Summary
다음 섹션에서 우리는 생명 의학 애플 리케이션에서 사용할 수 알지네이트요 microspheres의 준비 절차를 설명합니다. 우리는 특히 1 형 당뇨병에 대한 잠재적인 치료로서 세포 및 단백질 캡슐의 이중 목적 multilayered 알지네이트요 microspheres를 만들기위한 기술을 설명합니다.
Abstract
알긴산 기반의 자료가 있기 때문에 그들의 친수성 자연, biocompatibility, 물리적 아키텍처 생명 의학 애플 리케이션에 상당한 주목을 받았습니다. 응용 프로그램은 세포 캡슐, 약물 전달, 줄기 세포 배양 및 조직 엔지니어링 공사장 공중 발판을 포함합니다. 실제로 임상 시험은 현재 islets는 유형 I 당뇨병의 치료로서 PLO 코팅 알지네이트요의 microbeads에 캡슐되는 수행되고있다. 그러나, islets 많은 수의는 가난한 생존 다음의 이식에 의한 효능 필요합니다. 로컬 캡슐 세포 주위 microvascular 네트워크 형성을 자극하는 능력은 산소, 포도당 및 기타 필수 영양소 개선된 교통 수단을 통해 그들의 생존을 증가시킬 수 있습니다. Fibroblast 성장 인자-1 (FGF-1)은 혈관 형성을 자극하고 허혈성 조직의 산소 수준을 향상시킬 수 자연스럽게 발생하는 성장 인자이다. 그것이 sust으로 전달되었을 때 FGF-1의 효능이 향상됩니다오히려 하나의 대형 bolus 행정부보다 ained 패션. 섬 캡슐 시스템의 성장 요인의 지역 장기 릴리스는 잠재적으로 기능성 그래프트 결과를 개선, 이식된 세포를 향해 직접적으로 혈관의 성장을 자극 수 있습니다. 이 문서에서 우리는 생명 의학 애플 리케이션에서 사용할 수 알지네이트요 microspheres의 준비 절차를 설명합니다. 또한, 우리는 multilayered 알지네이트요의 microbeads를 생성용으로 개발된 방법을 설명합니다. 세포는 외부 알지네이트요 계층의 내부 알지네이트요 코어, 그리고 angiogenic 단백질에 캡슐 수 있습니다. 이 외부 레이어에서 단백질의 릴리스는 이식된 islets 향해 직접 현지 microvascular 네트워크의 형성을 자극합니다.
Protocol
여기서 프로토콜 multilayered 알지네이트요의 microbeads (그림 1)을 생성하는 3 단계 절차를 설명합니다. 첫째, 알지네이트요의 microbeads은 (그림 2A) 형성됩니다. 이 절차는 아래 섹션 1에 설명되어 있습니다. 세포 또는 단백질이 전달 시스템의 역할을하기 위해이 단계에서 microbeads에 추가할 수 있습니다. 다음 단계는 microbeads에 permselective 레이어의 형성을 포함하고 섹션 2에 설명되어 있습니다. 마지막 단계는 추가 알지네이트요 계층의 형성을 포함하며 제 3에 설명되어 있습니다. 구슬의 표면 (그림 2B)의 외부에이 레이어 형태는 시스템에 다음과 이식에 대한 세포 반응을 지시하는 치료 분자를 (그림 2C) 캡슐 및 전달하는 데 사용할 수 있습니다.
1. 알긴산의 Microbead 준비
- 1 ML에서 LVM의 알지네이트요의 15 그램을 해소하여 1.5 % (W / V) LVM의 알지네이트요 솔루션을 준비내부 레이어 알지네이트요 솔루션 (산도 7.4로 조정 DI 워터에서 25 밀리미터 HEPES 버퍼, 118 MM NaCl, 5.6 MM KCl, 및 2.5 밀리미터 MgCl 2). 알지네이트요 전원이 완전히 투명, 점성 용액을 형성 해산 때까지 Vortexer에 섞는다. 참고 :이 프로토콜은 알지네이트요의 microcapsules 이내 섬 캡슐을위한 최적의 조건을 설명 한 농도와 알지네이트요 microspheres의 성분이 다른 응용 프로그램 (예, 약물 전달, 조직 공학 등)주의에 대한 속성을 조정 변경될 수 있습니다. 섬 캡슐 들어 islets 이전 microencapsulator에 로딩이 단계에서 알지네이트요 솔루션에 추가할 수 있습니다.
- 100 MM CaCl 2 및 DI 워터에서 10 밀리미터 HEPES 버퍼를 용해하고 pH를 7.4로 조정하여 crosslinking 솔루션 (DI 워터 22 MM CaCl 2)를 준비합니다. 참고 사항 : BR이 같은 다른 이가의 양이온은 +, 시니어 2 + 등 + 알지네이트요 겔화 D의 특성에 따라 대신 칼슘 2 사용될 수esired.
- 주사기에 25 게이지 바늘을 추가하고, 바늘이 공기 재킷의 중심에 있는지 확인하기 위해 양옆의 밸브를 조절하여 2 채널 에어 자켓 알지네이트요의 microencapsulator를 설정합니다. 다른 게이지 바늘이 대상 알지네이트요의 microbeads의 크기에 따라이 단계에 사용될 수 있습니다.
이 단계도 주사기로 수행할 수 microencapsulator를 사용할 수 없습니다. 주사기로 알지네이트요 솔루션을 추가하고 원하는 microbeads의 크기에 따라 바늘 게이지를 선택합니다. - 직접 바늘 아래 crosslinking 솔루션의 10 ML이 들어있는 플라스크를 놓습니다. 솔루션 볶음 막대를 놓습니다.
- microbeads를 형성 알지네이트요를 crosslink하기 위해 CaCl 2 용액에 직접 방울을 주입. 계속 저어으로, 적어도 15 분간 치료 crosslinking 솔루션의 구슬을 품어.
- 15 ML의 원심 관에 비즈를 전송합니다. , 잔류 용액을 제거두 분마다 정상 생리 식염수에 0.2 % CaCl의이 세 가지 세차장을 수행합니다.
2. 폴리-L-ornithine과 코팅 Microbeads를
- 정상 식염수에있는 폴리-L-ornithine (PLO)의 0.1 % (W / V) 솔루션 3 ML을 준비합니다. 그것이 완전히 명확한 솔루션을 형성 해산되기 전까지 와동에 솔루션을 놓습니다. 폴리-L-라이신 (PLL)는 permselectivity 비슷한 수준의 결과를이 단계를 위해 대신 PLO에 사용될 수 있습니다.
- PLO 솔루션으로 알지네이트요의 microbeads를 전송합니다. PLO 충분한 시간이 polycation-polyanion 복합을 형성 알지네이트요과 상호 작용할 수 있도록 30 분 소용돌이에 장소. 30 분 말에, 알지네이트요 microbeads의 주위에 분명히 보이는 흰색 코팅도 있어야합니다.
- PLO 솔루션을 제거 두 분마다 정상 식염수에 0.2 % CaCl의이 세 가지 세차장을 수행합니다.
3. 바깥 알긴산을 만드는 것은 때려치어
- 외부 레이어를 만드는 데 사용되어야하는 원하는 농도 알지네이트요 솔루션을 준비합니다. (1.1) 상기에 설명된대로 솔루션은 준비가되어 있습니다. 외부 레이어의 크기는 (그림 3) 사용 알지네이트요의 조성과 농도에 의해 영향을받습니다.
- 셀 - 스트레이너로 알지네이트요의 microbeads를 전송합니다. microbeads 가능한 건조하기 위해 여분의 용액을 흡수할 수 있도록 Kimwipe을 사용합니다.
- Parafilm 표면에 microbeads를 전송합니다. 원하는 경우 이러한 유리 또는 플라스틱 배양 접시와 같은 다른 부드러운 표면은 Parafilm에 대한 대체하실 수 있습니다.
- 알지네이트요의 microbeads에 (3.1)에서 준비 알지네이트요 솔루션을 전송합니다. 알지네이트요 솔루션의 볼륨이 완전히 알지네이트요의 microbeads를 충당해야한다. microbeads 45 분 알지네이트요 솔루션 유지합시다.
- microbeads에 바인딩되지 과잉 알지네이트요 솔루션을 제거하는 피펫을 사용합니다.
- 에 microbeads를 전송22mM CaCl 2 용액 있습니다. 이것은 별개의 외부 알지네이트요 계층의 형성 그 결과 microbeads 주위 알지네이트요 솔루션을 crosslinks.
- 이분 각각 정상 식염수에 CaCl 2 22 밀리미터 든 세 세차장을 수행합니다. 현미경 microbeads을 관찰 하는게 핵심 microbead 주위에 형성된 볼 수있는 뚜렷한 외부 알지네이트요 층 수 있도록해야합니다.
4. 대표 결과
그림 1. multilayered 알지네이트요의 microbeads를 만드는 절차의 개략도. Khanna 외로부터 허가를 재현. J Biomed Mater 해상도 A. 11월, 95 (2), 632-40 (2010).
그림 2. ()와 (B)의 알지네이트요 microbeads의 위상 콘트라스트 이미지입니다. () microbead을 보여줍니다이후 합성 단계 (1.7), (B) 단계 (3.7)을 마친 후 현재 뚜렷한 외부 알지네이트요 레이어를 표시하면서. (C) 외부 계층에 캡슐 fluorescently-라벨 BSA 단백질의 FITC 이미지입니다. Khanna 외로부터 허가를 재현. J Biomed Mater 해상도 A. 11월, 95 (2), 632-40 (2010).
그림 3. 외부 알지네이트요 레이어의 크기는 사용 알지네이트요의 조성과 농도를 기반으로 다양한 수 있습니다. 우리의 결과는 LVM과 LVG의 알지네이트요 모두를 위해 증가 알지네이트요 농도와 외부 레이어의 크기 증가, 그 LVG 알지네이트요가 동일 농도에서 LVM의 알지네이트요보다 두꺼운 아우터 레이어를 얻을, 것을 보여줍니다. Khanna 외로부터 허가를 재현. J Biomed Mater 해상도 A. 11월, 95 (2), 632-40 (2010).
그림 4. FGF-1의 출시, LVM 및 LVG의 알지네이트요 사용의 농도를 기반으로 다양한 외부 알지네이트요 계층에서 angiogenic 성장 인자 단백질. (A)와 (B) 쇼 퍼센트 릴리스, 그리고 (C)와 (D) 다른 외부 레이어 공법 시간 대 FGF-1의 해당 대량 릴리스를 나타냅니다. 버스트 초기 5 H (A와 C) 이내에 모든 조건을 위해 전시 발표하고, 최대 30 일 대한 낮은 선량 연속 릴리스 (B와 D)이 있습니다. Khanna 외로부터 허가를 재현. J Biomed Mater 해상도 A. 11월;. 95 (2), 632-40 (2010) 큰 그림을 보려면 여기를 누르십시오 .
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Discussion
알긴산은 해조류에서 추출 및 1,4 '-β-D-mannuronic 산 (M)와 α-L-guluronic 산성 (G) 2,3 단위로 구성되어 자연, 산성 다당류이다. 단순 겔화가 발생했을 때 같은 칼슘이 같은 이가의 양이온, +, 시니어 2 +, 또는 바 2 + 인접 알지네이트요 체인 사이의 이온 가교를 형성 G-단량체와 상호 작용. 알지네이트요의 Microbeads은 chondrocytes, hepatocytes를 포함한 fibroblast의 성장 인자-1 (FGF-1), 신경 성장 인자, 백혈병 억제 인자, 혈관 내피 성장 인자 (VEGF), 그리고 세포의 캡슐에 대한 포함하여 단백질의 여러 가지를 전달하기 위해 활용되었습니다 그리고 islets. 이러한 microparticle 폴리머 시스템을 사용하는 장점은 주사를 통해 쉽게 관리할 수 있도록 몸, 작은 입자 량의 단백질과 저하 및 반응으로부터 세포를 보호하고, 재료의 물리적 특성 조작에 의한 용질 확산 통제를 포함합니다.
permselective 고분자 층과 알긴산 microspheres의 코팅 형 제가 당뇨병 치료를위한 임상 실험에 있습니다. 그러나 이식된 캡슐 islets의 장기적인 생존 능력은 혈관 혈액 공급으로부터 산소와 영양분을 습득하는 기능에 부분적으로 의존한다. islets위한 캡슐 시스템뿐만 아니라 angiogenic 단백질에 대한 지속적인 배달 시스템으로 동시에 제공할 수 biomaterial 시스템은 향상된 그래프트 생존 그 결과 이식된 세포 주위에 혈관 성장을 자극 수 있습니다. 영구 neovascularization 오히려 단일 bolus 행정보다 FGF-1의 지속적인 릴리스가 필요합니다. 이 주피터 기사에서 우리는 multilayered 알지네이트요의 microbeads (그림 1)을 생성하기위한 접근법을 제시. 내부 레이어가 섬 이식의 immunoisolation에 사용될 수있는 반면 외부 계층은 (그림 2 FGF-1 캡슐과 지속적인 릴리스에 사용할 수
우리 연구실은 이전에 보여 주신 그 대신 영구 microvascular 네트워크 응답 4-6의 단백질, 결과의 높은 bolus 관리보다 FGF-1의 지속적인 전달. 여기에 설명된 시스템 등 FGF-1 (그림 2)와 같은 angiogenic 단백질의 전달을위한 외부 계층을 생성하는 데 사용할 수 있습니다. 외부 레이어의 크기는 (그림 3) 사용 알지네이트요의 조성과 농도를 기반으로 다양한 수 있습니다. 이 외부 레이어의 크기는 시스템의 성공에 중요한 역할을 수 있습니다. 외부 레이어의 속성은 주변 조직으로 치료 분자의 출시와 내부 알지네이트요의 세포에 영양분과 신호 전달 분자의 수송 모두에 영향을 미칠 수 있습니다. 외부 레이어 속성은 주어진 애플 리케이션을 위해 최적화해야합니다. FGF-1의 전송의 경우 지속적인 릴리스는 알지네이트요 양식에 따라 30 일 이내에 최대 달성될 수있다ulation (그림 4) 7, 8.
알지네이트요의 microcapsules에 캡슐 islets을 사용하는 임상 시험은 유형 I 당뇨병에 대한 치료로서 몇 가지 약속을 보여주었다. 이식을 따라 가난한 사람의 생존하지만, islets 많은 수의는 효험이 필요합니다. angiogenic 단백질은 바깥 레이어에서 발표되는 다층 microcapsules의 islets을 캡슐하는 능력은 이식된 islets의 생존을 향상시킬 수 있습니다. 이 향상된 생존 능력이 치료법의 잠재적인 임상적 영향 및 가용성을 증가, 치료에 필요한 islets의 수를 줄일 수 있습니다.
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Disclosures
관심의 어떠한 충돌 선언 없습니다.
Acknowledgments
이 연구는 국립 보건원에서 미국 재향 군인의 실무 계열 (워싱턴 DC), 보조금 0,852,048, 0,731,201 및 0,854,430 국립 과학 재단 (알링턴, VA)에서, 그리고 부여 RO1 DK080897 (베데스다, 메릴랜드)에 의해 지원되었다 . 씨는 Khanna는 빌 & 멜린다 게이츠 재단 (시애틀, WA)에서 에드워드 로스 박사 모니카 모야하여 관대한 기부로부터 지원을 받았습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Pronova Ultrapure LVG alginate | Nova-Matrix | 4200006 | A variety of alginate formulations are available. The choice of alginate influences the end properties of the microbeads, including size, mechanical properties, and transport. The composition used should be optimized for a given application. |
| Pronova Ultrapure LVM alginate | Nova-Matrix | 4200206 | A variety of alginate formulations are available. The choice of alginate influences the end properties of the microbeads, including size, mechanical properties, and transport. The composition used should be optimized for a given application. |
| Poly-L-ornithine hydrochloride | Sigma-Aldrich | P2533 |
References
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