Elektroporation af kraniofaciale Mesenchyme

Summary

Kraniofacial brusk udvikle sig i tæt kontakt med andre væv og er svære at manipulere med levende dyr. Vi anvender elektroporation til at levere molekylære værktøjer under væksten i den kraniofaciale skelettet, mens udenom tidlige embryonale effekter. Denne fremgangsmåde vil give os mulighed for effektivt at teste lægemiddelkandidaterne

Abstract

Elektroporation er en effektiv metode til at levere DNA og andre opkrævet makromolekyler i væv på præcise tidspunkter og i præcise steder. For eksempel har elektroporation været brugt med stor succes til at studere neural og retinal udvikling i Xenopus, kylling og mus ^1-10. Det er dog vigtigt at bemærke, at i alle disse studier blev efterforskerne ikke rettet mod bløde væv. Fordi vi er interesserede i kraniofacial udvikling, vi tilpasset en metode til at målrette ansigtet mesenchyme.

Da vi søgte den litteratur, fandt vi til vores overraskelse, meget få rapporter om succesfulde genoverførsel i bruskspidserne væv. De fleste af disse undersøgelser blev genterapi undersøgelser, såsom siRNA eller protein levering i chondrogenic cellelinjer, eller dyremodeller af arthritis ^11-13. I andre systemer, såsom kylling eller mus, elektroporation af ansigtets mesenchyme har været en udfordring (personlige KOMMUNIKATioner, Dept af kraniofaciale udvikling, KCL). Vi antager, at elektroporation ind procartilaginous og brusk væv i Xenopus kunne fungere bedre. I vores undersøgelser viser vi, at genoverførsel i ansigtet brusken sker effektivt på tidlige stadier (28), når ansigtet primordium stadig består af blødt væv før brusk differentiering.

Xenopus er et meget tilgængeligt hvirveldyr system til analyse af kraniofaciale udvikling. Kraniofacial strukturer er lettere synlige i Xenopus end i nogen andre hvirveldyr model, primært fordi Xenopus embryoner er befrugtet eksternt, så analyser af de tidligste stadier, og lette bor billedbehandling på enkelt celle opløsning, samt genbrug af mødrene ^14. Blandt hvirveldyr modeller udvikle eksternt, er Xenopus mere nyttigt for kraniofaciale analyse end zebrafisk, som Xenopus larver er større og nemmere at dissect, og udviklingslandene ansigtet regionen er mere tilgængelig for billeddannelse end det tilsvarende område i fisk. Desuden er Xenopus evolutionært tættere på mennesker end zebrafisk (~ 100 millioner år tættere) ^15. Endelig, i disse faser, er Xenopus haletudser gennemsigtige, og samtidig udtryk for fluorescerende proteiner eller molekyler vil gør det let visualisering af udviklingslandene brusk. Vi forventer, at denne tilgang vil give os mulighed for hurtigt og effektivt at teste kandidat molekyler i en in vivo model system.

Protocol

Del 1A. Udstyr

Mikroskop: oprejst stereo-dissekere anvendelsesområde med lavt strømforbrug mål

• Spænding / Pulse Generator: BTX ECM 830 Square Wave Elektroporation System
• Pipette aftrækker: P-87 Mikropipette Puller (Sutter Instrument Company, CA)
• Manipulator: grove, eller kombineret grove og fine afhængig af forberedelse.
• Mikropipette indehaveren: Fine Science Tools
• Elektrode: hjemmelavet
• Elektroporation kammer: hjemmelavet

L-formede elektroder:

1. Klip 8 cm høj renhed 0,4 mm wolfram wire (Goodfellow) og anbringer midtvejs en 1 ml sprøjte med kit (vi bruger Blu-Tack). Lad 4 cm wolfram ledning udsat fra spidsen af ​​sprøjten og bøje tip til L-form, 1 cm fra ende (Fig. 1A).
2. Trim tip så enden foranstaltninger 0,5 mm i længden. Thans tip er elektroden endestation.
3. Kør overskydende wolfram ledning parallelt med sprøjte og bruge det til at forbinde elektroden impulsgeneratoren.
4. Gentag processen at gøre et par af elektroder.
5. Sæt elektroderne til firkantbølge pulsgenerator via DC kabler.

Elektroporation kammer

1. Linje nederst i 90 mm fad med ~ 5 mm giftfri modellervoks.
2. Fyld fadet med elektroporation medier.
3. Brug af nr. 5 urmager pincet skære en T-formet godt (fig. 2). Den lange og skal måle ~ 2 mm x 2 mm x 10 mm og den korte ~ 2 mm x 2 mm x 5 mm. Den elektroporation parabol kan vaskes og genbruges.

Del 1B. Reagenser

DNA eller opkrævet makromolekyler

• Mikropipetter: 1 mm brede 4 "lange borosilikatglas kapillærer (WPI, TW100-F)
• Kultur medier: Normal amfibieflyvemaskine Media (NAM)
• > 10 X lager: 1100 mM NaCl, 20mM KCL, 10 mM Ca (NO _{3) 2} • 4H ₂ O, 1 mM EDTA.
  • Autoklave og opbevares ved 4 ° C.
  • 1 X NAM: Fortynd fra 10x lager, buffer med 0,1 mM NaHCO ₃ og 0,2 mM Na ₃ PO _4.
• Xenopus laevis haletudser, scene 28

DNA-forberedelse:

1. Forbered ekspressionsplasmider ved hjælp af standard-protokoller.
2. Resuspender DNA til en endelig koncentration på 1 mg / mikroliter i nuklease frit H ₂ 0.

* Vi har haft succes med vektorer, som indeholder et stærkt CMV promotor, såsom pCS2 + [16]. For afstamning analyse, vi normalt omfatter DNA-kodning grønt fluorescerende protein (pCS2 + GFP) ved en endelig koncentration på 0,1 mg / mikroliter. [DNA-koncentrationer mellem 0,1-3 mg / mikroliter blev også testet. Vi fandt, at koncentrationer under 0,8 mikrogram / mikroliter ineffektivt mærkede celler, mens DNA-koncentrationer større end 2 mg / & mu l ikke blev bedre elektroporation effektiviteten].

Morpholino oligonucleotid forberedelse:

(Bemærk:. MOS skal fluoresceinated (3'-carboxyfluorescein modificeret) eller på anden måde opladet)

1. Resuspender morpholino oligonukleotider (MOS) (Genetools, www.genetools.com ) ved en koncentration på 2 mM i nuklease frit H ₂ 0.
2. Varm portion af stamopløsning ved 65 ° C i 5 minutter.
3. Fortynd til den endelige koncentration på 0,5 mM i nuklease frit vand.

* 0,1-1mm MO løsninger blev afprøvet. 0,5 mm MO løsninger var tilstrækkelige til elektroporation af mange mesenchymale celler.

Mikropipetter

1. Forbered mikropipetter fra borosilikatglas kapillærer (1 mm bred, 4 "lange, WPI nej. TW100-F). Brug nål aftrækker til at forberede mikropipetter forsynet med en 8-12 mm lang taper og fine spids.
2. Crush tip ~ 2 mmfra spids bruge pincet, hvilket skaber en ujævn pause.

Medier

1. Inkubation medier: Forbered frisk 3 / 4 Normal amfibieflyvemaskine Media (NAM) fra 1x lager. Tilføj 0,025 mg / ml gentamycin.
2. Elektroporation medier: som ovenfor, med 0,1% benzocain (Sigma, 06950).

2. Elektroporation

Mikropipette opsætning

1. Fyld mikropipette med ~ 1 ml opløsning.
2. Sikker mikropipette i mikromanipulator og tillægger microinjector (Picospritzer II).
3. Vinkel mikropipette ved 50 ° i forhold til bordpladen.
4. Set indsprøjtningstryk på 20 PSI.
5. Kalibrer mikropipette at injicere 30 nl pr puls.

Haletudse forberedelse

1. Bedøver etape 28 Xenopus larver ved at inkubere i elektroporation medier i 5 minutter.
2. Overførsel bedøvede haletudse til elektroporation kammer fyldt med elektroporation medier. Position embryoI den lange godt, så hovedet hviler i T-krydset med ryg nedad og ventral udsatte side. Hovedet skal være lidt forhøjet i forhold til halen.
3. Brug pincet, blidt sikkert haletudse i godt med omgivende modellervoks. (Bemærk:.. Hvis haletudse ikke er sikret, kan det spjæt og kontakt elektrode ved elektroporation I dette tilfælde kassere haletudse som ansigtsservietter vil blive alvorligt beskadiget)

Elektroporation

1. Indsæt mikropipette tip umiddelbart posteriort for cement kirtel og ind i ansigtet mesenchyme.
2. Indsprøjtes 30 nl løsningen i mesenchyme.
3. Træk mikropipette.
4. Hurtigt justere elektrode tips parallelt med lederen af ​​den embryo (fig. 3).
5. Anvend 8 50 ms, 20mV firkantede pulser.
6. Træk elektroderne.
7. Brug pincet forsigtigt frigivelse haletudse fra godt og transfer til 3 / 4 NAM, 0,025 mg / ml gentamycin.
8. Haletudser kan inkuberes i 3 / 4 NAM, 0,025 mg / ml overnøjre, eller længere.
9. Screen embryoner til effektiv elektroporation ved fluorescens mikroskopi efter 24 timer.

3. Repræsentative resultater:

Brugen af ​​fluorescerende molekyler gør det nemt at screening af electroporated embryoner. Figur 4 viser et typisk parti af MO electroporated haletudser ~ 12, 48 og 96 timer efter elektroporation, inkuberes ved 14,5 ° C. Ved hjælp af fluorescens mikroskopi, kan MOS være visualiseres umiddelbart efter elektroporation og vare i flere dage efter elektroporation. Det er vores erfaring, er fluorescens svagt tydelige på nuværende tidspunkt 46 (~ 5 dage senere). I brusken, falder fluorescensen dramatisk efter udbrud af differentiering (~ st 42), men MO fluorescens stadig stærkere i andre celletyper, såsom svælg endoderm. Fluorescens mikroskopi viser, at oligonukleotider er indarbejdet i flere kraniofacial væv, herunder brusk. Oligonucleotid fluorescens cen ofte kan visualiseres i væv på begge sider af hovedet. Dette skyldes sandsynligvis hurtigere udbredelse af injektionsopløsningen hele løs kraniofacial mesenchyme før elektroporation.

Figur 1 Hjemmelavet elektroder. L-formet wolfram ledning er fastgjort til en 1 ml sprøjte med ikke giftige ler eller kit. (A) elektrode endestation måler 5 mm. (B) Sæt et par af elektroder, således at endestationer løber parallelt. Elektroder er knyttet til pulsgenerator af DC kabler.

Figur 2 Elektroporation kammer. (A) 90 mm fad foret med modellervoks er fyldt med medier og en T-formet kammer udskåret med nr. 5 urmager-pincet. (B) Den lange side måler 2 mm x 2 mm X10 mm, mens den korte måler 2 mm x 2 mm x 5 mm. Lederen af ​​embryo hviler i T-krydset, bug opad.

Figur 3 Skematisk illustration af elektroporation procedure. St. 28 haletudse er placeret i elektroporation kammer, bug opad. Mikropipette er indsat i ansigtet mesenchyme underliggende cement kirtel. Inject. Mikropipette er fjernet, og L-formede elektroder er afstemt parallelle flankerende hovedet. Anvend otte 50 ms, 20 mV firkantede pulser. Træk elektroderne. Grow haletudser til den ønskede trin. Visualiser MOS eller GFP udtryk ved hjælp af fluorescensmikroskopi.

Figur 4 Repræsentative haletudser 12 (A), 48 (B) og 96 (C) timer efter elektroporation (trin 30, 34 og 44 henholdsvis). (En "-B") Fluorescerende MO kan visualiseres inden kraniofacial mesenchyme på hjortes 30 og 34. Fluorescens kan påvises i brusken i stadie 44 (pilespids, C'-C "). Tarmen er meget autofluorescent.

Discussion

I denne video, har vi demonstreret gennemførligheden af elektroporation-medieret gen levering i ansigtet mesenchyme af Xenopus haletudser. Ved hjælp af denne metode, kan vi springe tidligt udviklingsmæssige effekter af at manipulere genfunktion giver os mulighed for at målrette specifikke væv på senere tidspunkter. Vores undersøgelser viser, at heterogene populationer af kraniofaciale mesenchymale celler kan blive berørt, hvilket giver os mulighed for at undersøge slægt electroporated celler samt celle selvstændige krav til proteiner af interesse. Kombineret med levende billeder, kan vi bruge denne fremgangsmåde til at studere genfunktion, over tid, i løbet af kraniofaciale udvikling. Denne nye metode fremhæver sporbarhed af Xenopus for studiet af organogenesen. Vi forventer, at denne metode generelt kan tilpasses til at studere morfogenese og differentiering af andre væv også.