Summary
בסעיפים הבאים, אנו המתאר הליכי ההכנה של אלגינט microspheres לשימוש ביישומים ביו. אנחנו במיוחד להמחיש את הטכניקה ליצירת אלגינט microspheres רב שכבתי למטרה כפולה של התא אנקפסולציה חלבון כטיפול פוטנציאלי לסוכרת מסוג 1.
Abstract
אלגינט חומרים מבוססי קיבלו תשומת לב רבה עבור יישומים ביו בגלל אופי הידרופילי שלהם, biocompatibility, ואדריכלות פיזי. היישומים כוללים אנקפסולציה התא, החדרת תרופות, תא גזע ותרבות, הנדסת רקמות פיגומים. למעשה, הניסויים הקליניים נמצאים בשלבי ביצוע, שבו איים הם הגלום microbeads אש"ף אלגינט מצופה כטיפול בסוכרת מסוג אני. עם זאת, מספר רב של איים נדרשים עבור יעילות עקב השתלת הישרדות העניים הבא. היכולת מקומית לעורר היווצרות רשת כלי הדם סביב התאים כמוס עלול להגביר יכולת הקיום שלהם באמצעות תחבורה משופרת של חמצן, גלוקוז וחומרים מזינים חיוניים אחרים. גידול פיברובלסטים גורם-1 (FGF-1) הוא גורם הגדילה באופן טבעי כי הוא מסוגל לעורר היווצרות כלי דם ולשפר את רמת החמצן ברקמות איסכמי. היעילות של FGF-1 משופר כאשר מועבר sustאופנה ained ולא הממשל גדול בולוס אחד. המהדורה המקומית ארוכת הטווח של גורמי גדילה ממערכות אנקפסולציה איון יכולה לעודד את הצמיחה של כלי דם ישירות אל התאים המושתלים, פוטנציאל לשיפור התוצאות שוחד תפקודית. במאמר זה, אנו המתאר הליכי ההכנה של אלגינט microspheres לשימוש ביישומים ביו. בנוסף, אנו מתארים את השיטה שפיתחנו ליצירת microbeads אלגינט שכבות. תאים ניתן הגלום הליבה אלגינט פנימית, חלבונים angiogenic בשכבה החיצונית אלגינט. שחרורו של חלבונים מן השכבה החיצונית היתה לעורר את היווצרותם של כלי הדם רשתות מקומיות ישירות לעבר איים המושתלים.
Protocol
הפרוטוקול מתאר כאן תהליך בן שלושה שלבים ליצירת microbeads אלגינט שכבות (איור 1). ראשית, microbeads אלגינט נוצרים (איור 2 א). הליך זה המתואר בסעיף 1 להלן. תאים או חלבונים ניתן להוסיף את microbeads בשלב זה כדי לשמש מערכת המסירה. השלב הבא כולל היווצרות של שכבת permselective על microbeads ועל המתואר בסעיף 2. השלב האחרון כולל את היווצרות שכבת אלגינט נוסף המתואר בסעיף 3. צורות השכבה על החלק החיצוני של פני השטח של החרוזים (איור 2 ב) ניתן לתמצת ולספק המולקולות הפעילות מבחינה רפואית (איור 2 ג) לכוון בתגובה הסלולר השתלת המערכת הבאה.
1. Microbead אלגינט הכנה
- הכן פתרון 1.5% (W / V) LVM אלגינט ידי המסת 15 גרם אלגינט LVM ב 1 מ"ל שלהשכבה הפנימית פתרון אלגינט (25 mM HEPES חיץ, 118 mM NaCl, KCl mM 5.6, ו 2.5 מ"מ MgCl 2 במים DI, מותאם pH 7.4). מערבבים על Vortexer עד הכוח אלגינט נמס לחלוטין כדי ליצור פתרון ברור, צמיגה. הערה: פרוטוקול זה מתאר תנאים אופטימליים אנקפסולציה איון בתוך microcapsules אלגינט 1 ריכוז והרכב של אלגינט microspheres ניתן לשנות לכוון המאפיינים של יישומים אחרים (למשל, אספקת סמים, הנדסת רקמות, וכו ') הערה: אנקפסולציה איון איים ניתן להוסיף פתרון אלגינט בשלב זה לפני טעינה microencapsulator.
- מכינים את הפתרון crosslinking (22 מ"מ CaCl 2 במים DI) על ידי המסת 100 מ"מ CaCl 2 ו - 10 mM HEPES חיץ במים DI והתאמה pH 7.4. הערה: divalent קטיונים אחרים כגון Br 2 +, Sr 2 + וכו 'יכול לשמש במקום Ca 2 +, בהתאם לאופי של gelation אלגינט דesired.
- הגדרת שני ערוצים אלגינט אוויר microencapsulator מעיל ידי הוספת מחט 25-מד אל המזרק, ולהתאים את שסתומים בכל צד כדי לוודא שהמחט נמצאת במרכז מעיל האוויר. מחטים מד שונים יכולים לשמש בשלב זה, בהתאם לגודל של microbeads אלגינט ממוקדות.
שלב זה יכול להתבצע בעזרת מזרק, microencapsulator לא צריך להיות זמין. מוסיפים את הפתרון אלגינט אל המזרק, ובחר מחט מד מבוססת על גודל של microbeads הרצויות. - הניחו בקבוק המכיל 10 מ"ל של תמיסת crosslinking ישירות מתחת למחט. מניחים פס ומערבבים בתמיסה.
- מזריקים טיפות ישירות לתוך פתרון 2 CaCl כדי crosslink אלגינט כדי ליצור microbeads. דגירה החרוזים בתמיסה crosslinking לרפא לפחות רבע שעה, עם ערבוב רצוף.
- להעביר את החרוזים לצינור צנטריפוגות 15 מ"ל. הסר את הפתרון שיורית,ולבצע שלושה שוטף עם 2 CaCl 0.2% ב תמיסת מלח רגיל במשך שתי דקות כל אחד.
2. ציפוי microbeads עם פולי-L-ornithine
- הכן 3 מ"ל של תמיסת 0.1% (W / V) של פולי-L-ornithine (אש"ף) ב מלוחים נורמלי. מניחים את פתרון מערבולת עד שהוא נמס לגמרי, יוצרים פתרון ברור. פולי-L-ליזין (PLL) יכול לשמש במקום אש"ף של שלב זה, שתוצאתה רמות דומות של permselectivity.
- להעביר את microbeads אלגינט בפתרון אש"ף. מניחים על וורטקס במשך 30 דקות כדי לאפשר זמן מספיק אש"ף לתקשר עם אלגינט, ויצרו מתחם polycation-polyanion. בתום 30 דקות, צריך להיות ציפוי לבן נראה בבירור סביב microbeads אלגינט.
- הסר את הפתרון אש"ף, ולבצע שלושה שוטף עם 2 CaCl 0.2% בשנת מלוחים רגיל במשך שתי דקות כל אחד.
3. יצירת אלגינט החיצונית הנחאה
- הכן פתרון אלגינט ריכוז הרצוי כי יש להשתמש כדי ליצור את השכבה החיצונית. פתרון מוכן כמתואר (1.1) לעיל. הגודל של השכבה החיצונית מושפעת הרכב וריכוז אלגינט שימוש (איור 3).
- להעביר את microbeads אלגינט כדי מסננת תאים. השתמש Kimwipe לספוג פתרון העולה כדי לייבש את microbeads ככל האפשר.
- להעביר את microbeads אל פני השטח Parafilm. משטחים חלקים אחרים כגון זכוכית או אפילו צלחת פטרי פלסטיק יכול להיות תחליף Parafilm, אם תרצה בכך.
- מעבירים את הפתרון אלגינט ערוכים (3.1) על גבי microbeads אלגינט. היקף הפתרון אלגינט להיות צריך לכסות לחלוטין את microbeads אלגינט. בואו microbeads נשארים בתמיסה אלגינט במשך 45 דקות.
- השתמש פיפטה כדי להסיר את הפתרון אלגינט עודף לא חייב את microbeads.
- להעביר את microbeads בלפתרון של CaCl 22 מ"מ 2. זה crosslinks פתרון אלגינט סביב microbeads, וכתוצאה מכך היווצרות של שכבת אלגינט ברורה החיצונית.
- ביצוע שוטף שלושה מ"מ 22 CaCl 2 ב מלח רגיל במשך שתי דקות כל אחד. הצגת microbeads תחת מיקרוסקופ צריך לאפשר שכבת אלגינט ברורה החיצוני להיראות שנוצר סביב microbead הליבה.
4. נציג תוצאות
באיור 1. סכמטי של הליך ליצירת microbeads אלגינט שכבות. בתמונות באישור קאנה et al. J ביומד מאטר מיל א 'נובמבר 95 (2), 632-40 (2010).
איור 2 (א) ו - (ב) הם בניגוד שלב תמונות של microbeads אלגינט. (א) מראה microbeadלאחר שלב הסינתזה (1.7), ואילו (ב ') מציג שכבה ברורה אלגינט החיצוני הנוכחי לאחר השלמת שלב (3.7). (ג) היא תמונה FITC של החלבון BSA fluorescently שכותרתו הגלום השכבה החיצונית. בתמונות באישור קאנה et al. J ביומד מאטר מיל א 'נובמבר 95 (2), 632-40 (2010).
איור 3. גודל של השכבה החיצונית אלגינט יכולים להיות מגוונים על בסיס ההרכב ואת הריכוז של אלגינט בשימוש. התוצאות שלנו מראות את זה, הן LVM ו אלגינט LVG, גודל השכבה החיצונית עולה עם הגדלת ריכוז אלגינט, וכי אלגינט LVG מניב השכבות החיצוניות עבות יותר מאשר אלגינט LVM בריכוזים שווים. בתמונות באישור קאנה et al. J ביומד מאטר מיל א 'נובמבר 95 (2), 632-40 (2010).
איור 4. שחרור של FGF-1, צמיחה angiogenic גורם חלבון, מהשכבה החיצונית השתנתה אלגינט מבוסס על ריכוז של LVM ו אלגינט LVG בשימוש. (א) ו - (ב) אחוז שחרור הופעה, ו (ג) ו - (ד ') לציון שחרור המוני המקביל FGF-1 לעומת הזמן ניסוחים שונים השכבה החיצונית. יש לשחרר פרץ הציג את כל התנאים בתוך הראשונית 5 שעות (A ו-C), במינון נמוך שחרור מתמשך של עד 30 יום (B ו-D). בתמונות באישור קאנה et al. J ביומד מאטר מיל א 'נובמבר;. 95 (2), 632-40 (2010) לחץ כאן כדי להציג דמות גדולה .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
אלגינט הוא פוליסכריד טבעי, המופק מאצות חומצי והוא מורכב יחידות 1,4 '-β-D-mannuronic חומצה (M) ו α-L-guluronic חומצה (G) 2,3. Gelation פשוט מתרחשת כאשר קטיונים divalent, כגון Ca 2 +, Sr 2 +, או Ba 2 + אינטראקציה עם ה-G-מונומרים יוצרים גשרים יוניים בין רשתות אלגינט סמוכים. Microbeads של אלגינט כבר נוצלו כדי לספק מגוון של חלבונים, כולל גידול פיברובלסטים גורם-1 (FGF-1), גורם הגדילה העצבי, גורם מעכב לוקמיה, גידול כלי דם גורם אנדותל (VEGF), ו - אנקפסולציה של תאים, כולל chondrocytes hepatocytes וכן איים. יתרונות השימוש במערכת כה microparticle פולימר כוללים את ההגנה של חלבונים ותאים של השפלה התגובה נפח, גוף חלקיק קטן המאפשר ניהול קל באמצעות זריקה, ושליטה של דיפוזיה המומס על ידי מניפולציה של התכונות הפיסיקליות של החומר.
אלגינט microspheres מצופה בשכבת הפולימר permselective כרגע בניסויים קליניים לטיפול בסוכרת סוג אני. עם זאת, יכולת הקיום ארוכת הטווח של איים כמוס המושתלים תלויה, בין היתר, על יכולתה לרכוש חמצן וחומרים מזינים מאספקת הדם בכלי הדם. מערכת ביולוגי אשר יכול לשמש בעת ובעונה אחת כמערכת אנקפסולציה על איים, כמו גם מערכת המסירה מתמשכת של חלבונים angiogenic עשוי להמריץ את הצמיחה של כלי הדם סביב התאים המושתלים, וכתוצאה מכך הכדאיות שתל משופרת. Neovascularization מתמיד דורש שחרור מתמשך של FGF-1 ולא הממשל בולוס אחד. במאמר זה יופיטר, אנו מציגים גישה ליצירת microbeads אלגינט שכבות (איור 1). השכבה החיצונית ניתן להשתמש לשחרור אנקפסולציה ומתמשכת של FGF-1, בעוד השכבה הפנימית ניתן להשתמש immunoisolation של השתלות איון (איור 2
המעבדה שלנו הוכיח בעבר כי משלוח מתמשך של FGF-1 ולא הממשל גבוהה של בולוס, תוצאות חלבון בתגובה רשת מתמשך כלי הדם 4-6. המערכת המתוארת כאן יכול לשמש ליצירת השכבה החיצונית למסירה של חלבונים angiogenic, כגון FGF-1 (איור 2). הגודל של השכבה החיצונית יכולים להיות מגוונים על בסיס ההרכב ואת הריכוז של אלגינט שימוש (איור 3). גודל השכבה החיצונית יכולה לשחק תפקיד חשוב בהצלחה של המערכות. המאפיינים של השכבה החיצונית יכולה להשפיע על שחרורו של המולקולות הפעילות מבחינה רפואית לתוך הרקמה שמסביב הובלה של חומרים מזינים ומולקולות אותות אלה התאים אלגינט הפנימית. מאפייני השכבה החיצונית צריך להיות מותאם עבור יישום נתון. עבור משלוח של FGF-1, לשחרר מתמשכת ניתן להשיג עד 30 ימים בהתאם לטופס אלגינטulation (איור 4) 7, 8.
ניסויים קליניים באמצעות איים הגלום microcapsules אלגינט הראו כמה ההבטחה לטיפול בסוכרת מסוג אני. עם זאת, מספר רב של איים נדרשים ליעילות בגלל הישרדות עניים לאחר ההשתלה. היכולת לתמצת איים ב microcapsules multilayer שבו החלבון angiogenic משוחרר השכבה החיצונית עשויה לשפר את יכולת הקיום של איים המושתלים. זה שיפור הכדאיות יכול לצמצם את מספר איים הנדרשים לטיפול, להגדיל את ההשפעה הקלינית זמינות פוטנציאל של טיפולים אלה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
אין ניגוד עניינים הצהיר.
Acknowledgments
מחקר זה נתמך על ידי משרד החוץ האמריקני לענייני יוצאי צבא (וושינגטון), מענקים 0852048, 0731201, 0854430 ו מן הקרן הלאומית למדע (Arlington, VA), וכן מענק RO1 DK080897 מן המכון הלאומי לבריאות (Bethesda, MD) . מר קאנה קיבל תמיכה תרומה נדיבה של מר אדוארד רוס וד"ר מוניקה מויה מן ביל ומלינדה גייטס (סיאטל, וושינגטון).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Pronova Ultrapure LVG alginate | Nova-Matrix | 4200006 | A variety of alginate formulations are available. The choice of alginate influences the end properties of the microbeads, including size, mechanical properties, and transport. The composition used should be optimized for a given application. |
| Pronova Ultrapure LVM alginate | Nova-Matrix | 4200206 | A variety of alginate formulations are available. The choice of alginate influences the end properties of the microbeads, including size, mechanical properties, and transport. The composition used should be optimized for a given application. |
| Poly-L-ornithine hydrochloride | Sigma-Aldrich | P2533 |
References
- Darrabie, M. D., Kendall, W. F., Opara, E. C. Characteristics of Poly-L- Ornithine-coated alginate microcapsules. Biomaterials. 26, 6846-6852 (2005).
- Yamagiwa, K., Kozawa, T., Ohkawa, A. Effects of alginate composition and gelling conditions on diffusional and mechanical properties of calcium-alginate gel beads. J. Chem. Eng. Jpn. 28, 462-467 (1995).
- Amsden, B., Turner, N. Diffusion characteristics of calcium alginate gels. Biotechnol. Bioeng. 65, 605-610 (1999).
- Uriel, S., Brey, E. M., Greisler, H. P. Sustained low levels of fibroblast growth factor-1 promote persistent microvascular network formation. Am. J. Surg. 192, 604-609 (2006).
- Moya, M. L., Lucas, S., Francis-Sedlak, M., Liu, X., Garfinkel, M. R., Huang, J. J., Cheng, M. H., Opara, E. C., Brey, E. M. Sustained delivery of FGF-1 increases vascular density in comparison to bolus administration. Microvasc. Res. 78, 142-147 (2009).
- Moya, M. L., Cheng, M. H., Huang, J. J., Francis-Sedlak, M. E., Kao, S. W., Opara, E. C., Brey, E. M. The effect of FGF-1 loaded alginate microbeads on neovascularization and adipogenesis in a vascular pedicle model of adipose tissue engineering. Biomaterials. 31, 2816-2826 (2010).
- Khanna, O., Moya, M. L., Greisler, H. P., Opara, E. C., Brey, E. M. Multilayered Microcapsules for the Sustained-Release of Angiogenic Proteins From Encapsulated Cells. Am. J. Surg. 200, 655-658 (2010).
- Khanna, O., Moya, M. L., Opara, E. C., Brey, E. M. Synthesis of multilayered alginate microcapsules for the sustained-release of fibroblast growth factor-1. J. Biomed. Mater. Res. A. 95, 632-640 (2010).
