Electroporation av kraniofaciale Mesenchyme

Summary

Kraniofaciale brusk utvikles i nær kontakt med andre vev og er vanskelige å manipulere i levende dyr. Vi bruker electroporation å levere molekylære verktøy under vekst av kraniofaciale skjelettet mens omgåelsen tidlig embryoutvikling effekter. Denne tilnærmingen vil gi oss mulighet til å effektivt test kandidat molekyler

Abstract

Electroporation er en effektiv metode for å levere DNA og andre belastes makromolekyler i vev ved presise tidspunkter og i presis steder. For eksempel har electroporation blitt brukt med stor suksess å studere nevrale og retinal utvikling i Xenopus, kylling og mus ^1-10. Det er imidlertid viktig å merke seg at i alle disse studiene ble det etterforskerne ikke rettet mot myke vev. Fordi vi er interessert i kraniofaciale utvikling, tilpasset vi en metode for å målrette ansikts mesenchyme.

Da vi søkte litteraturen, fant vi til vår overraskelse, svært få rapporter om vellykket genoverføring inn cartilaginous vev. De fleste av disse studiene var genterapi studier, som siRNA eller protein levering i chondrogenic cellelinjer, eller dyremodeller av artritt ^11-13. I andre systemer, for eksempel kylling eller mus, electroporation av ansikts mesenchyme har vært utfordrende (personlig communicationer, Dept of kraniofaciale Development, KCL). Vi hypotesen om at electroporation inn procartilaginous og cartilaginous vev i Xenopus kan fungere bedre. I våre studier, viser vi at genoverføring i ansikts cartilages skjer effektivt ved tidlige stadier (28), når ansikts primordium er fortsatt består av mykt vev før brusk differensiering.

Xenopus er en veldig tilgjengelig virveldyr system for analyse av kraniofaciale utvikling. Kraniofaciale strukturer er lettere synlig i Xenopus enn i noen andre virveldyr modell, først og fremst fordi Xenopus embryo er befruktet eksternt, slik at analyser av de tidligste stadiene, og tilrettelegge leve bildebehandling til enkelt celle oppløsning, samt gjenbruk av mødrene ^14. Blant virveldyr modeller utvikle eksternt, er Xenopus mer nyttig for kraniofaciale analyse enn sebrafisk, som Xenopus larver er større og lettere å dissect, og utvikle ansikts-regionen er mer tilgjengelig for bildebehandling enn tilsvarende regionen i fisk. I tillegg er Xenopus evolusjonært nærmere mennesker enn sebrafisk (~ 100 millioner år nærmere) ^15. Endelig på disse stadiene, Xenopus rumpetroll er gjennomsiktige, og samtidig uttrykk for fluorescerende proteiner eller molekyler vil tillate enkel visualisering av å utvikle brusk. Vi forventer at denne tilnærmingen vil gi oss mulighet til raskt og effektivt test kandidat molekyler i en in vivo modell system.

Protocol

Del 1A. Utstyr

Microscope: oppreist stereo-dissecting omfang med lav effekt objektiv

• Spenning / Pulse Generator: BTX ECM 830 Square Wave electroporation System
• Pipette puller: P-87 mikropipette Puller (Sutter Instrument Company, CA)
• Manipulator: grov, eller kombinert grov og fin avhengig forberedelse.
• Mikropipette holder: Fine Science Verktøy
• Elektrode: hjemmelaget
• Electroporation kammer: hjemmelaget

L-formede elektrodene:

1. Cut 8 cm av høyrent 0,4 mm wolfram wire (Goodfellow) og fest på midtpunktet en 1 ml sprøyte med putty (vi bruker Blu-Tack). La det være 4 cm tungsten ledning utsatt fra tuppen av sprøyten og bøy tuppen inn i L-form, 1 cm fra enden (Fig. 1A).
2. Trim tips slik at enden måler 0,5 mm i lengde. Thans tips er elektroden endestasjonen.
3. Kjør overflødig tungsten ledning parallelt med sprøyte og bruke den til å koble elektroden puls generator.
4. Gjenta prosessen med å lage et par elektroder.
5. Fest elektrodene til square wave pulsgenerator via DC kabler.

Electroporation kammer

1. Linje bunnen av 90 mm parabolen med ~ 5 mm giftfri plasticine.
2. Fyll tallerken med electroporation media.
3. Bruk nr. 5 urmakeri tang skaffe seg en T-formet brønn (Fig. 2). Den lange og skal måle ~ 2 mm x 2 mm x 10 mm og den korte ~ 2 mm x 2 mm x 5 mm. Den electroporation oppvask kan vaskes og gjenbrukes.

Del 1B. Reagenser

DNA eller belastes makromolekyler

• Mikropipetter: 1 mm bred 4 "lange borsilikatglass kapillærer (WPI, TW100-F)
• Kultur media: Normal Amphibian Media (NAM)
• > 10 X lager: 1100 mM NaCl, 20mM KCL, 10 mm Ca (NO _{3) 2} • 4H ₂ O, 1 mM EDTA.
  • Autoclave og oppbevar ved 4 ° C.
  • 1 X NAM: Fortynn fra 10x lager, buffer med 0,1 mM NaHCo ₃ og 0,2 mM Na ₃ PO _4.
• Xenopus laevis rumpetroll, scene 28

DNA forberedelse:

1. Forbered uttrykk plasmider med standard protokoller.
2. Resuspender DNA til en endelig konsentrasjon på 1 mg / mikroliter i nukleasefritt fri H ₂ 0.

* Vi har hatt suksess med vektorer som inneholder en sterk CMV arrangøren, som pCS2 + [16]. For avstamning analyse, vi vanligvis inkluderer DNA-koding grønt fluorescerende protein (pCS2 + GFP) til en endelig konsentrasjon på 0,1 mikrogram / mikroliter. [DNA konsentrasjoner mellom 0,1 til 3 mg / mikroliter ble også testet. Vi fant at konsentrasjoner under 0,8 mikrogram / mikroliter ineffektivt merket celler, mens DNA konsentrasjoner større enn 2 mikrogram / & mu, l ble ikke bedre electroporation effektiviteten].

Morpholino oligonukleotid forberedelse:

(Merk:. MOS må være fluoresceinated (3'-carboxyfluorescein modified) eller på annen måte ladet)

1. Resuspender morpholino oligonukleotider (MOS) (Genetools, www.genetools.com ) i en konsentrasjon på 2 mm i nukleasefritt fri H ₂ 0.
2. Heat delmengde av stamløsningen ved 65 ° C i 5 minutter.
3. Fortynn til endelig konsentrasjon på 0,5 mm i nukleasefritt fritt vann.

* 0,1-1mm MO løsninger ble testet. 0,5 mm MO løsninger var tilstrekkelig for electroporation av mange mesenchymalceller.

Mikropipetter

1. Forbered mikropipetter fra borsilikatglass kapillærer (1 mm bred, 4 "lang, WPI nei. TW100-F). Bruk nål avtrekker å forberede mikropipetter med en 8-12 mm lang avsmalning og fine tips.
2. Crush tip ~ 2 mmfra tuppen bruke tang, og skaper en taggete pause.

Media

1. Inkubasjon media: Forbered frisk trekvart Normal Amphibian Media (NAM) fra 1x lager. Legg til 0,025 mg / ml Gentamycin.
2. Electroporation media: som ovenfor, med 0,1% benzocaine (Sigma, 06950).

2. Electroporation

Mikropipette setup

1. Fyll mikropipette med ~ 1 mL injeksjonsvæske, oppløsning.
2. Sikker mikropipette i micromanipulator og feste til microinjector (Picospritzer II).
3. Angle mikropipette ved 50 ° fra bordplaten.
4. Sett injeksjon trykket ved 20 PSI.
5. Kalibrer mikropipette å injisere 30 nl per puls.

Rumpetroll forberedelse

1. Anesthetize scenen 28 Xenopus larver av incubating i electroporation media i 5 minutter.
2. Overfør bedøvet rumpetroll inn electroporation kammer fylt med electroporation media. Posisjon embryoinnenfor den lange godt slik at hodet hviler i T-krysset med dorsal side ned og ventrale side eksponert. Hodet bør være litt forhøyet sammenlignet med halen.
3. Bruk pinsett, forsiktig sikre rumpetroll i godt med omkringliggende plasticine. (Merk:.. Hvis rumpetroll ikke er sikret, kan det rykk og kontakt elektrode under electroporation I dette tilfellet forkaste rumpetroll som ansiktsservietter vil bli alvorlig skadet)

Electroporation

1. Sett mikropipette spissen umiddelbart posteriort for sement kjertel og inn ansikts mesenchyme.
2. Injiser 30 nl løsning inn mesenchyme.
3. Trekk mikropipette.
4. Raskt justere elektrode tips parallell til hodet av embryoet (Fig. 3).
5. Påfør 8 50 ms, 20mV kvadrat pulser.
6. Trekk elektrodene.
7. Bruk pinsett nøye utgivelsen rumpetroll fra brønn og transfer til 3 / 4 NAM, 0,025 mg / ml Gentamycin.
8. Rumpetroll kan inkubert i 3 / 4 NAM, 0,025 mg / ml overnight, eller lenger.
9. Screen embryoer for effektiv electroporation av fluorescens mikroskopi etter 24 timer.

3. Representant Resultater:

Bruken av fluorescerende molekyler gir enkel screening av electroporated embryoer. Figur 4 viser et typisk batch av MO electroporated rumpetroll ~ 12, 48 og 96 timer etter electroporation, inkuberes ved 14,5 ° C. Ved hjelp av fluorescens mikroskopi, kan MOS være visualiseres umiddelbart etter electroporation og vedvare i flere dager etter electroporation. Vår erfaring er fluorescens svakt tydelig på scenen 46 (~ 5 dager senere). I brusk, minsker fluorescens dramatisk etter utbruddet av differensiering (~ st 42), men vedvarer MO fluorescens sterkere i andre celletyper som svelg endoderm. Fluorescens mikroskopi viser at oligonucleotides er innarbeidet i flere kraniofaciale vev inkludert brusk. Oligonukleotid fluorescens cen ofte bli visualisert i vev på hver side av hodet. Dette er sannsynligvis på grunn av rask spredning av injeksjonen løsningen hele løs kraniofaciale mesenchyme før electroporation.

Figur 1. Hjemmelaget elektroder. L-formet tungsten wire er festet til en 1 ml sprøyte med giftfri leire eller kitt. (A) Elektroden Terminus måler 5 mm. (B) Fest et par elektroder, slik at Termini kjøres parallelt. Elektrodene er festet til pulsgenerator med DC kabler.

Figur 2. electroporation kammer. (A) 90 mm parabolen foret med plasticine er fylt med media og en T-formet kammer utskåret med No 5 urmakeri tang. (B) Den lange side måler 2 mm x 2 mm X10 mmmens den korte måler 2 mm x 2 mm x 5 mm. Lederen av embryoet hviler i T-krysset, ventral siden opp.

Figur 3 Skjematisk illustrere electroporation prosedyre. St. 28 rumpetroll er plassert i electroporation kammer, ventral siden opp. Mikropipette settes inn ansikts mesenchyme underliggende sement kjertel. Injiser. Mikropipette er fjernet og L-formede elektrodene er parallell flankerer hodet. Påfør åtte 50 ms, 20 mV kvadrat pulser. Trekk elektrodene. Grow rumpetroll til ønsket etapper. Visualiser MOS eller GFP uttrykk med fluorescens mikroskopi.

Figur 4 Representative rumpetroll 12 (A), 48 (B) og 96 (C) timer etter electroporation (etapper 30, 34 og 44 henholdsvis). (En "-B") Fluorescent MO kan visualiseres innen kraniofaciale mesenchyme på hjortes 30 og 34. Fluorescens kan oppdages i brusk på scenen 44 (pilspiss, C'-C "). Tarmen er svært autofluorescent.

Discussion

I denne videoen har vi demonstrert muligheten for electroporation-mediert genet levering i ansikts mesenchyme av Xenopus rumpetroll. Ved hjelp av denne tilnærmingen kan vi omgå tidlige utviklingsskader av manipulere gen-funksjon som tillater oss å målrette bestemte vev ved senere tidspunkter. Våre studier viser at heterogene populasjoner av kraniofaciale mesenchymalceller kan påvirkes, slik at vi kan undersøke avstamning av electroporated celler samt cell autonome behov for proteiner av interesse. Kombinert med live bildebehandling, kan vi bruke denne tilnærmingen til å studere gen-funksjon, over tid, under kraniofaciale utvikling. Denne romanen Metoden fremhever tractability av Xenopus for studiet av organogenesen. Vi forventer at denne metoden kan grovt tilpasses studere morphogenesis og differensiering av andre vev i tillegg.