顔面間葉のエレクトロポレーション

Summary

頭蓋顔面軟骨は他の組織と緊密に連絡を開発し、生きている動物で操作するのが難しいです。我々は、初期胚の影響を迂回しながら顎顔面骨格の成長中に分子ツールを提供するためにエレクトロポレーションを使用しています。このアプローチは、私たちは効率的に候補分子をテストすることができます

Abstract

エレクトロポレーションは、正確な時間の点で組織にし、正確な位置でDNAと他の荷電高分子を提供する効率的な方法です。例えば、エレクトロポレーションは、 アフリカツメガエル 、ニワトリとマウス^1-10に神経や網膜の開発を研究するために大きな成功を収めて使用されています。しかし、これらの研究のすべてで、調査官は軟部組織をターゲットにされていないことに注意することが重要です。我々は頭蓋顔面の開発に興味を持っているので、我々は、顔の間充織を対象とする手法を適応した。

我々は文献を検索するときに、我々は、私たちの驚きに、軟骨組織に成功した遺伝子導入の非常に少数の報告を発見した。これらの研究の大半はこのような軟骨細胞株へのsiRNAやタンパク質の配信、または、関節炎^11月13日の動物モデルとしての遺伝子治療の研究であった。このようなニワトリやマウスなど他のシステム、、で顔面間葉のエレクトロポレーションは、挑戦されています（個人的なcommunicatをイオン、頭蓋顔面の開発の部門、KCL）。我々はアフリカツメガエルにおけるprocartilaginousと軟骨組織へのエレクトロポレーションはよりよく働くかもしれないという仮説を立てた。我々の研究では、我々はその顔の軟骨への遺伝子導入は、顔面原基がまだ前の軟骨分化への軟部組織から構成されている初期段階（28）、で効率的に起こる示す。

アフリカツメガエルは、頭蓋顔面開発の分析のための非常にアクセス可能な脊椎動物のシステムです。 アフリカツメガエルの胚が初期段階の分析を可能にする、外部から受精、そしてライブ単一細胞の解像度でのイメージングだけでなく、母親¹⁴の再利用を促進しているので、顎顔面の構造は、より容易に目に見えるアフリカの他の脊椎動物のモデルに比べて、主に。 アフリカツメガエルの幼虫はディに大きくしやすいように、外部の開発脊椎動物のモデルの中で、 アフリカツメガエルは 、ゼブラフィッシュより顔面分析のために、より便利です。ssect、および発展途上顔領域は、魚に相当する領域よりもイメージングによりアクセス可能です。さらに、 アフリカツメガエル、ゼブラフィッシュ（〜100万年近い^）15よりヒトへの進化的に近いです。最後に、これらの段階で、 アフリカツメガエルのオタマジャクシは透明であり、蛍光タンパク質や分子の同時発現は、発展途上軟骨の容易な視覚化が可能になります。我々は、このアプローチは、私たちは迅速かつ効率的にin vivoモデル系での候補分子をテストできるようになると期待しています。

Protocol

部分1A。機器の

顕微鏡：低消費電力を目的とした直立ステレオ解剖範囲

• 電圧/パルスジェネレータ：BTX ECM 830方形波のエレクトロポレーションシステム
• ピペットプラー：P - 87マイクロピペットプラー（サッターのインストゥルメント社、カリフォルニア州）
• マニピュレータ：準備に応じて粗い、または複合粗調整と微。
• マイクロピペットホルダー：ファイン科学ツール
• 電極：手作り
• エレクトロポレーションチャンバー：手作り

L字型電極：

1. 高純度の8センチメートル0.4mmのタングステン線（グッドフェロー）と中間点に貼ってカットパテを（我々はBlu -タックを使用）を使用して1ミリリットル注射器。 L字状にシリンジと曲げ先端の先端から露出して4cmのタングステン線を残し、最後から1cm（図1A）。
2. 端の長さが0.5ミリメートルを測定するように先端をトリミング。 T彼の先端が電極の末端です。
3. 注射器への過剰なタングステン線を平行に実行し、電極のパルス発生器を接続するためにそれを使用。
4. 一対の電極を作るプロセスを繰り返します。
5. DCケーブルを介して方形波のパルス発生器に電極を取り付けます。

エレクトロポレーションチャンバー

1. 〜5 mmノン毒性粘土で90 mmディッシュのラインの底。
2. エレクトロポレーションメディアで皿を埋める。
3. 第5号時計メーカーの鉗子を使用すると、T字型だけでなく（図2）を彫る。長いもは〜2 × 2mmの× 10 mmと短い〜2 × 2mmの× 5 mmを測定する必要があります。エレクトロポレーション皿を洗浄し、再利用することができます。

パート1B。試薬

DNAまたは荷電高分子

• マイクロピペット：1 mm幅4"長いホウケイ酸ガラス毛細管（WPI、TW100 - F）
• 文化メディア：ノーマル両生類メディア（NAM）
• > 10 X株式：1100 mMのNaCl、20mMのKCl、10mMのカルシウム（NO _{3）2•4H 2} O、1mMのEDTA。
  • 4℃でオートクレーブと店舗
  • 1 X NAM：0.1mMのNaHCO ₃及び0.2mMののNa ₃ PO ₄で10倍株式、バッファから希釈します。
• アフリカツメガエルのオタマジャクシ、ステージ28

DNAの調製：

1. 標準プロトコルを使用して発現プラスミドを準備します。
2. ヌクレアーゼフリーH ₂ 0での1μg/μlの最終濃度にDNAを再懸濁します。

*我々は、このようなpCS2などの強力なCMVプロモーターを含むベクター、成功させている+ [16]。系統解析のために、我々は、通常は0.1μg/μlの最終濃度で、緑色蛍光タンパク質（pCS2 + GFP）をコードするDNAが含まれています。 0.1から3μg/μLの間に[DNAの濃度も試験した。我々は発見した0.8μ​​g/μLの非効率的に標識された細胞以下の濃度、DNA濃度に対し、より大きい濃度2μg/ A＆MU、Lは、エレクトロポレーションの効率を改善しなかった]。

モルホリノオリゴヌクレオチドの準備：

（注：MOSは、フルオレセインする必要があります（3' -カルボキシ変更された）またはそうでなければご利用いただけます。）

1. 再懸 ​​濁し、モルフォリノオリゴヌクレオチド（MOS）（Genetools、 www.genetools.comヌクレアーゼフリーH ₂ 0 2 mMの濃度で）。
2. 65℃原液の熱のアリコート℃で5分間。
3. ヌクレアーゼフリー水で0.5mMの最終濃度に希釈する。

* 0.1 - 1mMのMOソリューションを試験した。 0.5mMのMOソリューションは、多くの間葉細胞のエレクトロポレーションするのに十分だった。

マイクロピペット

1. ホウケイ酸ガラス毛細管（幅1 mmの4"長い間、WPIない。TW100 - F）からマイクロピペットを準備します。8-12 mm長テーパーと細かいチップでマイクロピペットを準備するためにニードルプラーを使用してください。
2. クラッシュの先端約2 mm先端から、ピンセットを使ってギザギザの休憩を作成する。

メディアの

1. インキュベーションメディア：1X在庫から新鮮な4分の3ノーマル両生類メディア（NAM）を準備。 0.025 mg / mlのゲンタマイシンを追加。
2. エレクトロポレーションメディア：上記のように、0.1％ベンゾカイン（シグマ、06950）。

2。エレクトロポレーション

マイクロピペットのセットアップ

1. 〜1μL注入液でマイクロピペットを埋める。
2. マイクロマニピュレータにマイクロピペットを固定し、マイクロインジェクター（Picospritzer II）に接続します。
3. 卓上から50 °の角度をマイクロピペット。
4. 20 PSIにおける射出圧力を設定します。
5. パルスあたり30 NLをインジェクトするためにマイクロピペットを較正します。

オタマジャクシの準備

1. 5分間エレクトロメディアでインキュベートすることにより、ステージ28 アフリカツメガエルの幼虫を麻酔。
2. エレクトロポレーションメディアで満たされたエレクトロポレーションチャンバーに麻酔オタマジャクシを移す。位置の胚長い内でもそう頭が背側を下にして露出した腹側とのT字路にかかっている。頭は少し尾に比べて上昇する必要があります。
3. 鉗子を使用して、静かに粘土を囲むとうまくでオタマジャクシを確保する。 （注：おたまじゃくしが保護されていない場合、それがけいれんし、エレクトロポレーション中に電極を接触する可能性がある顔の組織が著しく損傷されるので、この場合にはオタマジャクシを破棄。。）

エレクトロポレーション

1. セメント腺のすぐ後方マイクロピペットの先端を挿入し、顔の間充織に。
2. 間充織に30 nlのソリューションを注入。
3. マイクロピペットを引っ込めます。
4. すぐに胚の頭部（図3）に平行電極チップの位置を合わせます。
5. 8 50ミリ秒、20mVの方形パルスを印加して下さい。
6. 電極を引っ込めます。
7. 鉗子を使用すると、慎重に井戸からオタマジャクシを放すと3 / 4にNAM、0.025 mg / mlのゲンタマイシンを転送する。
8. オタマジャクシ3 / 4 NAM、0.025 mg / mlのovernでインキュベートすることができます。IGHT、またはより長い。
9. 24時間後に蛍光顕微鏡法による効率的なエレクトロポレーションのための画面の胚。

3。代表的な結果：

蛍光分子の使用は、エレクトロポレーション胚の簡単なスクリーニングを可能にします。図4は、14.5でインキュベートしたMOエレクトロオタマジャクシ〜12、48、エレクトロポレーション後96時間の典型的なバッチ、℃を示しています。蛍光顕微鏡を使用して、MOは直ちにエレクトロポレーション後可視化し、エレクトロポレーション後の数日間持続することができます。我々の経験では、蛍光はステージ46（〜5日後）に弱く明らかである。軟骨では、蛍光は分化の開始（〜ST 42）の後に劇的に減少するが、MO蛍光は咽頭内胚葉などの他の細胞型においてより強く保持されます。蛍光顕微鏡は、オリゴヌクレオチドは、軟骨を含むいくつかの頭蓋顔面の組織に組み込まれていることを示しています。オリゴヌクレオチド蛍光C多くの場合、頭部の両側にある組織で可視化される。これはおそらく、エレクトロポレーションの前に緩んで頭蓋間充織全体に注射液の急速な普及によるものです。

1自家製の電極を示しています。 L字型のタングステン線は、非毒性の粘土やパテを使用して、1mlのシリンジに接続されています。 （A）電極の末端は、5 mmを測定します。 （B）末端を並列実行するように、一対の電極を取り付けます。電極は、DCケーブルによるパルス発生器に接続されています。

2エレクトロポレーションチャンバーを示します 。 （）プラスティと並ぶ90 mmのディッシュは、メディアおよびNo 5の時計メーカーの鉗子が刻まれたT字型のチャンバーで満たされている。 （B）長辺が2mmを計測するX 2ミリメートルX10ミリメートル短期対策2ミリメートルX 2㎜× 5ミリメートルをしながら。胚の長は、T字路、腹側にかかっている。

エレクトロポレーションの手順を示す3の回路図 。聖28オタマジャクシは、腹側が上、エレクトロポレーションチャンバー内に配置されます。マイクロピペットは、顔の間充織基盤となるセメント腺に挿入されます。注入する。マイクロピペットは、削除され、L字型の電極が平行にヘッドを隣接配置されます。 eight 50ミリ、20 mVの方形パルスを印加して下さい。電極を引っ込めます。希望するステージにオタマジャクシを育てる。 MOをや蛍光顕微鏡法を用いてGFPの発現をVisu​​alise。

図4代表的なおたまじゃくし12（）、48（B）、および96（C）時間後にエレクトロポレーション（ステージ30、34とそれぞれ44）。 （A"- B"）蛍光MOはクワガタで頭蓋間充織の中で可視化することができます。ES 30〜34。蛍光は、ステージ44（矢じり、C'- C"）で、軟骨で検出することができます。腸が非常に自家蛍光である。

Discussion

このビデオでは、我々はアフリカツメガエルのオタマジャクシの顔の間充織にエレクトロを介した遺伝子デリバリーの実現可能性を実証している。このアプローチを使用して、我々は、私たちは後の時点で特定の組織をターゲットにすることができます遺伝子の機能を操作するの初期の発達の影響を回避することができます。我々の研究は、私たちはエレクトロポレーションした細胞だけでなく、関心のタンパク質の細胞自律的な要件の系統を検討できるように、頭蓋顔面間葉系細胞の異種集団に影響を与える可能性があることを示している。ライブイメージングと組み合わせることで、我々は、頭蓋顔面の開発中に、時間をかけて、遺伝子機能を研究するためにこのアプローチを使用することができます。この新規な方法は、器官形成の研究のためのアフリカツメガエルの従順さを強調。我々は、このメソッドが広くだけでなく、他の組織の形態形成と分化を研究するために適合させることができることを期待しています。