Summary
在下面的章节中，我们概括为海藻酸钠微球在生物医学应用的准备程序。我们特意说明了创建多层海藻酸钠微球作为潜在的治疗1型糖尿病的细胞和蛋白质封装的双重目的的技术。
Abstract
海藻酸钠基材料已收到相当重视医学领域的应用，由于其亲水性，生物相容性和物理结构。应用范围包括细胞封装，药物输送，干细胞培养，组织工程支架。事实上，目前正在临床试验中的小岛是封装在巴解组织涂层海藻酸钠微球作为I型糖尿病的治疗进行。然而，需要大量的胰岛由于穷人生存以下移植的疗效。局部刺激包裹细胞周围的微血管网络形成的能力，通过改善运输氧气，葡萄糖和其他重要的营养物质，可能会增加其可行性。成纤维细胞生长因子（FGF-1）是一种自然产生的生长因子是能刺激血管形成，改善缺血组织中的氧含量。 FGF-1的疗效SUST交付时，它是在增强ained时尚，而不是单一的大丸的管理。当地长期从胰岛封装系统的生长因子的释放，可以直接刺激血管的生长，对移植的细胞，有可能改善功能移植结果。在这篇文章中，我们概括为海藻酸钠微球在生物医学应用的准备程序。此外，我们描述的方法，我们生成多层海藻酸钠微球的发展。细胞可以被封装在海藻酸钠的内在核心，在血管生成的蛋白质外海藻酸钠层。从这个外层蛋白的释放会直接刺激当地的微血管网络的形成，对胰岛移植。
Protocol
这里的协议描述为三个步骤，生成多层海藻酸钠微球（ 图1）。首先，海藻酸钠微球的形成（ 图2A）。此过程在下面的第1。细胞或蛋白质可以被添加到这一步的微球，以作为交付系统。下一步涉及到的微珠上permselective层的形成，并在第2条所述。最后一步涉及额外海藻酸钠层的形成，并在第3条所述。可用于外表面的珠子（ 图2B）这层形式封装，并提供治疗性分子（ 图2C）指挥系统移植后的细胞反应。
1。海藻酸钠微珠制备
- 准备LVM的海藻酸钠15克溶解在1 mL的1.5％（W / V）LVM海藻酸钠溶液内层海藻酸钠溶液（25毫米HEPES缓冲液，118毫米氯化钠，氯化钾5.6毫米，2.5毫米MgCl 2的离子水，调整pH值至7.4）。上Vortexer混合海藻酸钠电源，直到完全溶解，形成一个明确的，粘性的解决方案。注：此协议描述海藻酸钠微胶囊内胰岛封装的最佳条件1的浓度和海藻酸钠微球的组成可以改变属性调整为其他应用程序（如药物释放，组织工程等）注：对于胰岛封装胰岛可以添加到海藻酸钠溶液在此之前装载在microencapsulator的一步。
- 准备交联解决方案（22毫米氯化钙2 DI水）溶解CaCl 2和100毫米10毫米肝素钠DI水的缓冲和调整pH值至7.4。注：其他二价阳离子，如BR 2 +和Sr 2 +等可以用来代替的Ca 2 +，海藻酸钠凝胶d的性质取决于esired。
- 增加了25号针头注射器，并调整每一侧的阀门，以确保针在空气夹克中心成立的双通道空夹克海藻酸钠microencapsulator。这一步可用于不同的表针，针对性的海藻酸钠微球的大小而定。
这一步也可以用注射器进行，应microencapsulator无法使用。加入海藻酸钠溶液的注射器，和选择的基础上，所需的微球大小的针距。 - 放置一个含有10毫升的交联解决方案，直接下针的烧瓶。溶液中放置一个搅拌棒。
- 以交联海藻酸钠形成微珠直接注入氯化钙溶液液滴。孵育治愈至少15分钟，不断搅拌，在交联解决方案的珠子。
- 珠转移到15 mL离心管。去除残留的解决方案，执行0.2％氯化钙生理盐水2，每两分钟清洗。
2。与聚-L-鸟氨酸涂层的微球
- 准备3毫升生理盐水的0.1％（W / V）聚-L-鸟氨酸（巴解组织）解决方案。放置在一个旋涡的解决方案，直到完全溶解，形成了一个明确的解决方案。聚-L-赖氨酸（PLL），可以用来代替这一步，在水平相近的渗透性巴解组织。
- 海藻酸钠微球转移到巴解组织解决方案。广场上的30分钟允许巴解组织足够的时间，与海藻酸钠交互，形成了阳离子，阴离子复杂的旋涡。在30分钟结束时，应该有一个明显可见的海藻酸钠微球周围的白色涂料。
- 删除巴解组织解决方案，并执行0.2％的氯化钙生理盐水2，每两分钟清洗。
3。创建外海藻酸钠莱呃
- 准备所需的浓度，是被用来创建外层的海藻酸钠溶液。准备（1.1）以上所述的解决方案。外层的大小是由海藻酸钠的组成和使用（ 图3）浓度的影响。
- 海藻酸钠微球转移到细胞的过滤。使用Kimwipe吸收多余的解决方案，以便尽可能干微珠。
- 微球转移到石蜡膜表面。其他光滑的表面，如玻璃或塑料培养皿可以代替石蜡膜，如果需要的话。
- 转移到海藻酸钠微球制备海藻酸钠溶液（3.1）。海藻酸钠溶液的体积应完全覆盖海藻酸钠微球。让微珠保持在45分钟的海藻酸钠溶液。
- 使用吸管，去除多余的海藻酸钠溶液没有必然的微珠。
- 在转移的微球到22MM 氯化钙溶液。交联海藻酸钠溶液，微珠周围形成不同外海藻酸钠层。
- 执行与22毫米氯化钙生理盐水，每两分钟清洗。在显微镜下看的微球，应该允许为不同的的外海藻酸钠层看到周围形成核心微珠。
4。代表结果
图1为建立多层次的海藻酸钠微球的过程的示意图。从卡纳等人许可，复制。生物医学0884-2914 1.539答：十一月95（2），632-40（2010）。
图2（A）和（B）是海藻酸钠微球的相衬图像。 （a）显示了微珠后合成步骤（1.7），（二）显示了明显的步骤（3.7）完成后外海藻酸钠层。 （C）是一种荧光标记的牛血清白蛋白封装在外层蛋白FITC标记的图像。从卡纳等人许可，复制。生物医学0884-2914 1.539答：十一月95（2），632-40（2010）。
图3。外海藻酸钠层的大小可以改变的基础上使用海藻酸钠的组成和浓度。我们的研究结果表明，LVM和LVG海藻酸钠，海藻酸钠浓度的增加，最外层的大小增加，并在同等浓度比LVM的海藻酸钠，LVG海藻酸钠产生较厚的外层。从卡纳等人许可，复制。生物医学0884-2914 1.539答：十一月95（2），632-40（2010）。
图4。推出FGF-1，血管生长因子蛋白变化的基础上LVM和LVG海藻酸钠使用浓度从外部海藻酸钠层。 （A）和（b）显示％释放，和（c）及（D）表示相应的质量与FGF-1的时间不同外层制剂的释放。有一阵释放展出的所有条件，在最初的5小时（A和C），低剂量的长达30天的连续释放（B和D）。从卡纳等人许可，复制。生物医学0884-2914 1.539答：月; 95（2），632-40（2010） 点击此处查看大图 。
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Discussion
海藻酸钠是一种天然，从海藻中提取的酸性多糖和1,4'-β-D-甘露糖醛酸（M）和α-L-古洛糖醛酸（G）的2,3单元组成。简单的凝胶发生时，二价阳离子，如Ca 2 +的Sr 2 +，或BA 2 +形成离子桥相邻海藻酸钠链的G-单体交互。海藻酸钠微球已被用来提供多种蛋白质，其中包括成纤维细胞生长因子（FGF-1），神经生长因子，白血病抑制因子，血管内皮生长因子（VEGF），包括软骨细胞，肝细胞封装小岛。使用这种聚合物微粒系统的优点包括保护身体，易于管理的小颗粒可以通过注射量的蛋白质和细胞退化和反应，操纵材料的物理性质，化学性质，由溶质扩散控制。
海藻酸钠微球与permselective聚合物层涂层是目前在临床试验中用于治疗I型糖尿病。然而，长期生存能力的封装移植胰岛依赖的部分，其收购从血管血液供应氧气和营养物质的能力。移植细胞周围的生物材料系统，可以同时作为胰岛封装系统以及血管生成蛋白质的持续输送系统可能会刺激血管生长，提高移植的可行性。持久性新生血管的需要，而不是一个单一剂量管理FGF-1的缓释。朱庇特的文章在此，我们提出了一个生成多层海藻酸钠微球（ 图1）的方法。外层可用于封装和缓释FGF-1，而内层可用于胰岛移植中免疫（ 图2
我们实验室先前的研究显示，持续交付的FGF-1，而不是一个高蛋白质，结果在一个持久的微血管网络响应4-6丸行政。这里描述的系统可以用来交付血管生成的蛋白质，如FGF-1（ 图2），生成一个外层。外层的大小可以变化的基础上使用（ 图3）海藻酸钠的组成和浓度。这外层的大小，可以在系统的成功发挥了重要作用。外层的属性可能会影响治疗分子释放到周围的组织和运输营养物质和信号分子，细胞内海藻酸钠。外层属性将需要为特定的应用进行了优化。缓释为交付FGF-1，可以实现最多30天，取决于海藻酸钠形式，ulation（ 图4）7，8。
使用海藻酸钠微囊包裹的胰岛细胞的临床试验已显示出一些治疗I型糖尿病的承诺。然而，需要大量的胰岛因为穷人生存移植后的疗效。能力封装在多层微囊在血管新生蛋白质从外层释放胰岛可提高胰岛移植的可行性。这种改进的可行性，可以减少治疗所需的胰岛细胞的数量，增加了潜在的这些疗法的临床影响和可用性。
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Disclosures
没有利益冲突的声明。
Acknowledgments
这项研究是由美国退伍军人事务部（华盛顿），补助0852048，0731201，0854430从国家科学基金会（阿灵顿，弗吉尼亚州），并从国家卫生研究院授予RO1的DK080897（马里兰州贝塞斯达的支持） 。康纳先生收到从来自比尔和梅林达·盖茨基金会（西雅图）先生爱德华·罗斯和莫妮卡莫亚博士的慷慨捐赠支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Pronova Ultrapure LVG alginate | Nova-Matrix | 4200006 | A variety of alginate formulations are available. The choice of alginate influences the end properties of the microbeads, including size, mechanical properties, and transport. The composition used should be optimized for a given application. |
| Pronova Ultrapure LVM alginate | Nova-Matrix | 4200206 | A variety of alginate formulations are available. The choice of alginate influences the end properties of the microbeads, including size, mechanical properties, and transport. The composition used should be optimized for a given application. |
| Poly-L-ornithine hydrochloride | Sigma-Aldrich | P2533 |
References
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