WPI的，TW100 - F）
• 文化传媒：正常两栖类媒体（不结盟运动）
• > 10倍的股票：1100毫米氯化钠，20毫米KCL，10毫米的_{Ca（NO 3）2•4H 2} O，1 mM EDTA的。
  • 在4 ° C的高压灭菌器和存储
  • 1 + X南：碳酸氢钠₃ 0.1毫米和0.2毫米娜₃ PO ₄的稀释10倍的股票，缓冲区。
• 非洲爪蟾蝌蚪阶段28

DNA的制备：

1. 准备表达质粒，使用标准协议。
2. 重悬DNA的一个终浓度为1μg/μL核酸自由H ₂ 0。

*我们有包含一个强大的CMV启动子的载体，如pCS2，成功+ [16]。谱系分析，我们通常包括在终浓度为0.1微克/μL的DNA编码绿色荧光蛋白（pCS2 GFP）的。 [0.1-3微克/μL的DNA浓度进行了测试。我们发现，浓度低于0.8μg/μL的低效标记的细胞，而DNA浓度大于2微克/＆MU;升不提高电穿孔效率]。

吗啉寡聚核苷酸的准备：

（注：。MOS需要fluoresceinated（3' -羧基改性）或以其他方式收取）

1. 悬浮吗啉代寡核苷酸（MOS）（Genetools， www.genetools.com ）核酸自由H ₂ 0浓度为2毫米。
2. 热原液分装在65 ° C 5分钟。
3. 稀释至终浓度为0.5毫米核酸自由水。

* 0.1 - 1mm的MO解决方案进行了测试。 0.5毫米MO解决方案足够的许多间质细胞的电穿孔。

微量移液器

1. 准备从高硼硅玻璃毛细管（宽1毫米，长4“，WPI的TW100 - F）。微量使用针拉马准备8-12毫米长的锥度和精尖的微量。
2. 粉碎提示〜2毫米从尖镊子，创造一个锯齿状的突破。

媒体

1. 孵化媒体：准备新鲜的3 / 4正常两栖类媒体（NAM）从1x股票。添加0.025毫克/毫升的庆大霉素。
2. 电穿孔媒体：如上所述，用0.1％苯佐卡因（Sigma公司，06950）。

2。电穿孔

微管安装

1. 填写微量〜1μL注射液。
2. 固定在显微操作的微管和微量（Picospritzer二）重视。
3. 从桌面上，在50 °的角度微量。
4. 设置注射压力20 PSI。
5. 校准微量注入脉冲NL 30％。

蝌蚪准备

1. 麻醉阶段28 爪蟾幼虫孵化5分钟电击媒体。
2. 转移到充满电穿孔媒体电击室麻醉蝌蚪。位置胚胎内长好，让头部背侧和腹侧外露的丁字路口的责任。尾巴相比，头部应该稍微升高。
3. 使用镊子，轻轻安全以及与周围橡皮蝌蚪。 （注：如果是没有担保的蝌蚪，它可能会抽搐和联系，在电穿孔电极，在这种情况下丢弃的蝌蚪面巾纸将严重受损。）

电穿孔

1. 插入微量提示后水泥腺和面部间质成。
2. 30 NL溶液注入到间质。
3. 缩回微量。
4. 快速对齐平行电极提示胚胎的头（图3）。
5. 适用于8月50毫秒，20mV的方波。
6. 缩回电极。
7. 使用镊子小心释放蝌蚪转移到3 / 4的不结盟运动，0.025毫克/毫升的庆大霉素。
8. 蝌蚪可以在不结盟运动，0.025毫克/毫升overn的3 / 4孵育的飞行，或更长的时间。
9. 24小时后，荧光显微镜高效电击屏幕胚胎。

3。代表性的成果：

允许使用荧光分子电穿孔胚胎容易甄别。图4显示了一个典型的一批MO电穿孔蝌蚪〜12，48和96小时后，电穿孔，孵育在14.5 ° C。用荧光显微镜，MOS可电击后立即可视化，坚持几天后电击。根据我们的经验，荧光弱明显的阶段，46（〜5天以后）。在软骨，荧光分化（42日）后开始急剧下降，但是，莫荧光仍然存在较为强烈的其他类型的细胞，如咽部内胚层。荧光显微镜显示，纳入到几个颅面组织，包括软骨寡核苷酸。寡核苷酸荧光彗星一个经常在组织上的头两侧可视化。这可能是由于整个宽松的颅面间质注射液，以电穿孔前迅速扩散。

图1自制的电极。 L形的钨丝，连接到一个1 ml注射器，采用无毒的粘土或腻子。 （一）电极总站措施5毫米。 （二）将一对电极，这样的总站并行运行。电极连接到脉冲发生器，直流电缆。

图2电穿孔室。 （一）90毫米菜用橡皮衬里填充与媒体和T形腔刻有没有5钟表匠的镊子。 （二）长期方面的措施2毫米x 2毫米X10毫米而2毫米x 2毫米x 5毫米的短期措施。胚胎的头枕在丁字路口，腹侧。

图3示意图说明电击过程。圣28蝌蚪是摆在电击室，腹一面向上。微管插入面部间质底层水泥腺。注入。微管被删除，L形电极平行侧翼头。应用8个50毫秒，20 mV的方波。缩回电极。蝌蚪生长所需的阶段。 Visualise MOS或GFP的表达，用荧光显微镜。

图4蝌蚪代表12（A），48（二），96（三）小时后电击（阶段30，分别为34和44） 。 （A“B”），可以可视化荧光莫内颅面间质在雄鹿ES 30和34。荧光可以检测阶段44（箭头，C' - C“）的软骨。肠道高度autofluorescent。

Discussion

在这段视频中，我们已经证明爪蟾蝌蚪的面部间质电穿孔介导的基因传递的可行性。使用这种方法，我们可以绕过早期发育的影响，操纵基因的功能，让我们在以后的时间点目标特定的组织。我们的研究表明，可能会影响颅面间质细胞的异质人群，让我们研究的电穿孔细胞以及宗族利益的蛋白质细胞的自治要求。结合实时成像，我们可以使用这种方法来研究基因功能，随着时间的推移，在颅面发育。这种新颖的方法，突出器官的研究非洲爪蟾的可追踪性。我们预计，这种方法可广泛适应研究以及其他组织的形态发生和分化。