Summary
В следующих разделах мы опишем процедуры подготовки альгината микросфер для использования в биомедицинских приложениях. Мы специально иллюстрирует технику для создания многослойных альгинат микросфер для двойной цели клеток и белков инкапсуляции в качестве потенциального лечения диабета типа 1.
Abstract
Альгинат материалов на основе уделялось большое внимание для биомедицинских приложений, поскольку их гидрофильности, биосовместимость и физической архитектуры. Приложения включают клетки инкапсуляции, доставки лекарств, культуру стволовых клеток и тканевой инженерии леса. На самом деле, клинические испытания в настоящее время осуществляется, в котором островками заключены в ООП покрытые микрошарики альгината в лечении сахарного диабета типа я. Тем не менее, большое количество островков, необходимых для эффективности из-за плохого трансплантации следующие выживания. Возможность локально стимулировать формирование микрососудистой сети вокруг инкапсулированные клетки может увеличить свою жизнеспособность за счет улучшения транспорта кислорода, глюкозы и других питательных веществ. Фактор роста фибробластов 1 (FGF-1) является естественным фактором роста, который может стимулировать образование кровеносных сосудов и повышение уровня кислорода в ишемизированных тканях. Эффективность FGF-1 усиливается, когда он поставлен в Sustained моды, а не одной большой болюсного введения. Долгосрочным высвобождение факторов роста от островка системы герметизации может стимулировать рост кровеносных сосудов непосредственно к трансплантированных клеток, потенциально улучшая функциональные результаты трансплантата. В этой статье мы опишем процедуры подготовки альгината микросфер для использования в биомедицинских приложениях. Кроме того, мы опишем метод был разработан для создания многослойных микрошарики альгината. Клетки могут быть заключены во внутреннем ядре альгинат, и ангиогенных белков в наружном слое альгината. Выпуск белков из этого внешнего слоя будет стимулировать формирование местных микрососудистых сетей прямо на пересаженные островки.
Protocol
В протоколе описываются здесь в три шага процедуры для создания многослойных микрошарики альгината (рис. 1). Во-первых, альгинат микрошарики образуется (рис. 2A). Эта процедура описана в разделе 1 ниже. Клетки и белки могут быть добавлены в микрошариков на этом этапе для того, чтобы действовать в качестве системы доставки. Следующий шаг включает в себя формирование permselective слой микрошариков и описан в разделе 2. Заключительный этап предполагает формирование дополнительного слоя альгината и описана в разделе 3. Этот слой образуется на внешней поверхности гранул (рис. 2В) может быть использован для инкапсуляции и доставки терапевтических молекул (рис. 2) направить клеточного ответа системы после трансплантации.
1. Подготовка альгинат Microbead
- Подготовить 1,5% (вес / объем) раствор альгината LVM путем растворения 15 г альгината LVM в 1 млВнутреннее решение альгинат слой (25 мМ HEPES буфере, 118 мМ NaCl, 5,6 мМ KCl, 2,5 мМ MgCl 2 в воде Д.И., доводят до рН 7,4). Смешайте по Vortexer до альгинат власть полностью растворяется с образованием ясно, вязкий раствор. Примечание: Этот протокол описывает условия оптимальны для инкапсуляции островок в альгината микрокапсулы 1 концентрации и состава альгинат микросферы могут быть изменены, чтобы настроить свойства для других приложений (например, доставки лекарств, тканевой инженерии и т.д.). Примечание: Для островок инкапсуляции островков могут быть добавлены в раствор альгината на этот шаг, перед загрузкой в microencapsulator.
- Подготовка сшивания решения (22 мМ CaCl 2 в воде DI) путем растворения 100 мМ CaCl 2 и 10 мМ HEPES буфера в воду DI и адаптации к рН 7,4. Примечание: другие двухвалентных катионов, таких как Br 2 +, Sr 2 + и т.д. могут быть использованы вместо Ca 2 +, в зависимости от характера альгината гелеобразования гesired.
- Настройка двухканального воздуха куртку альгинат microencapsulator, добавив 25-игла для шприца, и регулировать клапаны на каждой стороне, чтобы убедиться, что игла находится в центре воздушной рубашки. Различные иглы прибор может быть использован для этого шага, в зависимости от размера альгината микрошарики мишенью.
Этот шаг также может быть выполнена с помощью шприца, должны microencapsulator не будут доступны. Добавить альгинат решение шприц, а затем выберите иглой на основе размера микрошарики лучшего. - Поместите в колбу, содержащую 10 мл сшивания решения непосредственно под иглой. Поместите мешалкой в растворе.
- Вводите капель прямо в CaCl 2 решения для того, чтобы сшить альгината для формирования микрогранул. Инкубируйте бусины в сшивания решение лечить, по крайней мере пятнадцать минут, при постоянном перемешивании.
- Передача бисером 15 мл центрифужные пробирки. Удаление остаточных решение,и выполнить три мойки с 0,2% CaCl 2 в физиологическом растворе в течение двух минут каждый.
2. Покрытие микрошарики с поли-L-орнитин
- Подготовить 3 мл 0,1% (вес / объем) раствора поли-L-орнитин (ООП) в физиологическом растворе. Поместите раствор на вихрь, пока он полностью не растворится, образуя прозрачный раствор. Poly-L-лизин (PLL) может быть использован вместо ООП для этого шага, в результате чего аналогичные уровни permselectivity.
- Передача альгинат микрошариков в решение ООП. Место на Vortex в течение 30 минут, чтобы ООП достаточно времени, чтобы взаимодействовать с альгинат, образуя поликатиона-полианиона комплекса. В конце 30 минут, не должно быть отчетливо видно белый налет вокруг альгинат микрошарики.
- Удалить решение ООП, и выполнить три мойки с 0,2% CaCl 2 в физиологическом растворе в течение двух минут каждый.
3. Создание космического альгинат Положитеэ
- Подготовить альгинат решение требуемой концентрации, которая будет использоваться для создания внешнего слоя. Раствор готовят, как описано в (1.1) выше. Размер внешнего слоя зависит от состава и концентрации альгината используется (рис. 3).
- Передача альгинат микрошариков к клетке-фильтр. Используйте Kimwipe, чтобы поглотить избыточное решение для того, чтобы высушить микрошарики как можно больше.
- Передача микрошариков к поверхности парафильмом. Другие гладкие поверхности, такие как стекло или даже пластиковые чашки Петри может быть заменен на парафильмом, если это необходимо.
- Передача альгинат раствор, приготовленный в (3.1) на альгинат микрошарики. Объем альгинат решение будет должна полностью покрывать альгинат микрошарики. Пусть микрошарики остаются в альгинат решение в течение 45 минут.
- Используйте пипетку, чтобы удалить лишнюю решение альгинат не связан с микрошариков.
- Трансфер в микрошарикик решению 22 мм CaCl 2. Это сшивки альгинат решение по микрошарики, в результате формирования различных внешний слой альгината.
- Выполнения трех промывок 22 мм CaCl 2 в физиологическом растворе в течение двух минут каждый. Просмотр микрошарики под микроскопом должны обеспечивать различные наружный слой альгината рассматриваться формируются вокруг ядра Microbead.
4. Представитель Результаты
Рисунок 1. Схема процедуры для создания многослойных микрошарики альгината. Воспроизводится с разрешения Ханна и соавт. J Biomed Mater Res А. Ноябрь, 95 (2), 632-40 (2010).
Рисунок 2. (А) и (B) фазового контраста изображения альгинат микрошарики. (А) показывает, MicrobeadПосле синтеза шаг (1.7), в то время как (B) показывает отдельный внешний слой альгината настоящее время после завершения шага (3.7). (C) FITC изображений флуоресцентно-меченых белков БСА заключены в наружный слой. Воспроизводится с разрешения Ханна и соавт. J Biomed Mater Res А. Ноябрь, 95 (2), 632-40 (2010).
Рисунок 3. Размер наружный слой альгината может варьироваться исходя из состава и концентрации альгината используется. Наши результаты показывают, что, как LVM и LVG альгинат, наружный слой размер увеличивается с ростом концентрации альгината, и LVG альгинат дает толще внешние слои, чем LVM альгинат при равных концентрациях. Воспроизводится с разрешения Ханна и соавт. J Biomed Mater Res А. Ноябрь, 95 (2), 632-40 (2010).
Рисунок 4. Выпуск FGF-1, кровеносных сосудов белка фактора роста, с наружным слоем альгината варьировалась на основе концентрации LVM и LVG альгинат использовали. (А) и (Б) показывают процент выпуска, и (C) и (D) обозначим соответствующий выпуск массы FGF-1 в зависимости от времени для различных составов внешнего слоя. Существует версия взрыва выставлены для всех условий в течение первых 5 ч (А и С) и низкой дозы непрерывного выпуска на срок до 30 дней (B и D). Воспроизводится с разрешения Ханна и соавт. J Biomed Mater Res А. ноября,. 95 (2), 632-40 (2010) Нажмите здесь, чтобы увеличить рисунок .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Альгинат является естественным, кислые полисахариды, извлеченные из морских водорослей и состоит из единиц 1,4 '-β-D-маннуроновой кислоты (M) и α-L-гулуроновой кислоты (G) 2,3. Простые геля происходит, когда двухвалентных катионов, таких как Ca 2 +, Sr 2 + или Ba 2 + взаимодействуют с G-мономеров формирования ионных связей между соседними цепями альгината. Микрошарики альгината были использованы для доставки различных белков, в том числе фактор роста фибробластов 1 (FGF-1), фактор роста нервов, лейкемия ингибирующего фактора, фактора роста эндотелия сосудов (VEGF), и для инкапсуляции клеток, включая хондроциты, гепатоциты и островков. Преимущества использования такой системы микрочастицы полимера включает защиту белки и клетки от деградации и реакции в организме, небольшой объем частиц позволяет легко управления через инъекции, а также контроль растворенного диффузии манипуляции с физическими свойствами материала.
Альгинат микросферы покрытые permselective слой полимера в настоящее время клинические испытания для лечения сахарного диабета типа я. Тем не менее, долгосрочная жизнеспособность пересаженного инкапсулированных островков зависит, в частности, от его способности получить кислород и питательные вещества из сосудистого кровоснабжения. Система биоматериала, который может служить одновременно и инкапсуляции системы островки, а также устойчивой системы доставки ангиогенных белков может стимулировать роста сосудов вокруг пересаженных клеток, что приводит к повышению жизнеспособности трансплантата. Стойкие неоваскуляризации требует постоянного выпуска FGF-1, а не однократное введение болюса. В этой статье Юпитер, мы представляем подход для создания многослойных микрошарики альгината (рис. 1). Наружный слой может быть использован для инкапсуляции и с пролонгированным высвобождением FGF-1, а внутренний слой может быть использован для immunoisolation островковых трансплантатов (рис. 2
В нашей лаборатории ранее показали, что устойчивые поставки FGF-1, а не высокой болюсного введения белка, приводит к постоянным микрососудистых ответ сети 4-6. Система, описанная здесь, может быть использован для создания внешнего слоя на поставку ангиогенных белков, таких, как FGF-1 (рис. 2). Размер внешнего слоя может варьироваться исходя из состава и концентрации альгината используется (рис. 3). Размер этого внешнего слоя могут играть важную роль в успехе этих систем. Свойства внешнего слоя может повлиять как на выпуск терапевтических молекул в окружающие ткани и транспорта питательных веществ и сигнальных молекул в клетки во внутреннем альгината. Внешние свойства слоя должны быть оптимизированы для данного приложения. Для доставки FGF-1, замедленным высвобождением может быть достигнуто в течение 30 дней в зависимости от формы альгинатulation (рис. 4) 7, 8.
Клинические испытания с использованием островков заключены в микрокапсулы, альгинат показали некоторую надежду для лечения сахарного диабета типа я. Тем не менее, большое количество островков, необходимых для эффективности из-за плохой выживаемости после трансплантации. Возможность инкапсуляции островков в многослойных микрокапсулы, в которых ангиогенных белков освобождается от наружного слоя может повысить жизнеспособность пересаженных островков. Это улучшение жизнеспособности может сократить число островков, необходимых для лечения, увеличивая потенциальные клинические последствия и доступность этих методов лечения.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Нет конфликта интересов объявлены.
Acknowledgments
Работа выполнена при поддержке департамента США по делам ветеранов (Вашингтон), гранты 0852048, 0731201, 0854430 и от Национального научного фонда (Арлингтон, Вирджиния), и грант RO1 DK080897 из Национального института здоровья (Bethesda, MD) . Г-н Ханна получила поддержку щедрому пожертвованию г-н Эдвард Росс и доктор Моника Мойя от Фонда Билла и Мелинды Гейтс (Сиэтл, Вашингтон).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Pronova Ultrapure LVG alginate | Nova-Matrix | 4200006 | A variety of alginate formulations are available. The choice of alginate influences the end properties of the microbeads, including size, mechanical properties, and transport. The composition used should be optimized for a given application. |
| Pronova Ultrapure LVM alginate | Nova-Matrix | 4200206 | A variety of alginate formulations are available. The choice of alginate influences the end properties of the microbeads, including size, mechanical properties, and transport. The composition used should be optimized for a given application. |
| Poly-L-ornithine hydrochloride | Sigma-Aldrich | P2533 |
References
- Darrabie, M. D., Kendall, W. F., Opara, E. C. Characteristics of Poly-L- Ornithine-coated alginate microcapsules. Biomaterials. 26, 6846-6852 (2005).
- Yamagiwa, K., Kozawa, T., Ohkawa, A. Effects of alginate composition and gelling conditions on diffusional and mechanical properties of calcium-alginate gel beads. J. Chem. Eng. Jpn. 28, 462-467 (1995).
- Amsden, B., Turner, N. Diffusion characteristics of calcium alginate gels. Biotechnol. Bioeng. 65, 605-610 (1999).
- Uriel, S., Brey, E. M., Greisler, H. P. Sustained low levels of fibroblast growth factor-1 promote persistent microvascular network formation. Am. J. Surg. 192, 604-609 (2006).
- Moya, M. L., Lucas, S., Francis-Sedlak, M., Liu, X., Garfinkel, M. R., Huang, J. J., Cheng, M. H., Opara, E. C., Brey, E. M. Sustained delivery of FGF-1 increases vascular density in comparison to bolus administration. Microvasc. Res. 78, 142-147 (2009).
- Moya, M. L., Cheng, M. H., Huang, J. J., Francis-Sedlak, M. E., Kao, S. W., Opara, E. C., Brey, E. M. The effect of FGF-1 loaded alginate microbeads on neovascularization and adipogenesis in a vascular pedicle model of adipose tissue engineering. Biomaterials. 31, 2816-2826 (2010).
- Khanna, O., Moya, M. L., Greisler, H. P., Opara, E. C., Brey, E. M. Multilayered Microcapsules for the Sustained-Release of Angiogenic Proteins From Encapsulated Cells. Am. J. Surg. 200, 655-658 (2010).
- Khanna, O., Moya, M. L., Opara, E. C., Brey, E. M. Synthesis of multilayered alginate microcapsules for the sustained-release of fibroblast growth factor-1. J. Biomed. Mater. Res. A. 95, 632-640 (2010).
